Avaliação in vitro de interações medicamentosas mediadas por P-gp usando o modelo de células renais humanas RPTEC/TERT1
Mar 01, 2022
Introdução A avaliação in vitro do potencial inibitório da P-glicoproteína (P-gp) é uma questão importante durante o processo de desenvolvimento de medicamentos, pois permite a previsão de interações medicamentosas (DDIs) clinicamente relevantes [1-3]. A P-gp pertence à superfamília de transportadores ATP-binding cassete (ABC) e é codificada pelo gene de resistência a múltiplas drogas MDR1 (também conhecido como ABCB1). Este transportador de membrana é conhecido por ser superexpresso em células tumorais e causar resistência a muitas drogas anticancerígenas [4]. Localizado dentro de todas as barreiras fisiológicas, incluindo intestino, fígado erins, a P-gp protege contra xenobióticos, limitando a absorção desses substratos do trato digestivo e facilitando seu efluxo na bile e na urina. Assim, a P-gp desempenha um papel notável na farmacocinética de várias classes terapêuticas [5-7]. Uma infinidade de medicamentos, como agentes anticancerígenos, antifúngicos e medicamentos cardiovasculares, são conhecidos como substratos e/ou inibidores da P-gp, e muitos deles estão envolvidos em interações clinicamente relevantes [8-10]. Portanto, a Food and Drug Administration (FDA) dos EUA exige que o potencial inibitório da P-gp seja avaliado durante os estágios iniciais do desenvolvimento do medicamento. Ensaios in vitro realizados para este fim são comumente baseados em estudos de transporte de drogas usando linhas celulares que expressam P-gp. Mais precisamente, as diretrizes da FDA recomendam a determinação dos valores da concentração inibitória semimáxima in vitro (IC50) para avaliar o risco de DDIs clínicos resultantes da inibição da P-gp. Para este fim, muitos ensaios experimentais foram realizados, e a maioria deles se concentrou em interações medicamentosas relacionadas à absorção intestinal usando os modelos Caco-2 ou MDCK-MDR1 [11–13]
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DesderenalA eliminação também é uma via de eliminação comum para várias classes de drogas, a secreção tubular ativa via transportadores ABC também pode desempenhar um papel fundamental nessas interações [14]. No entanto, dados in vitro sobrerenalDDIs mediados por P-gp são limitados. Isso se deve em parte à falta de desenvolvimento e caracterização de modelos in vitro para a previsão derenaltransporte de drogas. Entre várias linhagens de células humanas, o modelo RPTEC/TERT1 parece se mostrar promissor para a avaliação derenalinterações medicamentosas. Esta linha celular é derivada de um doador humano saudável e foi gerada a partir de células do túbulo proximal imortalizadas. Além disso, a expressão e a funcionalidade da P-gp foram demonstradas usando este modelo, confirmando assim sua capacidade de preverrenalefugos de drogas [15, 16]. Nesse contexto, o presente estudo foi desenhado para investigar o potencial inibitório da P-gp usando o modelo RPTEC/TERT1. Primeiro, um ensaio de triagem de acúmulo de rodamina 123 (R123) foi realizado para obter um perfil de inibição para cada droga testada. Com base nessa triagem, quatro drogas foram então selecionadas para avaliação de seus efeitos concentração-dependentes no acúmulo intracelular de duas drogas substrato da P-gp: apixabana e rivaroxabana
Palavras-chave:célula renal, modelo renal, droga renal, eliminação renal, rins.
Materiais e métodos
ReagentesApixabana, [2H71 3C ] - api xa ban , ri va r oxa ban ,[13C6]-rivaroxabana, nilotinibe, crizotinibe, erlotinibe, axitinibe, idelalisibe, varfarina e etexilato de dabigatrana foram adquiridos da Alsachim (Illkirch, França). Verapamil, cetoconazol, sinvastatina, amiodarona, rodamina 123, solução salina balanceada de Hank (HBSS) e solução HEPES foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, França).
