Metabolismo in vitro e in vivo do extrato de Cistanche Tubulosa em ratos depressivos normais e crônicos induzidos por estresse imprevisível

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et ai

ABSTRATO

Cistanche tubulosa, uma espécie de Cistanches Herba, foi recentemente confirmada como tendo eficácia antidepressiva em ratos de estresse imprevisível (CUS) ao restaurar a homeostase da microbiota intestinal. Neste trabalho, pretendemos explorar o perfil metabólico de C. tubulosa em ratos modelo de depressão normal e induzida por CUS in vitro e in vivo. Usando UPLC-Q-TOF-MS, o metabolismo gastrointestinal in vitro deExtrato de Cistanche tubulosa(CTE) foi avaliada em ratos normais e CUS. Ao mesmo tempo, o metabolismo in vivo de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em ratos normais e deprimidos também foi investigado em urina e fezes de ratos. Um total de 20 e 26 metabólitos foram caracterizados do metabolismo in vitro e in vivo em ratos normais e CUS, respectivamente. CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foi metabolizado em agliconas e produtos de degradação de glicosídeos feniletanóides (PhGs) e glicosídeos iridóides, seja pela microbiota intestinal normal ou deprimida de ratos in vitro. Metabólitos de fase II de agliconas e produtos de degradação de PhGs e glicosídeos iridóides foram os principais metabólitos na urina e fezes de ratos. Além disso, a capacidade metabólica de gerar glicosídeos e agliconas secundários na microbiota intestinal de ratos depressivos foi muito mais fraca do que na microbiota intestinal normal de ratos, o que foi atribuído às hidrolases de glicosídeos desordenadas produzidas pela microbiota intestinal em ratos deprimidos com CUS. Os resultados deste estudo lançaram as bases para a compreensão do processo metabólico e do mecanismo terapêutico da propriedade antidepressiva da CTE.

Palavras-chave: Cistanche tubulosa, DepressãoMetabolismo, In vitro, In vivo, Microbiota intestinal

1. Introdução

Cistanches Herba é oficialmente registrado como os caules secos e suculentos de Cistanche deserticola (YC Ma) e C. tubulosa (Schrenk), que é usado para tratar deficiência renal, impotência, infertilidade feminina, morbidleucorréia, metrorragia profusa e constipação senil [1]. Estudos farmacológicos modernos mostraram que Cistanches Herba possui várias atividades biológicas como anti-neurodegeneração, imunorregulação e anti-inflamatória [2,3]. Nossas investigações anteriores verificaram queExtrato de Cistanche tubulosa(CTE), que consiste em 48,6 por cento de glicosídeos feniletanoides (PhGs), 6,9 por cento de glicosídeos iridóides e 20,0 por cento de sacarídeos totais, podem aliviar marcadamente os sintomas depressivos de ratos depressivos induzidos por estresse imprevisível crônico (CUS) por restaurando a homeostase da microbiota intestinal [4]. Estudos recentes indicam que alterações na composição da microbiota intestinal estiveram associadas ao desenvolvimento e progressão da depressão [5,6]. As abundâncias relativas dos gêneros microbianos foram marcadamente perturbadas em ratos modelo CUSdepressivos em comparação com controles normais [7]. Em pacientes deprimidos, a diversidade e a riqueza da microbiota intestinal também foram significativamente alteradas [8]. Além disso, vários compostos, incluindo glicosídeos feniletanóides (PhGs) e glicosídeos iridóides foram considerados como os principais constituintes de Cistanches Herba [2,3], que foram facilmente metabolizados em seus glicosídeos secundários e agliconas, incluindo hidroxitirosol (HT), 3,4-dihidroxifenetil glicosídeo, ácido geniposidico desglicosilado, etc. pela microbiota intestinal humana. Esses metabólitos são mais facilmente absorvidos pelo intestino e exercem atividade biológica consistente com o componente protótipo[9–11]. Assim, acreditamos que durante a ocorrência e desenvolvimento da depressão, a perturbação da estrutura da microflora intestinal afetará inevitavelmente o metabolismo dos medicamentos orais tradicionais chineses (MTCs) no trato gastrointestinal, além de afetar o estado fisiológico do hospedeiro. A maioria dos dados metabólicos existentes de Cistanches Herba vem de estudos metabólicos em animais saudáveis[12–15]. Portanto, seria de maior significância clínica investigar o perfil metabólico do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)no estado patológico em elucidar seus componentes bioativos e compreender o mecanismo de ação para sua eficácia antidepressiva.

