Efeitos antioxidantes e anticoagulantes dos glicosídeos fenilpropanóides

para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

Bartosz Skalski, et al.

Abstrato

Plantas holoparasitárias das Orobanchaceae, incluindo Cistanche, Orobanche e Phelipanche spp, são conhecidas por sua riqueza defenilpropanóideglicosídeos(PPG). Descobriu-se que muitos compostos de PPG possuem um amplo espectro de atividades, como antimicrobiana, anti-inflamatória, antioxidante e aprimoradora de memória. Para melhor explorar o potencial de bioatividade de vassouras europeias (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) e dez constituintes fenilpropanóides isolados, investigamos sua ação antirradicalar, efeito protetor contra a oxidação no sistema in vitro do plasma , e influência nos parâmetros de coagulação. Os extratos testados mostraram uma atividade de eliminação de 50 a 70 por cento do poder do Trolox. O extrato OC, rico em acteosídeos, tinha mais de 20 por cento melhor potencial anti-radical do que o extrato PR, que era o único contendo PPGs sem uma porção de catecol do anel B na unidade acil. Além disso, verificou-se que apenas oito PPGs testados(phenilpropanóideglicosídeos)demonstrou potencial antioxidante em plasma humano tratado com H2O2/Fe; no entanto, os três PPGs testados(phenilpropanóideglicosídeos)possui potencial anticoagulante, além de propriedades antioxidantes. Parece que a estrutura dos PPGs, especialmente a presença de porções acil e catecol, está relacionada principalmente às suas propriedades antioxidantes. O potencial anticoagulante desses compostos também está relacionado à sua estrutura química. PPGs selecionados apresentam potencial para o tratamento de doenças cardiovasculares associadas aoxidativoestresse.

Palavras-chave:Broomrape, glicosídeos fenilpropanóides, estresse oxidativo, hemostasia plasmática

CistanchetemFenilpropanóideglicosídeos

Clique para produtos Cistanche

1. Introdução

Oxidativoestresseé amplamente conhecido por seu impacto negativo na saúde dos organismos vivos, incluindo envelhecimento acelerado e alguns tipos de câncer. A ocorrência deoxidativoestresseestá associada a um equilíbrio perturbado entre os mecanismos oxidativos e antioxidantes (incluindo defesa enzimática (catalase, glutationa peroxidase) e não enzimática (glutationa)) nas células do corpo [1]. A superprodução de espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo radicais oxidantes e espécies de casca fechada, é um dos principais mecanismos por trás da formação do estresse oxidativo. No entanto, o efeito biológico causado por ROS depende em grande parte da concentração, tempo de exposição e localização. Em condições normais (baixa concentração), os radicais oxigênio/nitrogênio podem desempenhar o papel de mensageiros secundários, mas em um nível mais alto, eles podem começar a reagir com estruturas biológicas, como membranas celulares [2]. Dentre todas as espécies de EROs, um radical hidroxila (HO.)Oxidativoestressaé conhecido por desempenhar um papel importante em uma série de doenças, incluindo as cardiovasculares. Distúrbios do sistema sanguíneo têm sido correlacionados e/ou precedidos por alterações em vários parâmetros de hemostasia e biomarcadores plasmáticos [1,3].

Por outro lado, muitas substâncias naturais, como polifenóis e ácidos graxos poliinsaturados, têm sido identificadas como potentes antioxidantes capazes de prevenir a formação e/ou diminuir as espécies reativas de oxigênio. Compostos com tais propriedades são encontrados em muitos produtos alimentícios e preparações farmacêuticas de origem vegetal. Uma dieta enriquecida com vegetais e frutas frescas e terapias antioxidantes baseadas em antioxidantes naturais são, portanto, amplamente recomendadas, pois podem reduzir o nível deoxidativoestressee prevenir vários processos fisiopatológicos [4,5]. Os polifenóis vegetais são um grupo diversificado de metabólitos secundários, dentre os quais os ácidos fenólicos ocupam um lugar importante, pois são amplamente distribuídos e exibem uma variedade de efeitos biológicos, como antimicrobiano, antioxidante e anti-inflamatório.Fenilpropanóideglicosídeos(PPGs) são derivados ésteres do ácido hidroxicinâmico e são a principal/única classe de metabólitos secundários presentes em plantas holoparasitárias de Orobanchaceae, incluindo Cistanche, Orobanche e Phelipanche spp. Várias espécies desta família são pragas graves de culturas que os agricultores querem eliminar nos campos (exemplo de Phelipanche ramosa), poucas são utilizadas em farmacologia, enquanto a maioria é de pouca importância para os seres humanos. Herba Cistanche é amplamente utilizado na medicina tradicional asiática no tratamento da deficiência renal e como agente de reforço da imunidade e memória, antienvelhecimento e antifadiga [6]. Análises fitoquímicas de vários grupos de pesquisa demonstraram quefenilpropanóideglicosídeos, como acteoside, echinacoside e podium side, são um dos principais ingredientes ativos da Herba Cistanche [7]. Um estudo recente de várias espécies de vassoura encontradas na Polônia por Jedrejek et al. [8] mostrou que este material vegetal tem uma composição qualitativa semelhante (dominação de PPGs)(phenilpropanóideglicosídeos), além disso, iguala ou mesmo supera a Cistanche spp. em termos de conteúdo de substâncias ativas [8]