Cultura de células As células RPTEC/TERT1 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, França) e cultivadas em meio defnido hormonalmente, sem soro consistindo em meio de Eagle modificado de Dulbecco F12 (ATCC) suplementado com um kit de fator de crescimento (ATCC) e um 1 por cento de mistura de antibiótico/antimicótico (penicilina-estreptomicina, anfotericina B) a 37 graus e 5 por cento de CO 2. Para todos os experimentos, as células foram semeadas em 96-placas de poços a uma densidade de 50,000 células por poço e foram usadas para crescer após 14 dias de cultura. O meio foi renovado a cada 2 dias e as células foram usadas da passagem 27 à passagem 34. As células Caco{14}} também foram adquiridas da ATCC. As células foram mantidas em um meio de cultura consistindo de Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma-Aldrich, Missouri, EUA) suplementado com 10% de FBS, 1% de aminoácidos não essenciais e uma mistura de 1% de antibiótico/antimicótico (penicilina-estreptomicina, anfotericina B ) a 37 graus e 5 por cento de CO2. As células Caco-2 foram semeadas em placas de 96-poço a uma densidade de 5 × 10 3 células por poço e foram usadas para crescer após 14 dias de cultura. As células epiteliais tubulares proximais humanas (HPTECs) foram obtidas da BIOPREDIC (Rennes, França) e cultivadas em DMEM/F12 suplementado com hidrocortisona, EGF, insulina, transferrina e selenito de sódio. As células foram semeadas em 96-placas de cultura revestidas com colágeno a uma densidade de 6600 células por poço e foram usadas para crescer após 11 dias de cultura.
Ensaio de Triagem de Acumulação de Rodamina 123 O potencial inibitório da P-gp foi determinado medindo o acúmulo intracelular de rodamina 123 em células RPTEC/TERT1 na presença e ausência de várias classes de drogas. Entre as 14 drogas testadas, ciclosporina A (10 µM), cetoconazol (50 µM), verapamil (100 µM) e amiodarona (50 µM) foram usados como inibidores da P-gp. Apixabana, rivaroxabana e etexilato de dabigatrana – três anticoagulantes orais diretos (DOACs) – foram usados como substratos da P-gp (10 µM). A varfarina (50 µM) foi usada como não inibidor, e cinco drogas anticancerígenas incluindo nilotinib, crizotinib, erlotinib e idelalisib foram usadas sem conhecer seus perfis de inibição na concentração de 10 µM. Várias condições foram reproduzidas com as células Caco{14}}, que são aprovadas pelo FDA para estudos de transporte de drogas. Desta forma, a retenção intracelular de rodamina 123 foi determinada em células Caco{16}} na presença e ausência de verapamil (100 µM), ciclosporina A (10 µM), nilotinib (10 µM) e DOACs (10 µM ). Resumidamente, após 14 dias de cultura em 96-placas de poços, as células foram pré-incubadas por 10 min a 37 graus com cada droga dissolvida em HBSS com 10 mM de HEPES (v/v). Em seguida, as células foram incubadas com 10 µM de rodamina 123 por 45 min a 37 graus. Finalmente, após três lavagens em solução fria de HBSS/HEPES, as células foram lisadas à temperatura ambiente por 45 min em uma solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) contendo 1% de borato de sódio. A quantidade de rodamina 123 intracelular foi quantificada usando um nanoespectrofuorômetro Infnite M (Life Sciences, TECAN, Suíça), definindo os comprimentos de onda para 485/535 nm. Os dados foram expressos como percentagens da acumulação de rodamina 123 em células de controlo não expostas a quaisquer potenciais inibidores da P-gp e arbitrariamente fixadas em 100 por cento de acumulação.
