A administração in vivo de consórcios de bactérias intestinais replica os metabótipos A e B da urolitina em um modelo de rato não produtor de urolitinaⅠ

Durante décadas, o consumo de elagitaninos (ETs) e ácido elágico (EA) tem sido associado a numerosos efeitos biológicos, incluindo atividades antioxidantes, anticancerígenas, anti-inflamatórias, antibacterianas e de replicação anti-HIV.1 No entanto, a absorção e biodisponibilidade de ETs e EA são muito pobres. Estudos humanos anteriores descobriram que a excreção urinária de EA e um EA-O-glicuronídeo é inferior a 1% da ingestão.2,3 No entanto, embora a absorção de ET e EA seja baixa, eles são posteriormente metabolizados pela microbiota do cólon em urolitinas. (Uros), que são responsáveis, pelo menos parcialmente, pelos efeitos benéficos dos alimentos ricos em ET e (ou) EA.1,4

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Primeiro, o EA é liberado por meio da hidrólise das ligações éster do ET pela enzima conhecida como elagitannase.5 O EA sofre degradação adicional, produzindo derivados de 6H-dibenzo[b,d]pirano-6-ona chamados Uros. Essa cascata de reações começa com a clivagem do anel de lactona por uma enzima lactonase, resultando em ácido luteico, que é então descarboxilado em penta-hidroxi-Uro (Uro-M5). A desidroxilação consecutiva o converte em tetra-hidroxi-Uros (Uro-D, Uro-E e Uro-M6) e tri-hidroxi-Uros (Uro-C, UroM7 e Uro-G), para finalmente produzir di-hidroxi-Uros (Uro-A eisoUro-A) e mono-hidroxi-Uro (Uro-B), sendo este último geralmente detectado quando isoUro-A também é produzido.1

A grande variação dos perfis metabólicos Uro detectados em humanos após o consumo de alimentos ricos em ET indica diferenças interindividuais na microbiota do cólon responsável pela degradação da ET.6–8 Numerosas interações possíveis entre as bactérias do cólon e o organismo hospedeiro poderiam explicar os diferentes destinos metabólicos da dieta (poli )fenóis.6,9 Essa interação bidirecional entre a microbiota intestinal e os (poli)fenóis levou a comunidade científica a agrupar a população com base em seusfenótipo metabólico (tipo de metal) para explicar as diferenças nos efeitos dos polifenóis.10,11 Mais especificamente, de acordo com o metabolismo ET e EA, os indivíduos podem ser estratificados em Urometabótipos (UMs) associados à composição e funcionalidade do microbioma intestinal.7,8,12

Três UMs humanos (UM-A, UM-B e UM-0) relacionados a três perfis diferentes de produção de Uro foram descritos em populações ocidentais e orientais.13–15 A esse respeito, indivíduos do metabótipo A (UM-A) produzem vários Uros intermediários, mas apenas a urolitina A (Uro-A), o principal Uro absorvido neste UM, no final da via catabólica microbiana. Indivíduos do metabótipo B (UM-B) produzem alguns Uros intermediários e três Uros finais, ou seja, urolitina B (Uro-B), urolitina A (IsoUro-A) e Uro-A, que são os principais Uros absorvidos em UM-B. Portanto, os Uros intermediários poderiam atuar principalmente no intestino, enquanto os finais poderiam ter efeitos locais e sistêmicos.6 Em contrapartida, indivíduos com metal tipo 0 (UM-0) não conseguem produzir esses Uros finais (apenas os Uros finais). foi detectado até agora o precursor Urolitina-M5, que não é absorvido no intestino).

Diferenças nos Uroperfis foram observadas entre UMs e ao longo do intestino grosso, mostrando produção predominante de Uro na região distal do cólon.16–19 Notavelmente, a porcentagem de UM-0 em voluntários saudáveis ​​espanhóis e chineses é de aproximadamente 10% e pode ser ainda maior em a população dos EUA.13–15 Os gêneros bacterianos Gordonibacter e Ellagibacter foram identificados como capazes de metabolizar EA em alguns Uros.20–23No entanto, descobriu-se que alguns intermediários (por exemplo, Uro-D, Uro-E, Uro- M7 e Uro-G) e Uros finais (Uro-A e Uro-B) não são produzidos em culturas puras dessas bactérias, o que implica na necessidade de outras bactérias para completar o conjunto de Uros que configuram tanto UM-A quanto UM-B . Recentemente, foram identificados os consórcios de bactérias intestinais envolvidos no metabolismo da EA para produzir os metabótipos Uroprodutores (UM-A e UM-B) in vitro.24

