Combinações de drogas sinérgicas de tela à base de silício de medicamentos fitoterápicos: um caso usando Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Módulo de Neuroproteção

Neuroproteção são os mecanismos e estratégias utilizados para proteger contra lesões neuronais ou degeneração no SNC após distúrbios agudos (por exemplo, acidente vascular cerebral ou lesão/trauma do sistema nervoso) ou como resultado de doenças neurodegenerativas crónicas (por exemplo, Parkinson, Alzheimer, Esclerose Múltipla). O objetivo da neuroproteção é limitar a disfunção/morte neuronal após lesão do SNC e tentar manter o nível mais alto

possível integridade das interações celulares no cérebro, resultando em uma função neural intacta. Como pode ser visto na Figura 4, alguns alvos na via da sinapse serotoninérgica estão envolvidos na função de neuroproteção. Por exemplo, a produção de prostaglandinas através de PTGS1 e PTGS2 (também conhecida como COX-1 e COX-2) é um mediador essencial na evocação de mecanismos anti-inflamatórios e novos mecanismos pró-resolução56. Um estudo recente mostrou que a expressão gênica de ADCY5, uma enzima que catalisa a geração de cAMP57, é reduzida pela metilação do promotor em linhagens de células de CHC humano-2-induzidas por COX58. Com base na análise acima, especulamos que o acúmulo de COX-2 pode influenciar a secreção de sAPP, a clivagem da APP clivada pela -secretase que é modulada pelo AMPc e exerce ainda o efeito neuroprotetor59,60. Nossos resultados mostram que a neuroproteção desempenha um papel importante no tratamento da neuroinflamação.

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Validação Experimental

A viabilidade das células BV2 Microglia tratadas pelos compostos

Células da microglia BV2 (8×104 células/ml) são alimentadas com concentrações de 37,5 a 300 μM por mililitro de meio de cultura sem soro dos quatro compostos por 24 h. Consideramos a viabilidade celular do grupo controle cultivado na ausência de soro com menos de 0,1% de DMSO como 100% (Fig. 5 (a – d)). Nenhuma citotoxicidade celular significativa é observada nas dosagens prescritas dos grupos.

Validação da sinergia de medicamentos e potencial efeito antiinflamatório in vitro

Para avaliar melhor os resultados obtidos in silico, quatro compostos cobrindo três pares sinérgicos, nomeadamente isoacteosídeo, 2'-acetilacteosídeo, equinacosídeo e verbascosídeo, são selecionados para examinar seus efeitos sinérgicos de drogas e potencial efeito antiinflamatório usando células BV2 tratadas com LPS. Em particular, conduzimos análises de western blot para expressão da proteína iNOS e COX -2 para confirmar a sinergia e os efeitos antiinflamatórios das combinações de medicamentos previstas.

Como mostrado na Figura 5 (por exemplo), são relatados os níveis de proteínas iNOS e COX-2 no painel de linhagens celulares BV2 testadas. Observamos que no tratamento com isoacteosídeo ou 2'-acetilacteosídeo, as expressões proteicas de iNOS e COX -2 nas células BV2 diminuíram significativamente em diferentes níveis de dose. No entanto, o tratamento com a combinação de isoacteosídeo e 2'-acetilacteosídeo induz um aumento significativo nos fatores inflamatórios iNOS e COX -2 (Fig. 5 (e)). A Figura 5 (f) ilustra quetratamento com equinacosídeo ou verbascosídeo, como agente único, causa uma diminuição na expressão de iNOS e COX-2. Além disso, como esperado, o tratamento com equinacosídeo em combinação com verbascosídeo na concentração de 150 μM resultou em uma diminuição mais pronunciada na

níveis de expressão proteica (iNOS e COX-2), indicando os efeitos anti-inflamatórios sinérgicos desta combinação de medicamentos. Da mesma forma, conforme indicado na Fig. 5 (g), a combinação de equinacósido e 2'-acetilacteosídeo mostra um efeito sinérgico significativo na inibição de COX -2 na concentração de 75 μM ou 300 μM. Porém, para iNOS, na dosagem de 300 μM, a combinação representa acentuada supressão da proteína. Em contraste, descobrimos que não há efeitos de inibição óbvios tanto na iNOS quanto na COX-2 sobre a combinação de isoacteosídeo e 2′-acetilacteosídeo ou equinacosídeo e verbascosídeo na concentração de 75μM (Figura 2 suplementar), além do tratamento com outros pares mostra um efeito muito mais fraco em comparação com os agentes únicos na dosagem de 150 ou 300μM que pode ser visto na Fig.