Ensaio de Acumulação Intracelular DOAC e Determinação de IC50 A partir do ensaio de triagem de rodamina 123 anterior, quatro drogas foram escolhidas para investigar seus efeitos dependentes da concentração no acúmulo intracelular de apixabana e rivaroxabana (10 µM) em células RPTEC/TERT1. Cetoconazol, crizotinib e nilotinib foram selecionados como inibidores da P-gp e a varfarina foi escolhida como não inibidor. A ciclosporina A (10 µM) foi usada como um inibidor de transportadores de amplo espectro. Estudos das interações entre DOACs e nilotinib para determinação dos valores de IC50 foram reproduzidos em células Caco-2 para comparar os dois modelos celulares. Todos os compostos foram diluídos sozinhos ou com o inibidor associado em tampão de transporte HBSS suplementado com 1 por cento de HEPES (v/v) e 1 por cento de DMSO (v/v). Antes da incubação, todas as soluções foram pré-aquecidas a 37 graus e o pH foi ajustado para 7,4. Para as drogas anticancerígenas crizotinib e nilotinib, devido à sua baixa solubilidade e potencial citotóxico, as concentrações variaram de 0,1 a 25 µM. Para cetoconazol e varfarina, as concentrações variaram de 0,1 a 100 µM. Resumidamente, após 14 dias de cultura, todas as drogas dissolvidas em HBSS com 1 por cento de HEPES (v/v) foram pré-incubadas por 10 min a 37 graus. Em seguida, as células foram incubadas com 10 µM de apixabana ou rivaroxabana por 60 minutos a 37 graus. Finalmente, após três lavagens em solução fria de HBSS/HEPES, as células foram lisadas à temperatura ambiente por 45 min em uma solução de 0,2 por cento de Triton X-100. A quantidade de DOAC intracelular foi então quantificada por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS). Os dados foram expressos como aumentos percentuais na acumulação de DOAC, e a acumulação intracelular de DOAC foi arbitrariamente fixada em 100 por cento nas células de controle. Os valores de IC50 para inibição da atividade de P-gp, que correspondem a valores de concentração efetiva meia-máxima (EC50) para aumentar a acumulação de DOAC, foram determinados a partir de modelagem de regressão não linear não ponderada de mínimos quadrados de acumulação aumentada com a função 'nls()' em R software, de acordo com a seguinte equação (Eq. 1):
Cromatografia Líquida – Análise de Espectrometria de MassaA quantificação de apixabana (m/z 460.19793) e rivaroxabana (m/z 436.07285) foi realizada usando um Ultimate U300{{18 }} sistema de cromatografia líquida (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA) acoplado a um espectrômetro de massa Q-Exactive Plus (ThermoFisher, Bremen, Alemanha). As separações de LC foram obtidas usando uma coluna analítica Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, EUA) e uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min . A fase móvel A era água com 0,1 por cento de ácido fórmico (FA) e a fase móvel B era acetonitrila com 0,1 por cento de FA. Para rivaroxabana, o gradiente foi: 0–0,3 min, 10% B; 0,3–1 min, linear de 10% a 70% B; 1–1,5 min, 70% B; 1,51 min, retornar às condições de partida até 3 min. Para apixabana, o gradiente foi: 0–0,3 min, 10% B; 0,3–0,7 min, linear de 10 a 90 por cento B; 0,7–1,5, 90% B; 1,51 min, retornar às condições de partida até 3 min. A detecção foi realizada no modo de monitoramento de reação paralela positiva por eletrospray (PRM) a uma resolução de 35,000 (em m/z 200). Os padrões internos (ISs) foram [13C,2H7]-apixaban (m/z 468,2452) para apixabana e [13C6]-rivaroxabana (m/z 442,09297) para rivaroxabana. Para cada fármaco e seu respectivo IS, um íon alvo (para quantificação) e um íon de confirmação foram monitorados. Para rivaroxabana e seu IS, o íon alvo foi m/z 144,95125 e os íons de confirmação foram m/z 231,11280 e m/z 237,13298, respectivamente. Para apixabana e seu IS, o íon alvo foi m/z 199,08656 e os íons de confirmação foram m/z 282,12387 e m/z 241,06062, respectivamente.