Consórcios bacterianos contendo os gêneros Gordonibacter mais Enterocloster e Ellagibacter mais Enterocloster produziram in vitro as urolitinas associadas a UM-A e UM-B, respectivamente.25 No entanto, a capacidade desses consórcios bacterianos de replicar perfis Uro humanos associados a UM-A e UM-B in vivo ainda é desconhecido. Além disso, a segurança do consumo destas bactérias produtoras de Uro como novos probióticos ainda é incerta, uma vez que não foi previamente testada em animais ou humanos. No presente estudo, os consórcios bacterianos acima foram avaliados quanto à sua capacidade de colonizar o intestino de ratos não produtores de Uro (tipo UM -0-) ​​e convertê-los em Uroprodutores mimetizando UM-A e UM-B, respectivamente. A segurança desses consórcios bacterianos também foi avaliada. Além disso, dois novos procedimentos baseados em PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foram desenvolvidos para detectar e quantificar Ellagibacter e Enterocloster em amostras fecais.

Materiais e métodos

Químicos e reagentes

Os Uros foram sintetizados quimicamente e purificados pela VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Espanha). EA foi adquirido da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA). A solução salina tampão fosfato (PBS) foi obtida da FisherScientific (EUA), enquanto o metanol, o etanol e o ácido fórmico foram da Panreac Química (Barcelona, ​​Espanha). Os solventes de grau de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) foram adquiridos à JT Baker (Deventer, Holanda). Água ultrapura Millipore (Bedford, MA, EUA) foi utilizada durante todo o estudo. Todos os produtos químicos e reagentes eram de grau analítico.

Preparação de consórcios bacterianos

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T e Enterocloster bolted CEBASS4A9, todos isolados e identificados em nosso laboratório(CEBAS-CSIC, Espanha), foram cultivados anaerobicamente em 5 mLWilkins -Tubos de meio anaeróbio Chalgren (WAM, Oxoid) a 37 graus por 48 h na câmara anaeróbica Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, South Wales, Reino Unido) e ressuspensos em PBS suplementado com 10% de glicerol e 0,05% de cloridrato de L-cisteína (PanReac Química, Barcelona, ​​Espanha). Após a incubação anaeróbica, os consórcios foram preparados.24,25 Resumidamente, o "consórcio bacteriano A" continha G. cepas de urolitinfaciens e E. bolteae; "consórcio bacterianoB" continha culturas de E. isourolithinifaciens e E. bolteae; e o"coquetel controle" continha PBS estéril com 10% de glicerol e 0,05% de cloridrato de L-cisteína. Antes da administração, todos os coquetéis foram distribuídos em alíquotas de 3,5 mL e mantidos a −80 graus.

Animais, dietas e desenho experimental

O protocolo experimental (referência 624/2020) foi aprovado pelo governo local, pelo Comitê de Bioética do Conselho Nacional de Pesquisa da Espanha (Madri, Espanha) e pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Múrcia (Espanha). Os experimentos seguiram as recomendações da União Europeia em relação à experimentação animal (Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho sobre a proteção de animais utilizados para fins científicos). Ratos Wistar (n=18; 9 fêmeas e 9 machos) pesando 240 ± 31 g foram obtidos da Envigo (Barcelona, ​​Espanha). Este modelo de rato foi selecionado com base em sua incapacidade de produzir Uros observada em nossos estudos preliminares, nos quais foram testadas amostras fecais de diferentes modelos de ratos. Três grupos (A, B e C) foram formados pela atribuição aleatória de 6 animais cada (3 ratos fêmeas e 3 ratos machos). ) por grupo (Fig. 1).