Resumindo, o estudo in vitro fornece informações adicionais para o rastreio de combinações de medicamentos com efeitos potencialmente anti-inflamatórios e demonstra a fiabilidade da estratégia de rastreio in silico.

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Discussão

A neuroinflamação está implicada na maioria das doenças neurológicas, psiquiátricas e do neurodesenvolvimento, o que não é apenas uma consequência, mas pode ser um gatilho da patologia. No entanto, os tratamentos atuais para neuroinflamatórios são principalmente monoterapias, limitadas por efeitos colaterais bem conhecidos, como sabemos, os inibidores da COX-2 podem levar a defeitos cardiovasculares em resposta ao tratamento a longo prazo, e o tratamento direcionado ao TNF pode causar infecção através imunossupressão. Abordagens terapêuticas combinatórias podem ser imperativas para melhorar o tratamento de doenças complexas com as seguintes vantagens: a robustez da rede combatida e a compensação de bypass, o aumento da eficácia clínica, mantendo a toxicidade humana mínima, e a dosagem reduzida de cada composto63. No entanto, a exploração das combinações sinérgicas de medicamentos entre compostos derivados de medicamentos fitoterápicos com base na farmacologia do sistema é restringida pela possível razão principal para grandes quantidades de compostos.

No trabalho, primeiro ganhamos 63 compostos bioativos potenciais doerva Cistanche tubulosa, cumprindo os critérios (DL Maior ou igual a 0.18) para análise posterior com o auxílio da predição que é indispensável para filtrar moléculas mais promissoras com propriedades desejáveis. Depois de mapear os 133 alvos dos 63 potenciais compostos bioativos para o banco de dados, obtemos 43 alvos relacionados à neuroinflamação, e então a análise de agrupamento do GOBP dos alvos previstos pode provavelmente contribuir para o tratamento da neuroinflamação. O resultado analítico da rede CT apresentou um grau médio por composto de 11.209 e 7.651 por alvo, respectivamente, e 38 deles ajustaram mais de 7 alvos (maior que o grau médio). Por exemplo, o equinacosídeo (mol41) previsto com 7 alvos, o verbascosídeo (mol33), com 9 alvos, ou o tableside B (mol57), com 8 alvos, poderiam desempenhar papéis importantes na neuroproteção, de acordo com a crescente literatura.

Alcançamos alvos terapêuticos diretos, como APP, MAPT (também conhecido como Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 e HTR2A (também conhecido como 5-HT2A), GRIN2B (subunidade 2B do receptor ionotrópico de glutamato tipo NMDA) e GRIA1 (subunidade 1 do receptor ionotrópico de glutamato tipo AMPA) ou alvos potenciais a jusante, como PTGS274 ou NOS275, que estão associados à neuroinflamação ou a várias doenças do sistema nervoso.

A análise da rede Compound-Target-Pathway exibe 12 compostos dos 10 principais pares de drogas através do algoritmo PEA, conectados com os 43 alvos potenciais e as vias ligadas à neuroinflamação, por exemplo, via de sinalização de cálcio, interação ligante-receptor neuroativo ou Via de sinalização TNF e assim por diante. No sistema, estes compostos previstos poderiam atuar não apenas nas proteínas das vias a montante, mas também nas vias a jusante associadas à neuroinflamação e aos biomarcadores inflamatórios, em particular. Além disso, são fornecidas informações adicionais para o rastreio de combinações de medicamentos com efeitos potencialmente anti-inflamatórios e a fiabilidade da estratégia de rastreio in silico é verificada por validação experimental. A via de neuroinflamação é composta pela via da doença de Alzheimer, via de sinalização do cálcio, via de sinalização GnRH, via de sinalização VEGF e sinapse serotoninérgica. Os resultados analíticos nos explicaram claramente que os módulos de morte celular, inflamação e neuroproteção são exemplificados para decifrar o mecanismo deCistanche tubulosa para o tratamento da neuroinflamação.

A neuroinflamação acompanha várias doenças neurodegenerativas que podem ser não apenas uma consequência, mas também um desencadeador de patologia, pelo que se sugere que as terapias anti-inflamatórias sejam uma abordagem de tratamento promissora. Para nossa decepção, embora tenhamos percebido as limitações das monoterapias, a avaliação e os mecanismos subjacentes às terapias combinadas ainda são os principais desafios no desenvolvimento da nova estratégia alternativa. Este trabalho, portanto, poderia oferecer novas oportunidades terapêuticas para a neuroinflamação e abrir um novo caminho para a descoberta de combinações de medicamentos a partir de produtos naturais.

