Aumento dos níveis de YKL-40, mas não de proteína C-reativa em pacientes com doença de AlzheimerⅡ

2. Material e Métodos

2.1. Doadores Humanos

Um total de 123 indivíduos foram incluídos neste estudo: (1) idosos não dementes sem qualquer evidência de qualquer doença neurodegenerativa (controles saudáveis) classificados como controles (n=37); (2) MCI devido a pacientes com DA (MCI) (n=22); (3) prováveis ​​pacientes com DA esporádica leve/moderada-grave (n=34); (4) pacientes com DP (n=30). Os participantes do estudo foram inscritos na Clínica de Memória (controles, MCI e indivíduos com DA) e Unidade de Distúrbios do Movimento (participantes com DP) do Hospital Universitario 12 de Octubre (Madrid, Espanha). As características demográficas e clínicas do sujeito estão listadas na Tabela 1.

Todos os participantes foram classificados usando critérios diagnósticos estabelecidos naqueles com DCL ou provável demência da DA [43–45]. O diagnóstico foi baseado em uma avaliação clínica detalhada, avaliação neuropsicológica e neuroimagem (RM). O comprometimento funcional foi medido por meio do escore Clinical Dementia Rating (CDR) [46].

Clique para cistanche tcm para tratar a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer

Os pacientes com DP foram diagnosticados seguindo os critérios de diagnóstico clínico da Movement Disorder Society (MDS) [47] e todos preencheram os critérios para DP clinicamente estabelecida. Os pacientes com DP não referiram queixas cognitivas e não apresentaram sintomas de demência. O grupo controle foi constituído por indivíduos cognitivamente normais com idade igual ou superior a 50 anos, sem sinais clínicos de comprometimento cognitivo e histórico de doenças neurológicas ou psiquiátricas.

Os critérios de exclusão para todos os participantes foram doença cerebrovascular significativa concomitante e evidência de qualquer comorbidade neurológica, psiquiátrica, medicamentosa ou médica não neurológica que pudesse afetar a cognição ou a função motora. A aprovação do estudo foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitario 12 de Octubre, e todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito.

2.2. Amostra de fluido

Coleta As amostras de LCR foram coletadas de todos os indivíduos (incluindo pacientes saudáveis ​​e indivíduos MCI, DA e DP) e processadas de acordo com procedimentos padronizados por punção lombar em tubos de polipropileno estéreis de 15 mL. As amostras foram então centrifugadas a 3000 rpm a 4 ◦C por 10 min. As alíquotas do sobrenadante foram armazenadas a -80 ◦C em tubos criogênicos de polipropileno de 0,5 mL com Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Basel, Suíça).

Amostras de sangue foram obtidas por punção venosa antecubital de pacientes e indivíduos saudáveis. O plasma foi isolado do sangue total coletado em tubos de 7 mL de EDTA-2Na. O sangue total foi centrifugado a 2.000 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram então coletados e aliquotados em tubos criogênicos de polipropileno com Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Basel, Suíça) e armazenados a -80 ◦C.

2.3. Amostras de Tecido

O tecido do córtex orbitofrontal cerebral pós-morte foi obtido de doadores de cérebro diagnosticados com DA e indivíduos controle. As amostras congeladas foram fornecidas pelo Banco de Cérebros do Instituto de Neuropatologia IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge (Hospitalet de Llobregat, Espanha). O consentimento do sujeito foi obtido de acordo com a Declaração de Helsinki, e a aprovação veio do Comitê de Ética em Pesquisa da instituição responsável.

Para todos os casos, o consentimento informado por escrito estava disponível. Os indivíduos foram selecionados com base no diagnóstico pós-morte de DA de acordo com a patologia do emaranhado neurofibrilar e placas A [48]. Os casos de DA apresentaram alteração neuropatológica elevada da DA (estágio V/VI de Braak e pontuação de placa neurítica moderada a frequente). Os participantes de controle foram considerados aqueles com/sem sintomas neurológicos ou um baixo grau de alteração neuropatológica da DA. Um total de 24 amostras foram categorizadas em AD e controles, conforme apresentado na Tabela 2.