Cada grupo de ratos foi alojado em duas gaiolas diferentes, divididas por sexo, em uma sala com ambiente com temperatura controlada (22±2 graus) com umidade relativa de 55±10% e ciclo claro-escuro controlado (12 h). Os ratos receberam dieta padrão (Teklad, Barcelona, ​​Espanha) contendo (%/100 g de peso fresco) 14,3% de proteínas (farinha de glúten de milho), 48% de carboidratos (farelo de trigo, trigo moído, milho moído) e 4% de gordura (óleo de soja). ), densidade de energia de 2,9 kcal g-1 e 4,1% de fibra bruta, suplementado com pó de EA maior ou igual a 95% de pureza (3,6 mg por 100 g de ração). O EA foi misturado homogeneamente com ração padrão moída, repelido e liofilizado. A dieta enriquecida com EA foi armazenada longe da umidade e da luz. A dose de EA dada aoratos na dieta foi de aproximadamente 0,72 mg por rato por dia (dieta EA1×), uma dose humana equivalente de 41 mg dia-1,26. Todos os grupos foram alimentados com a dieta EA 1× e água da torneira ad libitum durante todo o experimento ( 5 semanas). Como o EA detectado nas amostras fecais foi baixo durante a primeira semana, algum EA extra foi adicionado nos dias seguintes. Na semana 3, uma dose extra de 1,5 mg EA por rato por dia dissolvido em água foi administrada oralmente por gavagem aos animais (total=EA 3× dieta), que foi dada apenas por 1 semana. Finalmente, na semana 4, ≈5 g de nozes por rato por dia (outra fonte de EA) foram adicionados à dieta EA 1× e foram mantidos até o final do estudo para avaliar o impacto do EA contendo matriz alimentar na capacidade da bactéria para produzir Uros. O peso, a alimentação e a ingestão de água foram medidos todos os dias. Os consórcios de bactérias intestinais foram administrados por via oral por gavagem. O Grupo A recebeu 500 µL de coquetel bacteriano A, o Grupo B recebeu 500 µL de coquetel bacteriano B e o Grupo C (controle) recebeu 500 µL de PBS. A gavagem oral foi realizada a cada 2 dias durante as primeiras duas semanas e todos os dias durante as 2 semanas seguintes. Na última semana (dias 28 a 32), os animais continuaram com a mesma dieta suplementada com EA e nozes, mas sem administração oral de bactérias. Ao final do estudo, os animais foram sacrificados em câmara de CO2.

Procedimentos de amostragem

Amostras fecais foram coletadas durante o estudo para análise Uro por UPLC-ESI-QTOF-MS/MS e microbiota intestinal por sequenciamento do gene 16S rRNA e qPCR. O sangue foi extraído em diferentes momentos (linha de base, dia 28 e final do estudo) para análises hematológicas e bioquímicas séricas. Amostras de sangue foram obtidas da veia da cauda (≈500 µL) e coletadas em tubos contendo heparina na linha de base e nos dias 28 e 32 (Fig. 1). A separação do plasma foi realizada imediatamente por centrifugação a 3000g por 10 min a 4 graus e congelada a - 80 graus até nova determinação das variáveis ​​sorobioquímicas. O fígado, os rins e o baço foram coletados, pesados ​​e examinados para detectar quaisquer diferenças morfológicas no sacrifício.

Projeto e otimização de primers e sonda para quantificação de Ellagibacter e Enterocloster por qPCR

Sequências dos genes 16S rRNA de Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T e E. bolted CEBAS S4A9 foram obtidas do banco de dados GenBank (banco de dados EMBL). As sequências foram alinhadas com os gêneros bacterianos filogeneticamente próximos usando o software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 11) e inspecionadas quanto a regiões de sequências conservadas e variáveis ​​para projetar os primers e a sonda para detectar e quantificar Ellagibacter e Enterocloster (Tabela 1). Os primers e a sonda foram projetados e validados com as ferramentas Primer Quest e Oligo Analyzer, respectivamente (Integrated DNATechnologies, Inc., Bélgica). A sonda TaqMan foi marcada nas extremidades 5' e 3' com um6-grupo carboxi-fluoresceína (6FAM) e um supressor de amora(BBQ), respectivamente. qPCR foi realizado usando um sistema de detecção de sequência ABI 7500. As concentrações finais de cada primer e sonda foram 300 e 375 nM para Ellagibacter e 200 e 500 nM para Enterocloster. Um protocolo qPCR convencional foi realizado para amplificação do DNA de Ellagibacter eEnterocloster, respectivamente. O perfil de rampa para amplificação Ellagibacter foi de 1 ciclo a 95 graus por 5 min, seguido por 45 ciclos de 95 graus por 15 s, 50 graus por 40 s e 72 graus por 31 s. Finalmente, 1 ciclo a 72 graus por 5 min foi adicionado . O perfil de rampa para amplificação do Enterocloster foi de 1 ciclo a 95 graus por 5 min, seguido por 40 ciclos de 95 graus por 15 s, 65 graus por 40 s e 72 graus por 31 s. Finalmente, foi adicionado 1 ciclo a 72 graus por 5 min.