O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial antirradicalar e antioxidante, bem como a influência nos parâmetros de hemostasia de três extratos de vassoura (Orobanche caryophyllacea – OC, Phelipanche Arenaria – PA e P. ramosa – PR) ricos em diversos fenilpropanóides, como bem como seus constituintes únicos de PPG. A capacidade antirradicalar foi medida usando 2,2'-azinobis-3-etilbenztiazolina-6-ácido sulfônico/equivalente Trolox (ABTS/TE) e 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH ) testes. ooxidativoestresseno sistema de teste de plasma foi induzida usando um radical hidroxila (H2O2/Fe), então peroxidação lipídica (ensaio de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)), e o nível de grupos de proteínas carbonila e tiol foram medidos. Entre os parâmetros de hemostasia determinados estavam: tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT), tempo de protrombina (TP) e tempo de trombina (TT).

CistanchetemFenilpropanóideglicosídeos

2. Materiais e métodos

2.1. Produtos químicos

2,2-difenil-1-radical picrilhidrazil (DPPH), 2,2'-azinobis-3-etilbenztiazolina-6-ácido sulfônico (ABTS), persulfato de potássio, 6- hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-ácido carboxílico (Trolox), dimetilsulfóxido (DMSO), ácido tiobarbitúrico (TBA), ácido fórmico (grau LC-MS) e H2O2 foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., EUA). O metanol (grau de gradiente HPLC) e acetonitrila (grau LC-MS) foram adquiridos da Merck (Darmstadt, Alemanha). Dez compostos fenilpropanóides testados neste trabalho, incluindo 2'-O-acetilacteoside (97 por cento), 2'-O-acetilpoliumósido (98 por cento), 3-O-metilpoliumósido (96 por cento), acteósido (99 por cento), arena dentro (97 por cento), crenatosídeo (98 por cento), teniposido (99 por cento), poliumosídeo (99 por cento), tubulosídeo A (96 por cento) e wiede maniosideo D (96 por cento) foram previamente isolados por nós da planta abaixo indicada materiais [8]. A pureza dos compostos foi avaliada usando uma análise UHPLC-PDA-MS. A água ultrapura foi preparada internamente usando um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore Co.). Outros reagentes eram de grau analítico e foram fornecidos por fornecedores comerciais nacionais.

2.2. Material vegetal

Plantas com flores de três espécies de vassoura, incluindo Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel e P. ramosa (L.) Pomel foram identificadas pelo prof. Renata Piwowarczyk (Universidade Jan Kochanowski, Kielce, Polônia) e coletado de uma fonte natural na Polônia. Espécimes comprovantes (O. Caryophyllaceae – Chomentowek ´ (50.3349◦N, 20.4000◦E), pastagem xerotérmica, parasitam Galium boreale, maio de 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), pastagem psamófila e pousio, parasitam Artemisia campestris, junho de 2014; P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), campo, parasitam Solanum Lycopersicum, setembro de 2014) estão depositados no Herbário da Universidade Jan Kochanowski em Kielce (KTC). O material vegetal foi liofilizado e finamente moído antes da extração.

2.3. Preparação de extratos de vassouras

O material vegetal em pó (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g e P. ramosa (PR) – 3 g) foi extraído com 80 por cento de MeOH a 40 ◦C e 1500 psi (pressão do solvente ) usando um extrator de solvente acelerado ASE 200 (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA). Os extratos foram evaporados e liofilizados (Gamma 2-16 LSC liofilizador, Christ, Alemanha). A eficiência de extração para OC, PA e PR foi de 55%, 37% e 43% em peso do material vegetal, respectivamente. Devido ao alto teor de carboidratos (dados não mostrados), os extratos brutos foram posteriormente purificados por extração em fase sólida (SPE) na microcoluna Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, EUA). Os açúcares foram removidos com 1% de MeOH, então os compostos de interesse foram eluídos com 80% de MeOH. Após a remoção do solvente, os extratos de OC, PA e PR foram liofilizados (liofilizador Gamma 2-16 LSC) e os rendimentos de purificação de SPE foram de 53 por cento (OC), 67 por cento (PA) e 51 por cento (PR) .