Materiais e métodos

Coleção de Compostos

Um total de 66 ingredientes químicos de Cistanche tubulosa foram coletados manualmente do TCMSP (//lsp.nwu.edu.cn/)76, incluindo 26 glicosídeos feniletanóides, 22 iridóides, 4 lignanas, 7 glicosídeos monoterpênicos, 2 substâncias nitrogenadas, 3 açúcares benzeno acriloil, 1 esterol, 1 cetol. Dado queglicosídeos em Cistanche tubulosageralmente são hidrolisados ​​para liberar aglicona que é então absorvida na mucosa intestinal, portanto, levamos em consideração as moléculas sem glicólico, que são marcadas como _qt. Isso levou à geração dos 103 compostos. Estas moléculas são fornecidas na Tabela Suplementar S1.

Avaliação de semelhança com medicamentos

Para obter os potenciais compostos bioativos da Cistanche tubulosa, avaliamos a semelhança desses ingredientes com medicamentos calculando a similaridade Tanimoto entre os compostos fitoterápicos e as propriedades moleculares médias de todos os produtos químicos no banco de dados do Drugbank. E o modelo de predição DL tem sido aplicado com sucesso em muitos estudos, para selecionar compostos bioativos. No trabalho, o índice DL Maior ou igual a 0,18 dos candidatos é definido como o valor limite para melhor se adequar à análise subsequente.

Previsão de alvo de drogas

A identificação dos alvos de eficácia para os principais compostos continua a ser um passo fundamental para o progresso dos compostos no desenvolvimento de medicamentos. Aqui, duas ferramentas internas: SysDT e WES são realizadas para derivar as informações do alvo molecular para a pesca de drogas. SysDT é um modelo in-solo realizado com a combinação de informações químicas, genômicas e farmacológicas baseadas em duas poderosas ferramentas matemáticas: Random Forest (RF) e Support Vector Machine (SVM) para resolver o problema da identificação de alvos de forma eficaz. O modelo obtido serviu como uma plataforma valiosa para a previsão de interações medicamento-alvo com uma precisão global de 97,3%, uma precisão de previsão ativada de 87,7% e uma precisão de previsão inibida de 99,8%. Para capturar componentes mais promissores, os critérios de filtragem são definidos como valor de RF maior ou igual a 0,7 ou SVM maior ou igual a 0,8 neste estudo.

A similaridade de conjunto ponderada (WES) é um novo modelo computacional poderoso para identificar os alvos diretos da droga nos ingredientes bioativos reais. Como uma ferramenta nova, o modelo obtido tem um bom desempenho na previsão da ligação com uma sensibilidade média de 85% (SEN) e dos padrões não vinculativos com 71% (SPE) com as áreas médias sob as curvas de operação do receptor (ROC, AUC) de 85,2% e uma concordância média de 77,5%. Os alvos obtidos são mapeados no Uniprot para normalizar seus nomes e organismos posteriormente. Aqui, escolhemos apenas os alvos do Homo sapiens para análise posterior. Os alvos candidatos dos compostos selecionados são mapeados no banco de dados CTD para obter suas doenças relacionadas e, finalmente, selecionamos alvos potenciais relacionados à neuroinflamação.

Enriquecimento e análise GO para alvos

Para sondar os processos biológicos envolvidos dos alvos obtidos, mapeamos os alvos para DAVID e os termos com valor P menor que 0,05 são escolhidos nesta seção.

Análise de Combinação de Medicamentos

Em nosso trabalho anterior, uma estrutura de farmacologia de sistema foi explorada para prever combinações de medicamentos em um modelo recém-projetado, denominado Abordagem de Conjunto de Probabilidade (PEA) para analisar a eficácia clínica e os efeitos adversos das combinações de medicamentos. Em detalhe, uma rede Bayesiana integrada com um algoritmo de similaridade foi desenvolvida para modelar as combinações de efeitos moleculares e farmacológicos compostos. A avaliação combinada que abrangeu a eficácia clínica e os efeitos adversos para os pares previstos foi então apresentada. Resumidamente, mostra que a PEA poderia prever a eficácia dos pares com alta especificidade e sensibilidade (AUC{0}}0,90) em nosso trabalho. Neste trabalho, selecionamos as dez principais combinações de medicamentos com base em suas probabilidades de sinergia, que representam a possibilidade de induzir sinergia entre dois compostos.