Extração de DNA fecal e análises microbianas intestinais

A extração de DNA de amostras fecais foi realizada com o kit de purificação de DNA tecidual NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante com algumas modificações. O DNA foi quantificado por fluorimetria (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, Reino Unido), e a pureza foi medida a partir da razão de absorbância no comprimento de onda de 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, Reino Unido ). A composição da microbiota intestinal foi determinada pelo sequenciamento das regiões variáveis ​​V3 e V4 do gene 16S rRNA seguindo protocolos Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA) com um comprimento de leitura de 2 × 300 pb de execução emparelhada (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). O sequenciamento metagenômico foi realizado em uma plataforma MiSeq-Illumina (serviço de sequenciamento FISABIO, Espanha). O processamento de dados, a remoção da sequência quimérica, o alinhamento da sequência e o agrupamento da sequência do gene 16S rRNA foram realizados conforme descrito em outro lugar para obter a classificação taxonômica.8,27 A amplificação do DNA de Gordonibacter foi obtida em um sistema qPCR ABI 7500, conforme descrito anteriormente.19,28 O Enterocloster e o Ellagibacter- primers e sondas específicos projetados no presente estudo foram utilizados seguindo o protocolo qPCR descrito acima. Curvas padrão de DNA genômico de Gordonibacter, Enterocloster e Elagibacter foram utilizadas para quantificação. Todas as amostras fecais foram analisadas em triplicata.

Extração, detecção e quantificação de urolitinas em amostras fecais

Foram extraídas amostras fecais ({{0}},2–0,5 g), na proporção de 1:10, com solução de MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), acidificado com 0,1% de HCl, e homogeneizado por agitação em vórtex por 2 min e agitação a 1500 rpm em temperatura ambiente por 10 min em um aquecedor de bloco. A suspensão foi centrifugada a 14 000g a 4 graus por 10 min, e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de membrana PVDF de 0,22 µm (Millipore Corp., Bedford, MA) e diluído 3× com MeOH (0,1% de ácido fórmico ) antes da injeção em um sistema UPLC-ESI-QTOF-MS. Um sistema UPLC (Agilent 1290Infinity) acoplado a um sistema LC/MS de tempo de voo quadrupolo (QTOF) (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha) foi usado para analisar os metabólitos fecais usando um método de eluição gradiente como descrito anteriormente .29,30 Resumidamente, a separação foi realizada em coluna de fase reversa Poroshell 120 EC-C18, utilizando água e acetonitrila, ambas acidificadas com ácido fórmico a 0,1%, como fases móveis. A vazão foi de 0,4 mL min-1 e o volume de injeção foi de 5 µL. O software MassHunter Qualitative Analysis (versão B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha) foi utilizado para processamento de dados. Todos os metabólitos foram identificados por comparação direta com padrões e confirmados pela sua massa molecular. Curvas de calibração foram obtidas para EA e os diferentes Uros com boa linearidade (R2 > 0,99).

Hematologia e química clínica

As variáveis ​​hematológicas foram determinadas em sangue heparinizado utilizando um analisador hematológico automático com software específico para amostras de sangue de ratos (AVDIA 120, Siemens, Munique, Alemanha). As variáveis ​​analisadas foram volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), distribuição eritrocitária (RDW), volume plaquetário médio (VPM), critrópico plaquetário (PCT), largura de distribuição plaquetária (PDW) , componente plaquetário médio (CPM), massa plaquetária média (MPM), contagem de plaquetas (PLT), conteúdo de hemoglobina de reticulócitos (CHr) e volume corpuscular médio de reticulócitos (VCM). Variáveis ​​​​bioquímicas plasmáticas, cálcio (Ca) e fósforo (P) foram analisadas usando um analisador químico e toxicológico Olympus AU400 (Beckman Coulter, Califórnia, EUA). As variáveis ​​bioquímicas foram proteínas totais (PROT), albumina (ALBU), globulina (GLOB), creatinina (CREA), glicose (GLUC), colesterol (CHOL), triglicerídeos (TRIGL), fosfatase alcalina (ALP), gama-glutamil transpeptidase ( GGT), aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT). Finalmente, os níveis de tiroxina (T4) foram analisados ​​utilizando um sistema de imunoensaio IMMULITE® 1000 (Siemens).