No presente estudo, pretendemos caracterizar os perfis metabólicos do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em ratos modelo de depressão induzida por CUS e saudáveis ​​por cromatografia líquida de ultra-eficácia quadrupolo espectrometria de massa de tempo de voo (UPLC-Q-TOF-MS). Suco gástrico, fluido intestinal e microbiota de ratos patológicos normais e depressivos têm sido utilizados para simular o processo metabólico do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)no trato gastrointestinal in vitro, de forma independente e sequencial. Metabólitos in vivo também são elucidados após administração oral de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em ratos normais e CUS. Este estudo fornece novos insights sobre o metabolismo e metabólitos ativos de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)para depressão.

2. Materiais e métodos

2.1. Material

Caules secos de C. tubulosa foram coletados no condado de Hetian (Xinjiang, China). As amostras de espécimes comprovantes foram autenticadas pelo Prof. Xiaobo Li e depositadas no herbário da Escola de Farmácia da Universidade Shanghai Jiao Tong (Xangai, China). O método de extração foi usado conforme especificado em nossa publicação anterior [4]. oExtrato de Cistanche tubulosa(CTE) amostras foram armazenadas a 4 graus e redissolvidas com água estéril antes do uso. As soluções de água estéril do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)A amostra foi então filtrada através de uma membrana de 0,22 μm, e os filtrados foram coletados em tubos estéreis.

Echinacoside foi fornecido pelo laboratório do Dr. Pengfei Tu, Peking University (Pequim, China). Acteoside, isoacteoside, 2'-acetilacteoside e cistanoside A foram adquiridos de Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, China). Hidroxitirosol, ácido cafeico, 3,4-ácido dihidroxibenzenopropiônico, 3-ácido hidroxifenilpropiônico e 3-ácido fenilpropiônico foram adquiridos da Aladdin IndustrialInc. (Xangai, China). A pureza de cada componente foi determinada como sendo > 95 por cento por HPLC-UV. O acetonitrilo grau HPLC foi adquirido da Merck (Darmstadt, Alemanha). A água deionizada foi preparada a partir de água destilada usando um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA). Todos os demais reagentes e produtos químicos utilizados eram de grau analítico.

2.2. Experimentos com animais

Ratos machos Sprague-Dawley (200 ± 20 g) foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Pequim, China) e alojados no Centro de Animais de Laboratório da Universidade JiaoTong de Xangai (Xangai, China). Os animais foram alojados em grupo sob temperatura ambiente controlada (25 ± 2 graus, 55 ± 10 por cento de umidade relativa) com um ciclo claro-escuro de 12:12 h. Os ratos tiveram acesso livre a ração e água regulares de laboratório para ratos durante 1 semana. As instalações e protocolos para animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Shanghai Jiao Tong University (Xangai, China).

Após uma semana de aclimatação, doze ratos ingênuos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n=6), o grupo controle e o grupo estresse crônico imprevisível (CUS). Ratos CUS foram desenvolvidos como em nosso relatório anterior [4], que foram submetidos a uma variedade de estressores: ruído branco (100 dB) por 1 h, iluminação estroboscópica de baixa intensidade durante a noite (120 flashes/min), privação de água por 24 h, vazio garrafas de água por 1 h (após privação hídrica), privação alimentar por 24 h, contenção física (1-2 h), natação forçada (5 min), gaiola suja por 24 h (200 mL de água em 100 g de cama de serragem), pinça de cauda ( 1 min), choque por 30 min, inclinação da gaiola de 45 graus por 24 h e iluminação noturna (12 h). Os estressores foram aplicados continuamente e aleatoriamente por 4 semanas, o arranjo detalhado é descrito na Tabela S1. Após 4 semanas de estresse, o teste de preferência de sacarose, teste de campo aberto e teste de alimentação suprimida por novidade foram realizados conforme descrito anteriormente [4]. O esboço do CUS e do teste comportamental é mostrado na Fig. S1. Após os testes comportamentais, pelo menos 4 pastilhas fecais foram obtidas de cada rato e colocadas em tubos cônicos estéreis para análise in vitro do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)metabolismo.