2.4. Características fitoquímicas de extratos de vassouras

Análises qualitativas e quantitativas de extratos de vassoura foram realizadas usando um sistema ACQUITY UPLC (Waters) conectado a um detector de arranjo de fotodiodos (PDA) e um espectrômetro de massa quadrupolo tandem (TQD-MS/MS). Extratos OC, PA e PR liofilizados foram dissolvidos em 50 por cento de metanol a uma concentração de 0,50 mg/mL e então cromatografados em coluna BEH C18 (1{ {21}}0 × 2,1 mm, 1,7 µm, Waters). As condições cromatográficas foram as seguintes: temperatura do forno - 25 ◦C, gradiente linear 10→25 por cento da fase móvel B (0,1 por cento de ácido fórmico em acetonitrila) na fase móvel A (0,1 por cento de ácido fórmico em H2O) ao longo de 12 min, taxa de fluxo – 0,4 mL/min, volume de injeção – 2 μL, faixa UV – 190–490 nm (resolução de 3,6 nm). A análise MS foi realizada no modo de íons negativos com ionização por eletrospray (ESI), usando as seguintes configurações: faixa de varredura 100–1200 m/z; tensão capilar 2,8 kV; voltagem do cone 35 V; temperatura da fonte 150 ◦C; temperatura de dessolvatação 450 ◦C; fluxo de gás de dessolvatação 900 L/h, e fluxo de gás de cone 100 L/h. A aquisição e o processamento dos dados foram realizados usando o software Waters MassLynx 4.1.

Os picos de glicosídeo de fenilpropanóide (PPG) foram identificados por comparação dos dados de LC-MS obtidos com os de compostos previamente isolados [8]. Quantificação de PPGs(phenilpropanóideglicosídeos)em extratos de broomrape foi baseado no método UPLC-UV com detecção em 330 nm, e uma calibração de padrão externo usando acteosídeo (Sigma-Aldrich, Maior ou igual a 99 por cento, HPLC) como padrão de grupo. Uma curva de calibração linear foi preparada em seis concentrações na faixa de 1–200 ug/mL e apresentou boa linearidade (R2 Maior ou igual a 0,999). Os resultados quantitativos representam o valor médio ± SD de três injeções e foram expressos como miligramas de equivalentes de acteosídeo (eq) por grama de extrato (mg de acteosídeo eq/g).

CistanchetemFenilpropanóideglicosídeos

2.5. Atividade anti-radical in vitro

2.5.1. Ensaio de eliminação de radicais ABTS

O teste antirradicalar ABTS foi realizado pelo método descrito por Kontek et al. [9], com pequenas modificações como segue: MeOH 20 por cento foi usado para preparar reagentes (ABTS 7 mM e persulfato de potássio 4,9 mM); as soluções de extratos de OC, PA e PR, em quatro níveis de concentração na faixa de 100-400 ug/mL, e soluções de Trolox, em seis níveis de concentração na faixa de 10-250 ug/mL, foram preparadas com 50 por cento MeOH. A proporção de amostra para ABTS mais solução de trabalho foi de 1:25 (v/v). A absorbância a 734 nm foi medida após 30 min de incubação no escuro usando um espectrofotômetro UV-vis (Evolution 260 Bio, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA).

A inibição da absorbância ( por cento ) foi calculada da seguinte forma: [(Abscontrol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Os Equivalentes de Trolox (TE) de extratos de vassouras foram calculados usando a fórmula TE {{0}} amostra/padrão, onde m é a inclinação das curvas de linha reta (inibição de absorvância vs. concentração). O valor TE da amostra descreve sua atividade normalizada em relação ao Trolox (TEstandard =1.0). Os valores de IC50 para os extratos OC, PA e PR e Trolox foram alcançados experimentalmente, então foram calculados a partir de suas curvas retas (inibição de absorvância vs. concentração) e são expressos em ug/mL.

O ensaio foi realizado em triplicata e os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (DP).

2.5.2. Ensaio de eliminação de radicais DPPH

O teste antirradicalar DPPH foi realizado pelo método descrito por Jedrejek et al. [8] e Brand-Williams et al. [10], com pequenas modificações como segue: as soluções de extratos de OC, PA e PR, em quatro níveis de concentração na faixa de 50-250 ug/mL, e soluções de Trolox, em seis níveis de concentração na faixa de 10- 250 ug/mL, foram preparados com 50 por cento de MeOH. A proporção de amostra para DPPH foi de 1:19 (v/v). A absorbância a 517 nm foi medida após 30 min de incubação no escuro usando um espectrofotômetro UV-vis (Evolution 260 Bio).

A inibição da absorbância ( por cento ) foi calculada da seguinte forma: [(Abscontrol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Os valores de Trolox Equivalent (TE) e IC50 das amostras de teste foram calculados da mesma maneira que no teste ABTS (Seção 2.5.1). O ensaio foi realizado em triplicata e os resultados são apresentados como média ± desvio padrão.

2.6. Soluções de estoque de compostos e extratos vegetais testados para experimentos com plasma humano

As soluções de estoque dos compostos testados e extratos de plantas foram preparadas em 50 por cento de DMSO. A concentração final de DMSO nas amostras testadas foi inferior a 0,05 por cento e seus efeitos foram determinados em todos os experimentos.