Construção e análise de rede/caminho

Para investigar as relações entre os ingredientes ativos e as doenças inflamatórias, a rede composto-alvo (CT) e a rede composto-alvo-via (CTP) são geradas pelo Cytoscape 2.8.1, um pacote popular de bioinformática para visualização de redes biológicas e integração de dados. As propriedades quantitativas da rede são analisadas pelos dois plugins Network Analyzer e CentiScaPe 1.2. Na rede gráfica, os nós indicam compostos, alvos ou caminhos, enquanto as bordas codificam a interação droga-alvo. Para explorar ainda mais os efeitos biológicos de como os alvos celulares funcionam através da modulação de múltiplas vias do metabolismo, uma "via" incorporada é montada pelas informações atualizadas sobre a patologia da neuroinflamação. Em primeiro lugar, mapeando-os no banco de dados KEGG, os perfis alvo alcançados são agregados em vários caminhos. Depois de abandonar as seções indiretas, uma via relativamente sintetizada é integrada manualmente devido aos dados patológicos e clínicos.

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Validação Experimental

Preparação de Amostras

Equinacosídeo, verbascosídeo, isoacteosídeo e 2′-acetilacteosídeosão adquiridos da Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, China). As amostras de teste são dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, EUA) para obter 100 mM, como uma solução estoque, e então armazenadas a 4 graus. As diluições finais de DMSO adicionadas ao meio de cultura nunca excederam 0,1%, o que garantiu que não houve efeito na viabilidade celular.

Cultura de células

Células de microglia de camundongo BV2 são originalmente desenvolvidas pelo banco de células da Academia Chinesa de Ciências de Xangai e cultivadas em tarefas de 25 ou 75 cm2 com meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, EUA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) (Gibco BRL, EUA), penicilina G (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 mg/mL) em incubadora umidificada com 5% CO2/95% O2 a 37 graus.

Ensaio de Viabilidade Celular

Células da microglia BV2 são semeadas em uma placa de 96-poços a uma densidade de 1 x 105 células/ml, após incubadas por 18 h, as células são tratadas com 100 ul de meio fresco com ou sem várias concentrações indicadas de amostras de teste para mais 24 horas. O ensaio CCK-8 (BestBio, Shanghai, China) é um método conveniente e confiável para determinar a viabilidade das células. Para eliminar o fundo das amostras de teste, descartamos todo o meio de cultura, após o qual são adicionados 100 ul/poço de meio fresco contendo 10% de solução de CCK-8. Os valores de DO a 450 nm são lidos num leitor de microplacas (Molecular Devices, Califórnia, EUA) após uma incubação de 3 horas a 37 graus e 5% de CO2.

Análise de Western Blot

A proteína celular é extraída de linhagens celulares utilizando um kit Qproteome™ Mammalian Protein Prep (Qiagen, Alemanha) após os procedimentos indicados pelo protocolo do fabricante. O Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, EUA) é aplicado à quantificação de proteínas. Quantidades equivalentes de proteína (50ug) são desnaturadas fervendo a 100 graus por 10 min com tampão de carregamento de amostra 2*laemmli (Bio-Rad, EUA) mais 5% de -mercaptoetanol em uma proporção de 1:1 e carregado por pista em SDS-PAGE a 12% (minigéis de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida), eletrotransferido em membranas de fuoreto de polivinilideno de 0,45 μm (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, EUA) por 150 min a 200 mA. Posteriormente, as membranas são bloqueadas em albumina de soro bovino a 3% (BSA) à temperatura ambiente e incubadas com os anticorpos primários iNOS e COX-2 (Abcam) a 4 graus durante a noite. Após três lavagens completas em Saline-Tween tamponado com Tris (TBST) cada uma durante 5 min, as membranas são sondadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) (diluições 1:10000; Abcam) durante 1,5 h à temperatura ambiente. As bandas imunorreativas são então visualizadas usando um kit de detecção de quimioluminescência ECL (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Califórnia, EUA) após lavagem duas vezes em TBST e uma vez em TBS, cada vez por 5 min. Os valores densitométricos são normalizados usando -actina como controle interno de carga.

Análise Estatística

Os dados são apresentados como média ± erro padrão e a análise Western blot é repetida em três experimentos independentes com o mesmo resultado. A análise de variância unidirecional é usada para comparar as diferenças de médias para três ou mais grupos. A significância estatística é analisada com o teste t de Student entre dois grupos.

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