Resultados
Ensaio de Triagem de Acumulação de Rodamina 123O ensaio de triagem de acúmulo de rodamina 123 foi realizado em células RPTEC/TERT1 com 14 drogas com diferentes perfis de inibição (Fig. 1). Como esperado, o acúmulo intracelular de rodamina 123 na presença de ciclosporina A, um inibidor de amplo espectro, estava entre os mais altos, com um aumento no acúmulo de 75% em relação às células controle. A presença de verapamil, um inibidor específico da P-gp, levou a um aumento no acúmulo de rodamina 123 de 57 por cento , demonstrando o envolvimento da P-gp. Da mesma forma, o cetoconazol, descrito como um forte inibidor da P-gp, levou a um aumento maior (66%) no acúmulo intracelular de rodamina 123 em relação ao verapamil, confirmando seu perfil de inibição. Por outro lado, a adição de amiodarona, caracterizada como inibidor moderado da P-gp, causou um aumento de 59% no acúmulo, semelhante ao causado pelo verapamil. Diferentes perfis de inibição foram observados para os agentes anticancerígenos nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib e idelalisib. A adição de nilotinibe causou forte aumento no acúmulo de rodamina 123 (71 por cento ), sugerindo potencial inibitório significativo, seguido de axitinibe, que ocasionou um aumento na retenção de 57 por cento . Por outro lado, crizotinib e erlotinib demonstraram potenciais inibitórios moderados a baixos, com aumentos no acúmulo de rodamina 123 de 23% e 16%, respectivamente. Idelalisib não afetou o acúmulo de rodamina 123; o mesmo aconteceu com a varfarina, que foi
escolhido como não inibidor. Entre os três DOACs, apixabana e rivaroxabana causaram ligeiros aumentos na retenção de rodamina 123: 33% e 12%, respectivamente. Curiosamente, o etexilato de dabigatrana, uma pró-droga da dabigatrana e um substrato conhecido da P-gp, causou um aumento na retenção de rodamina 123 de cerca de 50%, embora não seja descrito como um potencial inibidor da P-gp. Finalmente, a adição de sinvastatina causou apenas um ligeiro aumento na acumulação do substrato fluorescente (32 por cento). Com base nessa triagem, quatro drogas foram selecionadas para avaliar seus efeitos dependentes da concentração no acúmulo intracelular de apixabana e rivaroxabana dentro do modelo RPTEC/TERT1. O cetoconazol foi escolhido como condição de controle positivo para a inibição da P-gp, e a varfarina foi selecionada como não inibidor da P-gp para a condição de controle negativo. Nilotinib e crizotinib foram selecionados como inibidores fortes e moderados da P-gp, respectivamente. Várias condições foram reproduzidas com o modelo de referência, Caco-2. O acúmulo intracelular de R123 nas células foi determinado após combinação (ou não) com apixabana e rivaroxabana (10 µM), nilotinibe (10 µM) e com ciclosporina A (10 µM) e verapamil (100 µM) para as condições de controle para inibição (Fig. 2A). Como esperado, o verapamil e a ciclosporina A causaram altos aumentos na retenção de R123 de 297% e 275%, respectivamente. Da mesma forma, o nilotinib causou um grande aumento no acúmulo intracelular de R123 (229 por cento), confirmando seu potencial inibitório. A combinação de R123 com DOACs resultou em pequenos aumentos no acúmulo de R123 (40-44%) em comparação com outras drogas. Além disso, o acúmulo intracelular de rodamina 123 na ausência e presença de ciclosporina A emrenalcélulas humanas primárias também foram investigadas neste estudo para verificar a confiabilidade dos resultados obtidos com células RPTEC/TERT1 (Fig. 2B). Essas análises mostraram que a presença de ciclosporina A aumentou a retenção de R123 em 71%. Este valor foi próximo ao obtido nas mesmas condições com células RPTEC/TERT1 (aumento de 75 por cento com ciclosporina A). Portanto, a atividade da glicoproteína P foi semelhante no modelo RPTEC/TERT1 e nas células humanas primárias.
Ensaio de Acumulação Intracelular de DOACs: Determinação da Razão IC50 e I1/IC50 Estudos de acúmulo intracelular foram realizados para avaliar o transporte mediado por P-gp de apixabana e rivaroxabana em uma concentração constante de 10 µM em células RPTEC/TERT1 in vitro e na presença de concentrações crescentes de nilotinibe, crizotinibe, cetoconazol e varfarina (Figs. 2, 3). A modelagem da retenção aumentada de apixabana e rivaroxabana foi avaliada para determinar os valores de IC50. A combinação de DOACs com nilotinib levou aos menores valores de IC50: 0,85 µM e 1,37 µM para rivaroxabana e apixabana, respectivamente (Figs. 4, 5). A combinação com crizotinib produziu valores de IC50 de 10,1 µM e 12,2 µM para rivaroxabana e apixabana, respectivamente. Surpreendentemente, a combinação de DOACs com cetoconazol não produziu os menores valores de IC50 (16,5 µM e 16,9 µM para rivaroxabana e apixabana, respectivamente). Por fim, como esperado, a combinação com a varfarina, que foi