2.3. Metabolismo gastrointestinal do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)por rato normal e CUS in vitro

2.3.1. Metabolismo do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em sucos gástricos e intestinais simulados

Cinquenta miligramas de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foram adicionados a 10 mL de suco gástrico simulado e suco intestinal, respectivamente. Então CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foi incubado a 37 graus por 4 h em suco gástrico e 6 h em suco intestinal. A mistura cultivada (1 mL) foi extinta com 3 mL de n-butanol saturado de água imediatamente em 0 e 4 h em suco gástrico, e em 0 e 6 h em suco intestinal. O método de processamento da amostra utilizado foi o descrito anteriormente [9].

2.3.2. Metabolismo do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)por microbiota intestinal de rato normal e CUS

Amostras frescas de fezes de ratos normais e CUS foram primeiramente misturadas e homogeneizadas com 25 vezes o volume de caldo GAM. Os sedimentos foram removidos por filtração através de três pedaços de gaze. A suspensão foi então incubada a 37 graus em uma incubadora anaeróbica na qual o ar foi substituído por uma mistura gasosa (H2 5 por cento , CO2 10 por cento , N2 85 por cento ). Cinquenta miligramas de CTE foram adicionados a 5 mL de suspensão fecal normal e CUS de rato separadamente, e a suspensão foi incubada a 37 graus por 48 h. A mistura cultivada foi removida e extraída com n butanol saturado em água em 0, 12, 24 e 48 h. O método de processamento da amostra foi descrito anteriormente [9].

2.3.3. Metabolismo sequencial do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)pelo suco gástrico, suco intestinal, microbiota intestinal de rato normal e CUS

Em primeiro lugar, 100 mg de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foi adicionado a 1{{10}} mL de suco gástrico simulado e incubado a 37 graus por 4 h. Toda a reação foi extinta por 3 vezes o volume de n-butanol saturado com água e centrifugado a 3000 rpm por 15 min, seguido de evaporação do sobrenadante sob uma corrente de nitrogênio gás a 37 graus. Em segundo lugar, o resíduo foi redissolvido em 0,4 mL de água estéril, adicionado a 8 mL de suco intestinal simulado e incubado a 37 graus por 6 h. A amostra com suco gástrico foi preparada da mesma maneira. Finalmente, o resíduo foi redissolvido em 0,3 mL de água estéril, adicionado a 6 mL de suspensões fecais de rato normal e CUS respectivamente, e incubado a 37 graus por 48 h em uma incubadora anaeróbica. Um mililitro da reação foi extinta por 3 mL de n-butanol saturado de água imediatamente em 0 e 4 h em suco gástrico, em 0 e 6 h em suco intestinal e em 0, 12, 24 e 48 h na microbiota intestinal de rato . A amostra foi processada de forma idêntica CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em suco gástrico simulado.

2.4. Metabolismo do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)por ratos normais e CUS in vivo

Cada rato nos dois grupos foi então alojado em uma gaiola metabólica individual. Após jejum noturno que permitia apenas acesso livre à água, todos os ratos foram administrados por via oral com 2 mL de água via sonda gástrica. Amostras de urina e fezes em branco foram coletadas de todos os ratos de 0 h a 12 h. Além disso, o CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) foi administrado por gavagem. Amostras de urina e fezes foram coletadas de 0 h às 24 h. Todas as amostras de urina e fezes foram armazenadas a -80 graus imediatamente.

Amostras de urina e fezes de ratos normais e CUS foram pré-tratadas conforme descrito anteriormente [12]. Todas as amostras resultantes foram analisadas por UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Método Analítico

O UPLC foi realizado em um sistema Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, EUA) com uma coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , EUA) por eluição gradiente usando {{10}},1 por cento de ácido fórmico acetonitrila (A) e 0,1 por cento de ácido fórmico em água (B) a uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min . O perfil de gradiente foi: 0–5 min (A: 5–20 por cento), 5–7,5 min (A: 20–30 por cento), 7,5–10 min (A: 30–70 por cento), 10–11 min (A : 70-100 por cento), e foi mantido por 1,5 min. O gradiente foi reciclado de volta para 5 por cento em 0,5 min e foi mantido por 2,5 min para a próxima corrida. O volume de injeção foi de 3 μL. A temperatura do forno da coluna foi ajustada para 35 graus.