2.4. Purificação de DNA e Genotipagem de Apolipoproteína E (APOE)

O DNA genômico foi extraído do sangue periférico usando QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Os polimorfismos humanos APOE C112R e R158C foram detectados para identificar os alelos APOE ε2, ε3 e ε4, usando o LightCycler 480 II Instruments Kit (Roche Diagnostics, Basel, Suíça) seguindo as instruções do fabricante.

2.5. Análise de Proteína

As concentrações no LCR e no plasma dos biomarcadores neuroinflamatórios (YKL-40 e CRP) foram analisadas usando kits ELISA (kit Human Chitinase 3-like 1 Quantikine ELISA (DC3L10), R&D; kit Human CRP Quantikine ELISA (DCRP{ {5}}), R&D) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de proteína cerebral YKL-40 e GFAP também foram examinados por Western blotting. O tecido do córtex orbitofrontal cerebral pós-morte foi obtido de doadores de cérebro diagnosticados com DA e indivíduos controle.

Resumidamente, as amostras do córtex orbitofrontal cerebral humano foram incubadas e homogeneizadas em tampão de lise (tampão Tris/HCl 50 mM, pH 7,4 contendo EDTA 2 mM, Nonidet P-40 a 0,2 por cento, PMSF 1 mM, Protease, and Phosphatase Inhibitor Cocktails; Roche, Basel, Suíça) e centrifugado por 10 min a 14,000 rpm a 4 ◦C. Os sobrenadantes foram recuperados e armazenados a -80 ◦C. O teor de proteína foi determinado pelo método BCA (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). Quantidades iguais de proteína (20 µg para YKL-40 e 5 µg para GFAP) foram misturadas com tampão de amostra Laemmli suplementado com -mercaptoetanol, aquecido a 95 ◦C por 5 min, resolvido por 10% NuPAGE Bis-Tris Gels ( Thermo Fisher Scientific, MA, EUA) e transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, MA, EUA).

Em seguida, as membranas foram bloqueadas e incubadas durante a noite a 4 ◦C com anticorpos primários: um anticorpo monoclonal de coelho anti-YKL-40 recombinante (ab255297, 1:500, Abcam) e um anticorpo monoclonal de camundongo anti-GFAP (G3893, 1 :0000, Sigma Aldrich). As membranas foram então incubadas por 1 h com os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) apropriados (G-21234, 1:5000, Thermo Fisher Scientific, MA, EUA; ab97023, 1:40000, Abcam).

A carga de proteína foi monitorada usando anticorpos monoclonais conjugados com HRP de camundongo contra -tubulina (ab40742, 1:5000, Abcam) para YKL-40 ou contra -actina (A1978, Sigma Aldrich) para detecção de GFAP. Os imunocomplexos foram revelados por um reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL Clarity; Bio-Rad, CA, EUA). A quantificação densitométrica foi realizada com o software Image Studio Lite 5.0 (Li-COR Biosciences, NE, EUA). As bandas de proteína foram normalizadas para controles de carregamento e expressas como uma porcentagem do grupo de controle

2.6. Análise estatística

A análise estatística e os gráficos foram realizados usando o software Stata/IC (Stata 16.1, StataCorp LLC, College Station, TX, EUA) e Prism (GraphPad Software versão 8.00, La Jolla, CA, EUA). Depois de avaliar a normalidade da distribuição, as diferenças nos níveis de YKL-40 e PCR no LCR e no plasma entre os grupos foram analisadas usando o teste não paramétrico de classificação de Kruskal-Wallis. O valor-p para comparações pareadas é exibido com correção de Bonferroni. Um modelo descritivo de regressão linear múltipla foi realizado para contabilizar as variáveis ​​de confusão (idade, sexo e APOE ε4) na análise de associação CSF ​​YKL-40.