escolhido como não inibidor, não afetou as retenções intracelulares dos dois DOACs. O acúmulo intracelular de apixabana e rivaroxabana nas células Caco-2 na presença de concentrações crescentes de nilotinibe foi, portanto, investigado para comparação com os modelos celulares. Curiosamente, conforme observado com o modelo RPTEC/TERT1, o valor de IC50 para rivaroxabana (4,16 µM) foi inferior ao obtido para apixabana (9,35 µM). Também é interessante notar que os valores de IC50 observados em células Caco-2 foram superiores aos obtidos em células RPTEC/TERT1 para o mesmo inibidor. A relevância clínica dos DDIs pode ser prevista a partir de dados in vitro. De acordo com as diretrizes da FDA, as proporções [I1]/IC50 foram calculadas para cada combinação de medicamentos. Esta razão permite comparar as concentrações in vivo com aquelas conhecidas por produzirem um efeito relevante in vitro. Para apixabana em células RPTEC/TERT1, as razões foram 3,1, 0,06 e 17,4 com nilotinib, crizotinib e cetoconazol, respectivamente (Tabela 1). Nas células Caco{21}}, a razão [I1]/IC50 foi de 0,46 para a interação entre apixabana e nilotinibe (Tabela 1). Para rivaroxabana, as razões foram ligeiramente superiores às obtidas para apixabana em células RPTEC/TERT1: 5,1, 0,08 e 17,7, respectivamente, para nilotinibe, crizotinibe e cetoconazol (Tabela 2). Da mesma forma, a razão [I1]/IC50 observada para a interação entre rivaroxabana e nilotinibe em células Caco{37}} foi de 1,03, superior à obtida para apixabana (Tabela 2).
Discussão
Numerosos estudos realizados nas últimas décadas relataram um papel notável da P-gp na farmacocinética de drogas [17-19]. Tendo em vista o crescente interesse regulatório nas interações medicamentosas mediadas pela P-gp, ensaios in vitro para investigar o potencial inibitório de drogas são um aspecto importante do desenvolvimento de drogas e da prática clínica. Para este fim, muitos ensaios in vitro foram realizados, e a maioria dos dados associados sobre a absorção intestinal prevista foram gerados a partir das linhas celulares Caco-2 e MDCK-MDR1 [20-22]. No entanto, poucos dados estão disponíveis sobre a secreção tubular ativa de drogas, que também desempenha um papel fundamental na disposição de drogas e depende da presença de transportadores ABC. Esta observação está claramente ligada à falta derenallinhagens celulares para prever drogasrenalefux. Este objetivo requer uma análise in vitrorenalmodelo que imita de perto a barreira fisiológica. A linhagem celular humana RPTEC/TERT1, que expressa vários transportadores ABC (particularmente P-gp), parece ser uma boa alternativa, como demonstrado em estudo anterior [16]. Nesse contexto, o presente trabalho investigou a aplicação do modelo RPTEC/TERT1 para avaliar o potencial inibitório da P-gp. Até onde sabemos, este trabalho é o primeiro a fornecer dados de estudos de inibição de P-gp usando humanosrenalcélulas.
Ensaios in vitro para determinar o potencial inibitório da P-gp são comumente baseados no uso de um substrato específico de referência da P-gp, como digoxina ou rodamina 123 [23–25]. Devido à sua facilidade de uso, as sondas fluorescentes são vantajosas para ensaios de alto rendimento. Além disso, a rodamina 123 tem sido amplamente aplicada à detecção da atividade da P-gp em uma ampla gama de estudos [26-28]. Desta forma, ensaios de acúmulo de rodamina 123 em células RPTEC/TERT1 foram realizados neste estudo para identificar os perfis de inibição de 14 drogas. Entre essas drogas, a ciclosporina A, o cetoconazol e o verapamil foram escolhidos como fortes inibidores da P-gp. Esses inibidores foram extensivamente caracterizados por seu significativo potencial inibitório da P-gp, que leva à modulação do transporte da digoxina e da rodamina 123 [27, 29, 30]. Como esperado, essas drogas causaram as maiores retenções de rodamina 123 em células RPTEC/TERT1. Em