A espectrometria de massa foi realizada usando um espectrômetro de massa Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, EUA). A ionização foi realizada no modo eletrospray negativo (ESI−). Os parâmetros MS foram os seguintes: tensão capilar, −2.0 kV; voltagem do cone, 20 V; temperatura de origem, 120 graus ; temperatura de dessolvatação, 500 graus ; fluxos de gás de cone e dessolvatação, 50 e 1000 L/h, respectivamente. Para medição de massa precisa, leucina-encefalina foi usada como massa de bloqueio para gerar um íon [M–H]− (m/z 554,2615). Um experimento MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) em duas funções de varredura foi realizado da seguinte forma: função 1 (baixa energia): m/z 50–1000, tempo de varredura de 0,25 s, atraso entre varreduras de 0,02 s, energia de colisão de 6 eV; função 2 (alta energia): m/z50–1000, tempo de varredura de 0,25 s, atraso entre varreduras de 0,02 s, rampa de energia de colisão de 20–45 eV.

2.6. Processamento de dados

Os dados foram processados ​​usando o software UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, EUA) para identificação de metabólitos dentro dos dados brutos de varredura completa em massa coletados através do MSE. Os compostos foram identificados com base na massa exata, fragmentos em espectrometria de massa de alta energia. O limite de intensidade foi definido como 100,0 contagens. A identificação do alvo, a tolerância de correspondência de fragmentos e outros parâmetros foram definidos automaticamente.

3. Resultados

3.1. Alterações comportamentais em ratos com depressão induzida por CUS

Os ratos com sintomas depressivos induzidos por USC foram avaliados por testes comportamentais, incluindo teste de preferência de sacarose, teste de campo aberto e teste de alimentação suprimida por novidade. O teste t de Student revelou que a preferência à sacarose no teste de preferência à sacarose (p < 0,001),="" a="" distância="" total="" percorrida="" no="" teste="" de="" campo="" aberto="" (p="">< 0,001)="" e="" a="" latência="" para="" comer="" no="" teste="" de="" alimentação="" suprimida="" por="" novidade="" (p="">< 0,01)="" foram="" significativamente="" diferente="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" controle="" após="" 4-semanas="" de="" tratamento="" com="" cus="" (fig.="" 1).="" esses="" achados="" indicaram="" que="" o="" modelo="" de="" estresse="" crônico="" imprevisível="" foi="" desenvolvido="" com="">

3.2. Caracterização dos constituintes químicos do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)

Uma análise abrangente dos constituintes do protótipo do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foi realizado por UPLC-Q-TOF-MS. No total, 27 constituintes do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foram detectados e caracterizados experimentalmente, incluindo 20 PhGs, 5 iridóides e glicosídeos iridóides e 2 oligossacarídeos. Informações detalhadas, incluindo tempo de retenção, MS preciso e íons de fragmentos MS/MS, estão listadas em Informações de suporte (Tabela S2) para fornecer informações sobre a estrutura desses constituintes químicos. UPLC-Q-TOF-MS total de ioncromatograma (TIC) de CTE foi mostrado na Fig. S2.

3.3. Metabolismo gastrointestinal do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)por rato normal e CUS in vitro

Neste estudo, os metabólitos potenciais de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)por ratos normais e CUS in vitro foram detectados a partir dos TICs e identificados com uma combinação de composições elementares e espectros de massa de fragmentos MS/MS após compará-los com as amostras de controle. Todos os metabólitos do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em sucos gástricos e intestinais simulados, a microbiota intestinal de rato normal e CUS estão listadas na Tabela 1.