2.7. Isolamento de plasma humano

Sangue humano, ou plasma, foi obtido de seis doadores regulares (homens e mulheres não fumantes) para um banco de sangue (Lodz, Polônia) e um centro médico (Lodz, Polônia). O sangue foi coletado como uma solução de CPD (citrato/fosfato/dextrose; 9:1; v/v sangue/CPD) ou solução de CPDA (citrato/fosfato/dextrose/adenina; 8,5:1; v/v; sangue/CPDA). Os doadores não haviam tomado nenhum medicamento ou substância viciante (incluindo tabaco, álcool e suplementação antioxidante) por pelo menos duas semanas antes da doação. Nossa análise das amostras de sangue foi realizada sob as diretrizes da Declaração de Helsinque para Pesquisa em Seres Humanos e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Experimentação Humana da Universidade de Lodz. O plasma foi preparado por centrifugação de sangue humano fresco a 4500 x g por 25 min à temperatura ambiente. A concentração de proteína foi calculada medindo-se a absorbância das amostras testadas em 280 nm, de acordo com o procedimento de Whitaker e Granum [11].

CistanchetemFenilpropanóideglicosídeos

2.8. Marcadores de estresse oxidativo no plasma humano

2.8.1. Medição da peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica plasmática foi quantificada medindo-se a concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A concentração de TBARS foi calculada usando o coeficiente de extinção molar (ε =156,000 M− 1cm− 1). O método é descrito mais detalhadamente em outro lugar [12,13].

2.8.2. Medição do grupo carbonila

O nível de grupos carbonila foi calculado usando o coeficiente de extinção molar (ε=22,000 M− 1 cm− 1) e foi expresso como nmol de grupos carbonila/mg de proteína plasmática, de acordo com Bartosz [13 ] e Levine et al. [14].

2.8.3. Determinação do grupo tiol

O conteúdo do grupo tiol nas proteínas plasmáticas foi medido espectrofotometricamente usando um SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Alemanha) por absorbância a 412 nm com ácido 5,5'-ditiol-bis-(2- nitrobenzóico). O método é descrito com mais detalhes em outro lugar [15-17].

2.9. Parâmetros de hemostasia

2.9.1. A medição do tempo de protrombina (PT)

O PT foi determinado coagulometricamente usando um Optic Coagulation Analyzer (modelo K-3002, Kselmed, Grudziadz, Polônia) de acordo com Malinowska et al. [18].

2.9.2. A medição do tempo de trombina (TT)

O TT foi determinado coagulometricamente usando um Optic Coagulation Analyzer (modelo K-3002, Kselmed, Grudziadz, Polônia), de acordo com o método descrito por Malinowska et al. [18].

2.9.3. A medição do tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT)

O APTT foi determinado coagulometricamente usando um K-3002 Optic Coagulation Analyzer (Kselmed, Grudziadz, Polônia) de acordo com Malinowska et al. [18].

2.10. Análise de dados

O teste Q-Dixon foi realizado para eliminar dados incertos. Os dados foram testados para distribuição normal com o teste de Shapiro-Wilk e igualdade de variância com o teste de Levene. Diferenças estatisticamente significativas foram identificadas por ANOVA, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey ou pelo teste de Kruskal-Wallis. As comparações foram consideradas significativas em p < 0,05.="" os="" valores="" são="" apresentados="" como="" médias="">

3 Resultados e discussão

Dez anteriormente isolados por nósfenilpropanóideglicosídeos[8], incluindo 2'-O-acetilacteoside, 2'-O-acetilpoliumósido, 3-O-metilpoliumósido, acteoside, arena inside, crenatoside, pheliposide, podium side, tubuloside A e wiedemaniside D, juntamente com três extratos de vassoura (Orobanche Caryophyllaceae (OC), Phelipanche são naria (PA) e P. ramosa (PR)) foram atualmente estudados para alíviooxidativoestressee propriedades anticoagulantes em um sistema de plasma humano. As estruturas químicas dos fenilpropanóides testados são apresentadas na Fig. 1, e, como pode ser visto, todos eles são construídos de acordo com um padrão semelhante, com as mesmas/semelhantes subunidades: hidroxitirosol, monossacarídeos (glicose, ramnose e/ou xilose) e ácido hidroxicinâmico. A maioria dos compostos de PPG examinados são substituídos por ácido cafeico, mas este pode ser substituído por ácido cumárico ou ferúlico.