contrapartida, não foi observado aumento na retenção de R123 com a varfarina, que foi utilizada como controle negativo, confirmando a confiabilidade do modelo RPTEC/TERT1. Curiosamente, entre todas as drogas testadas, os DOACs – incluindo etexilato de dabigatrana, apixabana e rivaroxabana – causaram aumentos distintos na retenção de R123, embora não tenham sido previamente caracterizados como inibidores, apenas substratos de P-gp [31, 32]. Essa observação pode ser devido à existência da chamada inibição "competitiva", onde as drogas podem interagir com os mesmos sítios de ligação da P-gp. Os sítios mais bem caracterizados para a P-gp são o sítio H (para a ligação de Hoechst 33342) e o sítio R (para a ligação da rodamina 123). No entanto, vários outros sítios de ligação de drogas desconhecidos podem desempenhar um papel nessas interações, o que poderia explicar os diferentes efeitos dos DOACs no acúmulo de R123 [33, 34]. A inibição da P-gp observada para um determinado medicamento é, portanto, dependente do substrato usado durante os estudos in vitro [28, 35]. O uso de diferentes substratos de P-gp que interagem com diferentes sítios de ligação de drogas deve, portanto, ser considerado para descrever com precisão as supostas potências inibitórias de P-gp de drogas. Também é interessante notar que várias condições da triagem de rodamina 123 também foram realizadas em células Caco{44}} para comparar as células RPTEC/TERT1 com um modelo de referência em estudos de transporte de drogas. Como esperado, ciclosporina A, verapamil e nilotinibe causaram os maiores aumentos na retenção de rodamina. Os mesmos perfis de inibição foram observados com células Caco{46}} e RPTEC/TERT1. No entanto, os aumentos na retenção de rodamina 123 gerados pelas interações no modelo Caco{49}} foram maiores do que os observados em células RPTEC/TERT1, sugerindo uma diferença potencial na expressão da glicoproteína P entre os modelos. No estudo, um segundo método foi usado para avaliar e confirmar o potencial de inibição da P-gp por drogas.
CISTANCHE VAI MELHORAR A DIÁLISE RENAL/RENAL
Com base no ensaio de acúmulo de rodamina 123, quatro drogas foram escolhidas para determinar seus efeitos dependentes da concentração no acúmulo intracelular de apixabana e rivaroxabana. Foi demonstrado que a P-gp desempenha um papel principal no efluxo de apixabana e rivaroxabana [32, 36]. Os valores de IC50 de nilotinib, crizotinib e cetoconazol foram, portanto, avaliados, com DOACs selecionados como drogas "vítimas". Até onde sabemos, este estudo é o primeiro a realizar estudos de acumulação intracelular com DOACs em humanosrenalcélulas. Os valores de IC50 obtidos para nilotinib e crizotinib estavam de acordo com seus perfis de inibição obtidos a partir do ensaio de acumulação de rodamina 123. O nilotinibe, que causou forte aumento na retenção de R123, apresentou o menor valor de IC50 para os dois DOACs, confirmando seu alto potencial de inibição. Este resultado também está de acordo com um estudo anterior que mostrou um aumento dependente da concentração no acúmulo intracelular de [3H]-paclitaxel em células MDR1-transfectadas, sugerindo que ele possui um perfil inibidor [37]. Para o crizotinib, o ensaio R123 mostrou potencial inibitório moderado, com um aumento menor na retenção de R123 do que o causado pelo nilotinib. Esta observação é apoiada por um estudo anterior onde o crizotinib aumentou o acúmulo intracelular de R123 e doxorrubicina em células transfectadas MDR1-[38]. Este resultado também está de acordo com os valores de IC50 determinados com DOACs, que foram superiores aos valores correspondentes para nilotinib, confirmando seu perfil moderado de inibição. No entanto, é interessante notar que uma concentração de 10 µM de nilotinib ou crizotinib não causou os mesmos aumentos na retenção de rodamina 123 e DOACs. Na triagem de rodamina, o nilotinib aumentou a retenção do substrato em cerca de 71%, enquanto foi de cerca de 40% para os DOACs. Em contraste, o crizotinib causou um pequeno aumento na retenção de rodamina (23 por cento), mas maiores aumentos na retenção de DOACs (cerca de 50 por cento) na mesma concentração. Conforme discutido anteriormente, esta observação pode ser explicada por diferenças nos sítios de ligação em P-gp. Sabe-se que muitos fármacos interagem e competem com o sítio de ligação H ao