Análise estatística

Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). A análise estatística foi realizada com o software SPSS versão 27.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA), e diferenças comp < 0.05 foram considerados estatisticamente significativos. A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk. As comparações entre diferentes grupos de tratamento foram realizadas usando análise de variância medida repetida (RM ANOVA) com teste post hoc T3 de Tukey ou Dunnett, dependendo se os dados seguiram uma distribuição normal ou não normal, respectivamente. As diferenças entre homens e mulheres foram exploradas usando o teste t de Student pareado ou o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon quando os dados eram distribuídos normalmente ou não normalmente, respectivamente. O tamanho do efeito da análise discriminante linear qui-quadrado (LEfSe) foi utilizado para detectar características bacterianas diferenciais entre os grupos. A correlação de Pearson foi utilizada para analisar possíveis associações entre variáveis ​​em dados com distribuição normal, enquanto a correlação de Spearman foi aplicada em dados com distribuição não normal. Os gráficos de dados foram realizados usando Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, EUA).

Fitoterapia natural para aliviar a constipação-Cistanche

Cistanche é um gênero de plantas parasitas que pertence à família Orobanchaceae. Estas plantas são conhecidas pelas suas propriedades medicinais e têm sido utilizadas na Medicina Tradicional Chinesa (MTC) há séculos. As espécies de Cistanche são encontradas predominantemente em regiões áridas e desérticas da China, Mongólia e outras partes da Ásia Central. As plantas Cistanche são caracterizadas por seus caules carnudos e amarelados e são altamente valorizadas por seus potenciais benefícios à saúde. Na MTC, acredita-se que Cistanche tenha propriedades tônicas e é comumente usado para nutrir os rins, aumentar a vitalidade e apoiar a função sexual. Também é usado para tratar problemas de envelhecimento, fadiga e bem-estar geral. Embora Cistanche tenha uma longa história de utilização na medicina tradicional, a investigação científica sobre a sua eficácia e segurança é contínua e limitada. No entanto, contém vários compostos bioativos, como glicosídeos feniletanóides, iridóides, lignanas e polissacarídeos, que podem contribuir para seus efeitos medicinais.

Wecistanche'spó de cistanche, comprimidos de cistanche, cápsulas de cistanche,e outros produtos são desenvolvidos usandodesertocistanchecomo matérias-primas, que têm um bom efeito no alívio da constipação. O mecanismo específico é o seguinte: Acredita-se que Cistanche tenha benefícios potenciais no alívio da constipação com base em seu uso tradicional e em certos compostos que contém. Embora a investigação científica específica sobre o efeito do Cistanche na obstipação seja limitada, pensa-se que tem múltiplos mecanismos que podem contribuir para o seu potencial no alívio da obstipação. Efeito laxante:Cistanchetem sido usado há muito tempo na Medicina Tradicional Chinesa como remédio para constipação. Acredita-se que tenha um efeito laxante suave, que pode ajudar a promover os movimentos intestinais e induzir a constipação. Este efeito pode ser atribuído a vários compostos encontrados em Cistanche, como glicosídeos feniletanóides e polissacarídeos. Umedecendo os Intestinos: Com base no uso tradicional, considera-se que Cistanche possui propriedades hidratantes, visando especificamente os Intestinos. Promover a hidratação e a lubrificação dos intestinos pode ajudar a suavizar as ferramentas e facilitar a passagem, aliviando assim a constipação. Efeito antiinflamatório: Às vezes, a constipação pode estar associada à inflamação no trato digestivo. Cistanche contém certos compostos, incluindo glicosídeos feniletanóides e lignanas, que se acredita terem propriedades antiinflamatórias. Ao reduzir a inflamação nos intestinos, pode ajudar a melhorar a regularidade dos movimentos intestinais e a aliviar a constipação.