Além dos compostos individuais de PPG, três extratos de broomrape – OC, PA e PR, que são misturas de vários PPGs(phenilpropanóideglicosídeos)e serviram anteriormente como material de partida para o isolamento do composto, também foram incluídos no estudo biológico. Outra razão para selecionar três espécies diferentes foi a grande diferença no perfil fitoquímico entre elas, como pode ser visto na Figura 2. Uma comparação mais detalhada dos extratos OC, PA e PR, incluindo os dados quantitativos, é apresentada na Tabela 1. Acteoside foi o principal constituinte do extrato de O. Caryophyllaceae (690 mg/g), teniposido e arena dentro dominado em P. Arenaria (juntos 550 mg/g), enquanto poliumósido e seu derivado acetilado foram os metabólitos mais importantes em Extrato de P. ramosa (juntos 640 mg/g). Os extratos examinados também diferiram no conteúdo global de fenilpropanóides, a maior quantidade foi encontrada em OC (810 mg/g), um pouco menor em PR (795 mg/g) e menor em PA (685 mg/g). Além disso, é digno de nota que a presença de PPGs com outras porções que não cafeoil, como cumaroil ou feruloil, foi detectada apenas no extrato de P. ramosa, onde esses compostos constituíram cerca de um sexto do total de PPGs (cerca de 120 mg/ g) (Tabela 1).

Estudos anteriores da atividade antirradicalar defenilpropanóideglicosídeospor Heilmann et ai. [19] e Jedrejek et al. [8], incluindo cerca de 30 PPGs diferentes(phenilpropanóideglicosídeos)como o acteosídeo, isoacteosídeo e crenatosídeo, revelaram sua forte relação com a estrutura das porções acil (ácido fenólico e tirosol). Em geral, a modificação ou substituição da fração catecol da unidade acil resultou em uma diminuição significativa na atividade de eliminação contra espécies reativas de oxigênio (ROS) e radical DPPH. No estudo atual, o potencial antirradical in vitro de três extratos de vassoura (OC, PA e PR) foi examinado com ensaios ABTS e DPPH, e os resultados foram comparados entre si, bem como com a atividade de componentes individuais de fenilpropanóides medidos em nosso estudo anterior [8]. Os resultados foram expressos em valores equivalentes de Trolox (TE) e IC50 (Tabela 2). Em geral, todos os três extratos foram bons captadores de radicais ABTS e DPPH, mas também foram observadas diferenças entre as amostras testadas (TE estimado estava na faixa de 0,5–0,7; 1,0 foi o equivalente de Trolox). A atividade de eliminação de antirradicais das amostras foi na seguinte ordem: Trolox > OC > PA > PR. O extrato de Orobanche Caryophyllaceae (IC50=155–275 µg/mL) teve atividade 20% maior do que o extrato de Phelipanche ramosa (IC50=200–320 µg/mL).

A atividade de eliminação de radicais mais alta relatada do extrato de OC pode ser explicada pelos PPGs mais altos(phenilpropanóideglicosídeos)conteúdo nesta amostra, bem como à entrada de acteosídeo, seu ingrediente dominante, que de acordo com a pesquisa anterior [8,19] é um dos mais fortes captadores de radicais livres entre os metabólitos deste grupo (TEDPPH=0 .87; [4]). No entanto, considerando a relação mútua da atividade antirradicalar e o conteúdo de fenilpropanóides nos extratos OC, PA e PR, não foi encontrada correlação simples entre esses dois fatores (r < 0,5),="" indicando="" uma="" entrada="" significativa="" de="" perfil="" qualitativo.="" isso="" está="" relacionado="" principalmente="" ao="" extrato="" de="" p.="" ramosa,="" que="" apesar="" do="" alto="" nível="" de="">(phenilpropanóideglicosídeos)({{0}},8 g/g) foi caracterizado pela menor atividade biológica entre as amostras testadas (TE ~ 0,5). O extrato PR, como mencionado acima, foi a única amostra a possuir os fenilpropanóides com ácidos cumárico ou ferúlico, substâncias sem uma porção catecol do anel B, que foram relatadas como tendo um potencial antioxidante diminuído. Quatro compostos de PPG com ácido cafeico modificado, incluindo 3-O-metilpoliumosídeo, ramose A e wiedemaniosídeo D, testados por nós anteriormente tinham o TEDPPH de cerca de 0,3 [8]. Assim, os resultados atuais estão de acordo e confirmam os achados dos experimentos in vitro antirradicais anteriores em fenilpropanóides.

Como Chen et ai. [20] descrito, está associado à maior capacidade de doação de H ou estabilização do radical por vários grupos funcionais de uma mistura de compostos. Vários elementos estruturais foram identificados como intensificadores da atividade antioxidante direta dos polifenóis, especialmente aqueles associados ao número e posição dos grupos hidroxila. Acredita-se que a atividade de eliminação de radicais livres aumenta com o aumento do número de grupos –OH. No entanto, a posição desses grupos, em uma molécula, tem um impacto ainda maior na atividade exercida. Compostos potentes relativamente estáveis ​​são aqueles que possuem a fração 3,4-dihidroxi em suas estruturas, bem como aqueles que possuem mais de dois grupos hidroxila [21]. A estrutura química da substância antioxidante permite a compreensão do mecanismo de reação antioxidante. Lopez-Mungúia et al. [22] com base em cálculos da teoria funcional da densidade (DFT) determinaram que os PPGs(phenilpropanóideglicosídeos)O mecanismo antioxidante prossegue através de uma transferência sequencial de elétrons com perda de prótons (SPLET). No entanto, Li e col. [23] tentaram explorar os mecanismos dos antioxidantes fenólicos fenilpropanóides, concluíram que os PPGs (acteoside, forsythoside B e poliumoside) podem estar envolvidos em múltiplas vias para exercer a ação antioxidante, potencializando o papel dos açúcares-resíduos.