As interações das variáveis ​​de confusão com o diagnóstico clínico foram excluídas do modelo (significância para todo o conjunto de interações: p > 0,10). O coeficiente de regressão é exibido como "b". As diferenças na distribuição por sexo, idade dos participantes, idade de início e anos desde o início da doença entre os grupos foram avaliadas com os testes qui-quadrado de Pearson e ANOVA, quando apropriado.

Associações entre biomarcadores e características demográficas foram examinadas com testes de correlação de Pearson, testes t de Student e testes Mann-Whitney U, quando apropriado. Um teste de tendência não paramétrico (Teste de tendência de Jonckheere) foi realizado para avaliar a existência de tendência quando a exposição apresentava categorias ordinais. As curvas ROC foram construídas após a modelagem da presença ou ausência de um determinado diagnóstico clínico com uma análise de regressão logística.

Os níveis de expressão de YKL{{0}} e GFAP Western blot foram normalizados para seus respectivos controles de carga (-tubulina e -actina) e comparados com a média da razão de controle com o teste não paramétrico Mann-Whitney U. Nos gráficos, os níveis de YKL-40 e PCR no LCR e no plasma são mostrados como mediana e intervalo interquartílico. A expressão cerebral de YKL-40 é mostrada como a média ± erro padrão da média (SEM). Em todos os casos, a significância estatística foi estabelecida em p < 0,05.

O mecanismo de Cistanche trata a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson

Cistanche é uma erva que tem sido tradicionalmente usada na medicina chinesa para tratar uma variedade de condições de saúde, incluindo distúrbios neurológicos como a doença de Alzheimer (DA) e a doença de Parkinson (DP). Cistanche contém vários compostos bioativos, incluindo glicosídeos feniletanóides e glicosídeos iridóides, que possuem efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e neuroprotetores. Esses compostos ajudam a proteger as células neuronais dos danos causados ​​pelos radicais livres e processos inflamatórios, que se acredita contribuir para o desenvolvimento e progressão da DA e da DP.

Além disso, Cistanche demonstrou aumentar os níveis de certos neurotransmissores no cérebro, incluindo dopamina e acetilcolina, que são importantes para o funcionamento normal do cérebro. Ao aumentar esses níveis de neurotransmissores, Cistanche pode ajudar a melhorar a função cognitiva e reduzir os sintomas de DA e DP.

No geral, os mecanismos de Cistanche no tratamento de DA e DP envolvem seus efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e neuroprotetores, bem como sua capacidade de aumentar os níveis de neurotransmissores no cérebro.

continua...

Víctor Antonio Blanco-Palmero 1,2,3,† , Marcos Rubio-Fernández 1,2,†, Desireé Antequera 1,2 , Alberto Villarejo-Galende 1,2,3 , José Antonio Molina 1,2,3, Isidro Ferrer 1,4,5,6 , Fernando Bartolomeu 1,2,* e Eva Carro 1,2,*

1 Rede Centro de Investigação Biomédica em Doenças Neurodegenerativas (CIBERNED), 28031 Madrid, Espanha; victorb1989@gmail.com (VAB-P.); marcosrubio.imas12@h12o.es (MR-F.); eeara@yahoo.es (DA); avgalende@yahoo.es (AV-G.); cvillaiza@telefonica.net (JAM); 8082ifa@gmail.com (SE)

2 Grupo de Doenças Neurodegenerativas, Hospital 12 de Octubre Research Institute (imas12), 28041 Madrid, Espanha

3 Serviço de Neurologia Hospital Universitario 12 de Octubre, 28041 Madrid, Espanha

4 Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Hospitalet de Llobregat, E08907 Barcelona, ​​Espanha

5 Departamento de Patologia e Terapêutica Experimental, Universidade de Barcelona, ​​E08900 Barcelona, ​​Espanha 6 Instituto de Neurociências, Universidade de Barcelona, ​​E08000 Barcelona, ​​Espanha * Correspondência: fbartolome.imas12@h12o.es (FB); carroeva@h12o.es (CE); Tel.: mais 34-913908765 (FB & EC); Fax: mais 34-913908544 (FB e EC)