3.3.1. Metabolismo do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em sucos gástricos e intestinais simulados

Sete metabólitos de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em suco gástrico simulado foram identificados provisoriamente por informações precisas de massa e fragmento de MSE: M1 (m/z315,1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12,2,36 min), M5 (m/z 445,1715, C20H30O11, 2,60 min), M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20,4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, 5,73 min) e M18 (m/z623) .1968, C29H36O15, 5,81 min). Desglicosilação, desidroxilação, desidrogenação e isomerização foram consideradas as principais vias metabólicas para CTE no suco gástrico. M4 e M5 apresentaram peso molecular 2 Da e 16 Da inferior ao seu componente protótipo, decafeoilactosídeo, sendo assim identificados como seus produtos desidrogenados e desidroxilados, respectivamente. M12 foi identificado como um isômero de echinacoside, produzindo os mesmos íons que echinacoside em m/z 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237.

Os mesmos metabólitos foram detectados após CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)incubação em suco intestinal. Vale ressaltar que o grupo cafeoil na posição C-6′ em PhGs foi prontamente metabolizado por enzimas digestivas no suco intestinal para produzir seus metabólitos decafeil e ácido cafeico.

3.3.2. Metabolismo do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)por microbiota intestinal de rato normal e CUS

Um total de 20 metabólitos biotransformados a partir de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)na microbiota intestinal normal de ratos foram detectados e identificados (Fig. 2). A partir dos resultados, observou-se que os PhGs foram degradados em aglicona hidroxitirosol (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min), e ácido cafeico(CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), então eles foram ainda metabolizados para M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4,4,35 min), e M11 (m/z 165,0552) , C9H10O3, 4,36 min) através de desidroxilação, redução e metilação. Além disso, as vias metabólicas centrais que produziram metabólitos diretos de compostos protótipos de PhG a partir de CTE na microbiota intestinal normal de ratos são redução, metoxilação, deglicosilação, decafeoil, desidrogenação e isomerização.

Após incubação na microbiota intestinal de ratos com depressão induzida por CUS, CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foi convertido em 20 metabólitos através das mesmas vias metabólicas dos ratos normais.

3.3.3. Metabolismo sequencial da CTE pelo suco gástrico, suco intestinal, microbiota intestinal normal e CUS de ratos

Após incubação sequencial em suco gástrico, suco intestinal, microbiota intestinal de rato normal e CUS, CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foi metabolizado em 14 metabólitos (incluindo 8 com suco gástrico, 7 com suco intestinal, 11 com microbiota intestinal normal e 10 com CUS). Entre estes, M2(HT) e M11 (3-ácido hidroxifenilpropiônico, 3-HPP) foram os metabólitos finais de PhGs após incubação sequencial de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)no suco gástrico, suco intestinal e microbiota intestinal. Não houve diferença significativa nos metabólitos entre ratos normais e CUS.

M8, M9, M14, M17, M19 e M20 foram detectados apenas no metabolismo independente de CTE pela microbiota intestinal de ratos normais e CUS. Esses metabólitos eram principalmente intermediários metabólicos que foram completamente metabolizados em metabólitos finais no estudo do metabolismo sequencial da CTE e, portanto, são difíceis de serem detectados.

3.3.4. Diferenças entre a taxa metabólica de CTE por microbiota intestinal normal e CUS

Para elucidar as diferenças entre a taxa metabólica de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)pela microbiota intestinal de rato normal e CUS, os conteúdos relativos de 27 compostos protótipo e 20 metabólitos após incubação com suco gástrico, suco intestinal, microbiota intestinal de rato normal e CUS foram determinados separadamente e sequencialmente (Tabelas S3 e S4). Os resultados indicaram que embora não houvesse diferenças significativas entre CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)metabólitos de ratos normais e depressivos, foi observada diferença significativa em suas taxas metabólicas. Por exemplo, C2 e C5 foram identificados como 8-ácido epilogânico ou seu isômero. Eles foram completamente metabolizados em amostras normais dentro de 12 h de incubação. Na microbiota intestinal de ratos patologicamente deprimidas, no entanto, eles foram completamente metabolizados após 48 h de incubação. Ficou evidente que a taxa metabólica no rato normal foi mais rápida do que no rato CUS. Resultados semelhantes foram descobertos a partir de C18 (isoacteoside). Além disso, vale ressaltar que a área do pico de M12 (isomerização do echinacoside) e M16 (isomerização do tubuloside A) em amostras normais foi muito maior do que em amostras CUS, indicando que a reação de isomerização do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foi mais prevalente na microbiota intestinal de ratos normais do que na microbiota intestinal de ratos com depressão.