invés do sítio de ligação R (que é onde a rodamina 123 se liga) e vice-versa [39]. Curiosamente, o cetoconazol, que é conhecido por ser um forte inibidor da P-gp, causou um aumento ligeiramente menor na retenção de rodamina 123 do que o nilotinib (66 por cento versus 71 por cento, respectivamente). No entanto, um valor semelhante foi observado com células Caco{28}}, onde a presença de cetoconazol causou um aumento de 60 por cento no acúmulo de R123 [40]. O acúmulo intracelular de DOACs para determinação dos valores de IC50 também apresentou valores maiores em relação ao nilotinibe e crizotinibe. Curiosamente, a maioria dos valores de IC50 encontrados nos modelos LLC-PK1 ou Caco{36}} usando digoxina como substrato P-gp estavam entre 3 e 4 µM para cetoconazol [41, 42]. Esses valores são bem diferentes dos encontrados no presente estudo (16,5 µM e 16,9 µM com apixabana e rivaroxabana, respectivamente). Esta observação confirma que a escolha do substrato e do modelo utilizado são infuências cruciais na determinação do potencial inibitório da P-gp. Além disso, um estudo recente relatou que os níveis de expressão de transportadores ABC em modelos celulares in vitro têm impacto nos ensaios de transporte de drogas e, portanto, na avaliação de DDIs relacionados à P-gp [43]. De fato, a determinação dos valores de IC50 para verapamil usando rivaroxabana como substrato P-gp revelou uma heterogeneidade entre os modelos de células MDCKMDR1 e Caco{53}}, com valores de IC50 de 6,94 µM e 21,2 µM, respectivamente [43]. Além disso, o efeito dependente da concentração de nilotinib no acúmulo intracelular de apixabana e rivaroxabana também foi investigado em células Caco{61}} neste estudo. Curiosamente, os valores de IC50 para nilotinibe foram signifcativamente mais altos em células Caco-2 do que em células RPTEC/TERT1. Essa observação pode ser explicada pela diferença na expressão da P-gp entre esses modelos. Além disso, sabe-se que a distribuição da P-gp depende do tecido considerado. Fallon et ai. demonstraram que o nível de P-gp foi maior emrimdo que no tecido hepático em humanos [45]. Por outro lado, o nível de expressão da P-gp parece ser maior no intestino do que norimtecido [46]. O uso de células humanas como o modelo RPTEC/TERT1, que não superexpressam transportadores, poderia fornecer dados adicionais. Esses dados podem ser usados e imputados em modelagem farmacocinética de base fisiológica (PBPK) integrando vários parâmetros, como a quantidade de P-gp em um tecido ou modelo in vitro ou valores de IC50.
Embora os valores de IC50 encontrados para cetoconazol no modelo RPTEC/TERT1 tenham sido superiores aos observados na literatura, a razão [I1]/IC50 - validada como preditor de potenciais DDIs clinicamente relevantes para medicamentos administrados por via oral - mostrou valores altos que estavam acima do limite de 0,1 definido pelo FDA. Este resultado está de acordo com um estudo clínico que mostrou um aumento de duas vezes na exposição ao apixabano com a coadministração de cetoconazol [44]. Em conjunto, todos esses resultados demonstram que o modelo RPTEC/TERT1 é uma ferramenta promissora para avaliar o potencial inibitório da P-gp.
CISTANCHE VAI MELHORAR A DOR RENAL/RENAL
Conclusão
Nosso estudo demonstrou que a aplicação do modelo RPTEC/TERT1 é conveniente para avaliar os potenciais inibitórios da P-gp de várias classes de drogas. Os ensaios de acumulação de rodamina 123 permitiram a realização de uma triagem inicial da droga. No entanto, os potenciais inibitórios da P-gp de drogas que não interagem com o sítio R da P-gp também devem ser investigados usando substratos adicionais para confirmar as previsões. Os valores de IC50 determinados a partir do acúmulo intracelular de apixabana e rivaroxabana estão de acordo com os perfis de inibição observados com rodamina 123. Além disso, o uso de cetoconazol e varfarina como um forte inibidor e um não inibidor da P-gp, respectivamente, confirmou a confiabilidade do modelo RPTEC/TER1 quando utilizado para obter dados in vitro sobre os potenciais inibitórios de fármacos em relação à P-gp. Por fim, a comparação dos resultados obtidos com o modelo RPTEC/TERT1 com os obtidos com células Caco{12}} destacou a importância da realização de estudos in vitro em diferentes modelos celulares para confirmar o perfil inibitório de um determinado fármaco.