Estudos mostraram que antioxidantes derivados de plantas são moduladores eficazes da hemostasia em doenças cardiovasculares [24-26]. Várias plantas usadas na medicina tradicional contêm níveis significativos de PPGs [27,28]. Além disso, os PPGs(phenilpropanóideglicosídeos)são conhecidos por terem uma gama de atividades biológicas, incluindo propriedades anti-inflamatórias, anti-nefríticas e anti-hepatóxicas [29-33].

Em seu estudo recente, Jedrejek et al. [8] descreveu o isolamento de PPGs(phenilpropanóideglicosídeos)de três vassouras polonesas e avaliaram sua atividade antioxidante pelo teste DPPH. Com base nisso, o presente estudo avalia se os dez PPGs selecionados isolados dessas plantas poderiam reduziroxidativoestresseem plasma humano tratado com um oxidante biológico forte, ou seja, o doador de radical hidroxila H2O2/Fe, e modula as propriedades de coagulação do plasma in vitro. As propriedades antioxidantes de dez PPGs isolados foram determinadas de acordo com parâmetros selecionados deoxidativoestresse: Nível de TBARS como marcador de peroxidação lipídica, juntamente com níveis de grupos carbonila e tiol, como marcadores de dano oxidativo de proteínas.

Tanto a peroxidação lipídica do plasma quanto os níveis de carbonilação de proteínas no plasma induzidas por H2O2/Fe foram significativamente reduzidos na presença de oito compostos testados, viz. acteoside, crenatoside, 2'-O-acetilacteoside, pheliposide, arena inside, tubuloside A, poliumoside e 3- O-methylpolimuoside, em todas as concentrações testadas (1, 5 e 50 µg/mL); no entanto, nenhum efeito foi observado para dois dos compostos testados, viz. 2'-O-acetilpoliumósido e wiedemaniosídeo D, ou qualquer um dos extratos testados em qualquer concentração (1, 5 e 50 µg/mL). Além disso, nenhum dos compostos testados ou extratos testados foram encontrados para proteger o plasma contra a oxidação do grupo tiol induzida por H2O2/Fe em proteínas (Figs. 3-5). No entanto, os extratos testados podem ser fonte de compostos com diversas propriedades biológicas.

Pela primeira vez, os resultados do presente estudo indicam que oito dos PPGs testados(phenilpropanóideglicosídeos)demonstram potencial antioxidante no plasma humano na presença de espécies reativas de oxigênio exógenas, inibindo a peroxidação lipídica e a carbonilação de proteínas em plasma tratado com H2O2/Fe. Além disso, o 2'-O-acetilpoliumósido e o wiedemaniósido D não apresentaram tal efeito. Em geral, nossos achados são consistentes com experimentos in vitro anteriores com PPGs. Heilmann et ai. [19] e Jedrejek et al. [8] relatam uma correlação entre a estrutura química dos PPGs e suas atividades. Propriedades antioxidantes dos PPGs(phenilpropanóideglicosídeos)parecem estar relacionados principalmente com a estrutura de suas porções acil, ou seja, o ácido fenólico e a unidade fenilpropanóide, incluindo a presença e/ou modificação da porção catecol. Por exemplo, o wiedemaniosídeo D perdeu seu potencial antioxidante em relação ao plasma tratado com H2O2/Fe após a substituição de sua porção cafeoíla por uma porção feruloíla.

As alterações no processo de coagulação geralmente resultam deoxidativoestresse; essas alterações podem modular as funções do sistema cardiovascular e podem levar ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares [1]. Dos dez compostos de plantas e três extratos de plantas testados no presente estudo, tubulosídeo, lado do pódio e 3-O-metilpoliumosídeo e todos os extratos testados demonstraram prolongar significativamente o tempo de trombina em todas as concentrações testadas, viz. 1, 5 e 50 µg/mL (Fig. 6B). No entanto, nenhum desses extratos, nem nenhum dos compostos testados, alterou PT ou APTT (Fig. 6A e C).

Fig. 6. Efeitos dos compostos testados (acteoside, crenatoside, 2'-O-acetilacteoside, pheliposide, arenarioside, tubuloside A, poliumosside, 3-O-methylpoliumosside, 2'-O-cetilpolimuoside, wiedemanioside D) e planta extratos (extrato de P. arenaria - PA, extrato de P. ramosa - PR e extrato de O. caryophyllacea - OC) (1–50 µg/mL) em parâmetros hemostáticos selecionados do plasma: PT (A), TTn (B) e APTT (C). Os dados representam médias ± SEM de seis experimentos independentes.n* p < 0,05="" (vs.="" controle),="" ns="" -="" p=""> 0,05 (vs. controle).