3.4. Metabolismo de CTE por ratos normais e CUS in vivo

Ao comparar amostras biológicas do grupo tratado com CTE com amostras biológicas em branco, um total de 26 metabólitos (composto 1-26) de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foram detectados ratos anormais e CUS (Tabela 2). Cromatogramas UPLC típicos de amostras de urina de rato normal e CUS são apresentados na Fig. 3.

3.4.1. Caracterização dos metabólitos da CTE em ratos normais e CUS

Um total de 18 metabólitos in vivo de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em amostras normais de urina de rato foram identificadas provisoriamente. Metabólitos de degradação de PhGs incluindo HT e CA, e sua sulfatação adicional (composto 1, 2, 3, 5, 8 e 16), metilação (6, 21, 22 e 24) e metabólitos de metoxilação (13 e 14) foram os principais metabólitos na urina normal de rato. Os glicosídeos iridóides foram prontamente metabolizados em agliconas (23, 25 e 26) através da deglicosilação. Vale ressaltar que nenhum componente protótipo foi detectado na amostra normal de urina de rato.

Na amostra de urina de rato depressivo, 22 metabólitos de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foram detectados e caracterizados. Um composto protótipo, 8-ácido epilogânico, foi detectado na urina patológica de ratos. Outros metabólitos estavam de acordo com aqueles encontrados na urina normal de rato, incluindo metabólitos sulfatados (1, 2, 3, 8, 10 e 16), metabólitos metilados (6, 11, 19 e 22), metabólitos metoxilados (13 e 14) de HT e CA, e theaglycones de glicosídeos iridóides (25 e 26).

3.4.2. Caracterização dos metabólitos do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em fezes normais e CUS

Neste estudo, apenas um metabólito (composto 20, 3-HPP) de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foi identificado em fezes normais de ratos. A maioria dos PhGs foi primeiro degradada em CA e, consequentemente, sofreu metabolismo adicional para seu principal metabólito microbiano, 3-HPP. Na amostra fecal do rato CUS, 3 metabólitos foram caracterizados experimentalmente, incluindo 3-HPP sulfatado (composto 16) e HT sulfatado (compostos 2 e 3).

3.4.3. Diferenças entre metabólitos in vivo de CTE em ratos normais e CUS

Após administração oral de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa), os metabólitos in vivo mostraram diferenças óbvias em ratos modelo saudáveis ​​e depressivos. 21 metabólitos (composto 1-3, 5, 6, 8-14, 16, 17 e 19-26) foram detectados em amostras de ratos saudáveis ​​e CUS. O composto 23 (ácido geniposidico deglicosilado) foi identificado apenas em amostras de ratos saudáveis, enquanto os compostos 4 (HT), 7 (8-ácido epilogânico), 15 (3, 4-ácido dihidroxibenzenopropiônico) e 18 ({{ 19}}HPP conjugação de glicuronídeo) foram detectados apenas em amostras de ratos modelo CUS. Em resumo, os constituintes protótipos foram detectados apenas em ratos CUS, enquanto mais metabólitos de fase II foram descobertos em ratos normais.

4. Discussão

Neste estudo, três modelos de incubação in vitro incluindo suco gástrico, suco intestinal, microbiota intestinal de rato normal e CUS foram empregados de forma independente e sequencial para investigar o perfil metabólico gastrointestinal do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em vitro. Verificou-se que PhGs e glicosídeos iridóides em CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foram prontamente metabolizados em seus glicosídeos e agliconas secundários pela microbiota intestinal depressiva de rato induzida por CUS. Depois disso, o metabolismo in vivo de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em ratos normais e CUS também foi verificado. As vias metabólicas propostas para CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em ratos saudáveis ​​e depressivos induzidos por CUS são mostrados na Fig. 4. PhGs, como echinacoside e acteoside, foram metabolizados em HT e CA, e CA sofreu metabolismo adicional para seu principal metabólito microbiano, 3-HPP. HT, CA e 3-HPP foram então metabolizados em seus metabólitos sulfatados, metilados e metoxilados. Glicosídeos iridóides incluindo ácido geniposidico, kankanosídeo A e kankanosídeo N foram metabolizados em suas agliconas através da desglicosilação. Estes demonstraram ainda que PhGs e glicosídeos iridóides em CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foram prontamente metabolizados em glicosídeos e agliconas secundários em ratos CUS. Esses metabólitos normalmente exibem melhor absorção intestinal e biodisponibilidade para serem posteriormente absorvidos pelo sangue para exercer atividade biológica [16-18]. Vale ressaltar que a isomerização foi prevalente para PhGs no trato gastrointestinal, metabólitos relevantes foram identificados após serem comparados com o tempo de retenção de UPLC de seus compostos protótipos com base em um perfil de gradiente de UPLC ideal otimizado.