A Tabela 3 compara os efeitos dos PPGs (5 µg/mL) nos biomarcadores deoxidativoestresseem plasma tratado com H2O2/Fe e sua influência na coagulação. Oito dos PPGs testados(phenilpropanóideglicosídeos)demonstrou potencial antioxidante apenas no plasma humano tratado; no entanto, três PPGs testados apresentaram propriedades antioxidantes e potencial anticoagulante. Curiosamente, os resultados do teste DPPH não coincidiram com os obtidos no modelo biológico utilizando plasma humano tratado com H2O2/Fe: o potencial antioxidante dos extratos testados pode ser bloqueado por determinados compostos presentes no plasma.

Em conclusão, nossos achados atuais lançam uma nova luz sobre o potencial antioxidante e as propriedades anticoagulantes dos PPGs(phenilpropanóideglicosídeos). Parece que a estrutura dos PPGs(phenilpropanóideglicosídeos), especialmente a presença de porções acil e catecol, está relacionada principalmente às suas propriedades antioxidantes e anticoagulantes. PPGs selecionados podem ter potencial para o tratamento de doenças cardiovasculares associadas aoxidativoestresse. No entanto, mais experimentos são necessários para determinar as concentrações desses compostos necessárias para os modelos in vivo.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Referências

[1] A. Daiber, S. Chlopicki, Revisitando a farmacologia daoxidativoestressee disfunção endotelial na doença cardiovascular: evidências para terapias baseadas em redox, Free Radic. Biol. Med. 157 (2020) 15–37.
[2] J.-J. Sauvain, A. Setyan, P. Wild, P. Tacchini, G. Lagger, F. Storti, S. Deslarzes, MJ Guillemin, M. Rossi, M. Riediker, Biomarkers ofoxidativoestressee sua associação com a capacidade redutora urinária em trabalhadores de manutenção de ônibus, J. Occupat. Med. Toxicol. 6 (2011) 18–23.
[3] P. Nowak, B. Olas, B. Wachowicz,Oxidativoestressee hemostasia, Post. Bioquímica. 56 (2010) 239-247.
[4] M. Martinez-Huelamo, J. Rodriguez-Morato, A. Boronat, R. de la Torre, Modulação de Nrf2 por polifenóis de azeite e vinho e neuroproteção, Antioxidantes 6 (2017) 73.
[5] S. Amor, P. Chalons, V. Aires, D. Delmas, Extratos polifenólicos de vinho tinto e videira: efeitos potenciais sobre cânceres, Doenças 6 (2018) 1–12.
[6] Z. Li, H. Lin, L. Gu, J. Gao, CM Tzeng, Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): um dos melhores dons farmacêuticos da medicina tradicional chinesa, Front. Pharmacol. 7 (2016) 41–49.
[7] Y. Jiang, P.‑F. Tu, Revisão: análise de constituintes químicos em espécies Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970-1979.
[8] D. Jedrejek, S. Pawelec, R. Piwowarczyk, L. Precio, A. Stochmal, Identificação e ocorrência de glicosídeos feniletanóides e iridóides em seis vassouras polonesas (Orobanche spp. e Phelipanche spp., Orobanchaceae), Fitoquímica 170 ( 2020), 112189.
[9] B. Kontek, D. Jedrejek, W. Oleszek, B. Olas, Atividade anti-radical e antioxidante in vitro de extratos derivados de lúpulo ricos em ácidos amargos e xantohumol, Ind. Crops Prod. 161 (2021) 1–9.
[10] W. Brand-Williams, ME Cuvelier, C. Berset, Uso de um método de radicais livres para avaliar a atividade antioxidante, Lebensm. Wiss. Tecnol. 28 (1995) 25-30.
[11] JR Whitaker, PE Granum, Um método absoluto para determinação de proteínas com base na diferença de absorbância em 235 e 280 nm, Anal. Bioquímica. 109 (1980) 156-159.
[12] B. Wachowicz, nucleotídeos de adenina em trombócitos de aves, Cell Biochem. Funcionar. 2 (1984) 167-170.
[13] G. Bartosz, Druga twarz tlenu, Warsz. PWN 1 (2008) 7.
[14] RL Levine, D. Garland, CN Oliver, A. Amici, I. Climent, AG Lenz, BW Ahu, S. Shaltier, ER Stadtman, Determinação do conteúdo de carbonilo em proteínas modificadas oxidativamente, Métodos Enzym. 186 (1990) 464-478.
[15] DM Joel, J. Gressel, LJ (Eds.), Musselman, Parasitic Orobanchaceae: Parasitic Mechanisms and Control Strategies, Springer, Heidelberg, Alemanha, 2013, pp. 1–10.
[16] Y. Ando, ​​M. Steiner, Sulphydryl e grupos dissulfeto de membranas plaquetárias: determinação de grupos dissulfeto, Biochim. Biofis. Ato 311 (1973) 26-37.
[17] Y. Ando, ​​M. Steiner, grupos sulfidrila e dissulfeto de membranas plaquetárias: determinação de grupos sulfidrila, Biochim. Biofis. Ato 311 (1973) 38-44.
[18] J. Malinowska, J. Kołodziejczyk-Czepas, M. Moniuszko-Szajwaj, I. Kowalska, W. Oleszek, A. Stochmal, B. Olas, frações fenólicas de Trifolium pallidum e Trifolium scabrum partes aéreas no plasma humano protegem contra alterações induzidas por hiper-homocisteinemia, Food Chem. Toxicol. 50 (2012) 4023-4027.
[19] J. Heilmann, I. Calis, H. Kirmizibekmez, W. Schuhly, S. Harput, O. Stiher, Radical scavenger activity offenilpropanóideglicosídeosem leucócitos polimorfonucleares estimulados por FMLP: relações estrutura-atividade, Planta Med. 66 (2000) 746-748.
[20] H. Chen, Y. Zhou, Y. Shao, F. Chen, Ácidos fenólicos livres no vinagre envelhecido Shanxi: mudanças durante o envelhecimento e atividades antioxidantes sinérgicas, Int. J. Food Prop. 19 (2015) 1183-1193.
[21] CA Rice-Evans, NJ Miller, G. Paganga, relações estrutura-atividade antioxidante de flavonóides e ácidos fenólicos, Free Radic. Biol. Med. 20 (1996) 933-956.
[22] A. Lopez-Munguía, ´ Y. Hernandez-Romero, ´ J. Pedraza-Chaverri, A. MirandaMolina, I. Regla, A. Martínez, E. Castillo, Análogos de glicosídeos fenilpropanóides: síntese enzimática, atividade antioxidante e estudo de seu mecanismo de eliminação de radicais livres, PloS One 6 (2011) 20115.
[23] X. Li, Y. Xie, K. Li, A. Wu, H. Xie, Q. Guo, P. Xue, Y. Maleshibek, W. Zhao, J. Guo, D. Chen, Antioxidação e citoproteção de acteosídeo e seus derivados: comparação e química mecanicista, Molecules 23 (2018) 498.
[24] SE Kulling, HM Rawel, Chokeberry (Aronia melanocarpa) – uma revisão sobre os componentes característicos e os efeitos potenciais para a saúde, Planta Med. 74 (2008) 1625-1634.
[25] BJ Mc Even, A influência da dieta e dos nutrientes na função plaquetária, Semin. Pulso. Hemos. 40 (2008) 214-226.
[26] B. Olas, A multifuncionalidade das bagas em relação às plaquetas sanguíneas e o papel dos fenólicos das bagas em distúrbios cardiovasculares, Plaquetas 5 (2016) 1–10.
[27] UB Ismailoglu, I. Saracoglu, US Harput, I. Sahin-Eredemli, Efeitos de glicosídeos fenilpropanóides e iridóides no comprometimento induzido por radicais livres do relaxamento dependente do endotélio em anéis aórticos de ratos, J. Ethnopharmacol. 79 (2002) 193-197.
[28] ZF Bai, Y. Liu, XQ Wang, Investigação de plantas medicinais étnicas Orobanche, Cistanche e Boschniakia, Zhongguo Zhong Yao Zhi 93 (2014) 4548–4552.
[29] K. Hayashi, T. Nagamatsu, M. Ito, H. Yagita, Y. Suzuki, Acteoside, um componente de Stachys sieboldii MIQ, pode ser um agente antinefrítico promissor (3): efeito do acetonido na expressão na molécula de adesão-1 em glomérulos nefríticos experimentais em ratos e células endoteliais cultivadas, Jpn. J. Pharmacol. 70 (1996) 157-168.
[30] Q. Xiong, K. Hase, Y. Tezuka, T. Tani, T. Namba, S. Kadota, Hepatoprotective activity of phenylpropanoids from Cistanche deserticola, Planta Med. 64 (1998) 120-125.
[31] WF Chiou, LC Lin, CF Chen, Acteoside protege as células endoteliais contra radicais livres induzidosoxidativoestresse, J. Pharm. Farmácia. 56 (2004) 743-748.
[32] S. Sahpaz, N. Garbacki, M. Tits, F. Bailleul, Isolation and farmacological activity of phenylpropanoid ésteres de Marrubium vulgare, J. Ethnopharmacol. 79 (2002) 389-392.
[33] L. Lie-Chwen, W. Yea-Hwey, H. Yu-Chang, Ch Shiou, L. Kuo-Tong, Ch Yueh-Ching, W. Wen-Yen, S. Yoh-Chiang, O efeito inibitório dofenilpropanóideglicosídeose glicosídeos iridóides na produção de radicais livres e expressão de 2 integrina em leucócitos humanos, J. Pharm. Pharmacol. 58 (2006) 129-135.