O ácido cafeico foi o principal produto de degradação do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)pela microbiota intestinal patológica depressiva de ratos. Publicações anteriores relataram que o ácido cafeico produz efeitos antidepressivos no teste de natação forçada em camundongos. Tanto o nível de mRNA do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) no córtex frontal quanto o nível de mRNA de TrkB na amígdala foram significativamente diminuídos após o teste de natação forçada, e a primeira redução foi significativamente inibida pelo ácido cafeico [19]. O hidroxitirosol foi a aglicona de PhGs, que protege a neurogênese e a função cognitiva, prevenindo a regulação negativa da proteína neural BDNF induzida pelo estresse [20]. Assim, é necessário prestar mais atenção a alguns metabólitos bioativos (isto é, HT e CA) transformados pela microbiota intestinal após administração oral.

Além disso, os presentes achados fornecem evidências de que na microbiota intestinal de ratos depressivos, a capacidade metabólica de gerar glicosídeos e agliconas secundários foi marcadamente mais fraca do que a microbiota intestinal anormal de ratos. A razão é provavelmente atribuída às alterações estruturais da microbiota intestinal induzidas pela depressão, que levam à diminuição da atividade das enzimas metabólicas produzidas pela microbiota intestinal [21]. Curiosamente, um estudo anterior mostrou que o filo Bacteroidetes codificou os genes de glicosídeo hidrolase e polissacarídeo liase mais abundantes para a hidrólise de glicosídeos e a clivagem de carboidratos complexos com mecanismo de eliminação [22]. Especificamente, Bacteroides spp. incluindo B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis e B. xylanisolvens apresentou um número total dominante de genes que codificam GHs e PLs. Parabacteroides distasonis também possui as mesmas características [22]. Nossos estudos anteriores confirmaram que 28-estimulação de estresse crônico imprevisível diurno diminuiu a abundância relativa dos gêneros Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas e Weissella, enquanto aumentou Ruminococcus e Deinococcus em ratos [4]. Vale ressaltar que Bacteroides e Parabacteroides foram os dois táxons microbianos mais abundantes, responsáveis ​​por aproximadamente 20% de abundância relativa em ratos normais. Após o tratamento com CUS, as abundâncias relativas de Bacteroides e Parabacteroides caíram drasticamente para aproximadamente 5% em ratos modelo depressivos. Portanto, isso inevitavelmente levará à redução do número total de enzimas GH e PL em ratos CUS, e perturbará ainda mais a reação deglicosilada pela microbiota intestinal depressiva CUS após a administração oral de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)em ratos modelo.

5. Conclusão

No presente estudo, a técnica UPLC-Q-TOF-MS foi estabelecida e aplicada para rastrear e identificar metabólitos deExtrato de Cistanche tubulosaem ratos normais e CUS depressivos in vitro e in vivo. Os resultados mostraram que o CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)foi metabolizado em agliconas e produtos de degradação de PhGs e glicosídeos iridóides pela microbiota intestinal de ratos saudáveis ​​e deprimidos. Após administração oral de CTE(Extrato de Cistanche tubulosa), metabólitos de fase II de agliconas e produtos de degradação de PhGs e iridoidglicosídeos foram encontrados predominantemente na urina de ratos. A capacidade metabólica de gerar glicosídeos e agliconas secundárias na microbiota intestinal depressiva de ratos foi muito mais fraca do que na microbiota intestinal de ratos normais, o que foi atribuído às glicosídeohidrolases desordenadas produzidas pela microbiota intestinal em ratos com CUS deprimidos. desenvolvimento do CTE(Extrato de Cistanche tubulosa)como um potencial antidepressivo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2017YFC1702400).

Apêndice A. Dados Suplementares

Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

De: ' Metabolismo in vitro e in vivo deExtrato de Cistanche tubulosaem ratos depressivos induzidos por estresse imprevisível normal e crônico' porYang Li, et ai

--Diário de cromatografia B 1125 (2019) 121728

Referências

[1] Comissão de Farmacopeia Chinesa, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 ed., China Medical Science Press, Pequim, China, 2015, p. 135 Parte I.
[2] Y. Jiang, P.‑F. Tu, Análise de constituintes químicos em espécies Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970-1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: uma visão geral de sua química, farmacologia e propriedade farmacocinética, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, efeitos antidepressivos deExtrato de Cistanche tubulosaem ratos com estresse crônico imprevisível através da restauração da homeostase da microbiota intestinal, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, eixo intestino-cérebro: como o microbioma influencia a ansiedade e a depressão, Trends Neurosci. 36 (2013) 305-312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Desenvolvimentos recentes na compreensão do papel da microbiota intestinal na saúde e na doença do cérebro, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variações na microbiota intestinal e fenótipo metabólico fecal associado à depressão por sequenciamento do gene 16S rRNA e LC/ Metabolômica baseada em MS, J. Pharm. Biomédico. Anal. 138 (2017) 231-239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transferindo o blues: a microbiota intestinal associada à depressão induz alterações neurocomportamentais no rato, J. Psychiatr. Res. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Metabolismo gastrointestinal humano do extrato de água de Cistanches Herba in vitro: elucidação do perfil metabólico com base na identificação abrangente de metabólitos no suco gástrico, intestinal suco, bactérias intestinais humanas e microssomas intestinais, J. Agric. Química Alimentar. 65 (2017) 7447-7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identificação de metabólitos de echinacoside produzidos por bactérias intestinais humanas usando cromatografia líquida de ultra-efetividade/espectrometria de massa de tempo de voo de quadrupolo, J. Agrícola. Química Alimentar. 63 (2015) 6764-6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Triagem e identificação de três metabólitos glicosídeos feniletanoides típicos de Cistanches Herba por bactérias intestinais humanas usando UPLC/Q-TOF-MS, J. Farmácia. Biomédico. Anal. 118 (2016) 167-176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Rastreamento rápido e identificação das diferenças entre metabólitos de Cistanche deserticola e extrato de água de C. tubulosa em ratos por UPLC- Análise combinada de reconhecimento de padrões Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomédico. Anal. 131 (2016) 364-372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Caracterize sistematicamente os metabólitos de echinacoside e acteoside de Cistanche tubulosa em plasma de rato, bile, urina e fezes com base em UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Cromatogr. 30 (2016) 1406-1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Uma abordagem para identificar metabólitos sequenciais de um glicosídeo feniletanoide típico, echinacoside, baseado em cromatografia líquida-ion trap-time de
análise de espectrometria de massa de voo, Talanta 80 (2009) 572-580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolismo de echinacoside, um bom antioxidante, em ratos: isolamento e identificação de seus metabólitos biliares, Droga Metab. Descarte 37 (2009) 431-438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Entendendo os mecanismos moleculares da interação entre fitoterápicos e microbiota intestinal, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140-1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Absorção e disposição de ginsenosídeos após administração oral administração de extrato de Panax notoginseng a ratos, Drug Metab. Descarte 37 (2009) 2290-2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interações da microbiota intestinal com componentes alimentares funcionais e nutracêuticos, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219-225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, O ácido cafeico atenua a diminuição da expressão de mRNA de BDNF cortical induzida pela exposição a estresse de natação em camundongos, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115-121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, A administração materna de hidroxitirosol melhora a neurogênese e a função cognitiva em pacientes com estresse pré-natal descendência, J. Nutr. Bioquímica. 26 (2015) 190-199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, A influência da microbiota intestinal no metabolismo e toxicidade de drogas, Expert Opin. Droga Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, A abundância e variedade de enzimas ativas de carboidratos na microbiota intestinal humana, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497-504.