A análise in silico de um peptídeo de veneno parasitóide de Drosophila revela a prevalência do motivo de clipe cátion-polar-cátion nas proteínas Knottin Parte 2

2.6. Um clipe de CPC também está presente no peptídeo antimicrobiano Drosomycin

Ao contrário do LhKNOT, a estrutura da Drosomycin contém uma dobra diferente com uma alfa-hélice e uma folha beta de três fitas torcidas, que é estabilizada por três pontes dissulfeto [43]. Este motivo estrutural, denominado "motivo estabilizado por cisteína", também é encontrado em outras proteínas de defesa do hospedeiro, como a defensina A antibacteriana de insetos, toxinas de escorpião, tioninas de plantas e defensinas de plantas antifúngicas [43,44].

-helix é um polipeptídeo com alta atividade biológica, que pode ativar o sistema imunológico humano e aumentar a imunidade humana, prevenindo e tratando várias doenças. Estudos demonstraram que -helix tem o efeito de melhorar a função imunológica, pode melhorar muito a capacidade fagocitária dos macrófagos e a atividade das células T, aumentar a resistência do corpo a microrganismos patogênicos externos, reduzir a sensibilidade do corpo a ambientes adversos e promover a saúde.

A imunidade é crucial para a saúde humana. Pode nos ajudar a resistir a várias doenças, manter a forma física e aumentar a resistência a doenças. No entanto, as pessoas vivem em um ambiente cheio de várias exposições a patógenos e poluição ambiental, e a imunidade é facilmente afetada. Portanto, aumentar a imunidade é muito necessário para manter a saúde humana.

Como um peptídeo ativo natural, o -helix pode não apenas regular o sistema imunológico e melhorar a imunidade, mas também desempenhar um bom papel na prevenção de doenças cardiovasculares e distúrbios metabólicos, melhorando a função hepática, reduzindo os lipídios no sangue e o açúcar no sangue e melhorando a força física e anti-inflamatória. -capacidade de fadiga. Portanto, -helix tem sido amplamente utilizado nos campos da medicina, produtos de saúde e cosméticos, alcançou efeitos notáveis ​​e foi muito bem-vindo.

Resumindo, -helix está intimamente relacionado à imunidade humana, pode estimular a imunidade humana e desempenha um papel importante na garantia da saúde e longevidade humana. Na vida e no trabalho futuros, devemos aumentar ativamente a imunidade, melhorar os hábitos de vida, fazer exercícios e fazer ajustes na dieta adequadamente, considerar o uso de -helix para melhorar a imunidade e enfrentar mais ativamente os desafios e oportunidades futuras. Pode-se ver que precisamos melhorar a imunidade. Cistanche pode melhorar significativamente a imunidade porque os polissacarídeos em Cistanche podem regular a resposta imune do sistema imunológico humano, melhorar a capacidade de estresse das células imunes e aumentar o efeito bactericida das células imunes.

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Dada a conhecida função antimicrobiana da Drosomycin e seu "motivo estabilizado com cisteína" relacionado [43,44], examinamos a possibilidade de uma base comum para a atividade antimicrobiana e relações estrutura-função compartilhadas com LhKNOT para entender melhor o significado potencial desse motivo em LhKNOT no contexto da defesa do hospedeiro.

Apesar de uma dobra estrutural ligeiramente diferente, a Drosomicina se sobrepõe dentro de um RMSD de 2,2Å de LhKNOT e pB1 (Figura 5A). Quando a análise anterior do clipe CPC foi estendida para Drosomycin, os resultados revelaram a presença do motivo do clipe CPC em Drosomycin também. O motivo do clipe CPC em Drosomycin (R6-S4-K38) cai dentro de um desvio de 2Å dos parâmetros do motivo (Figura 5B, Tabela Suplementar S5).

Além disso, a superfície eletrostática da Drosomycin confirmou a formação do suposto clipe de CPC de uma bolsa de ligação catiônica, como também observado para LhKNOT e outros knottins (Figura 5C, Tabela Suplementar S5).

Estes resultados sugerem que pode haver uma semelhança no modo de ação da Drosomycin e LhKNOT e que a bioquímica embutida neste motivo estrutural pode conduzir a função antimicrobiana em ambos os peptídeos.

Figura 5. (A) Superposição de LhKNOT (azul), peptídeo cicatrizante de Pereskia bleo (castanho; pB1; cacto; PDB: 5XBD) e Drosomycin (verde; Drosomycin; fly; PDB: 1MYN). (B) Distâncias medidas em PyMOL entre os centros de massa dos resíduos participantes (pseudoátomos cinza) na interação Drosomycin-heparin. As distâncias estão dentro de 2Å dos intervalos de valor do motivo do clipe CPC. (C) Superfície eletrostática de Drosomycin (mosca; PDB: 1MYN), mostrando a superfície de ligação carregada positivamente formada pelo clipe CPC onde a heparina é encaixada. Os potenciais eletrostáticos de superfície são graduados por cores de -4 kT/e (vermelho) a mais 4 kT/e (azul).

3. Discussão e especulação

As funções bioquímicas das proteínas são facilitadas por suas estruturas gerais, que são declaradamente 3 a 10 vezes mais bem conservadas do que suas estruturas primárias [45]. Consequentemente, os alinhamentos de sequência muitas vezes falham na investigação do potencial funcional de proteínas como os knottins, onde as estruturas primárias variadas podem obscurecer as relações estrutura-função compartilhadas.

Os métodos in silico facilitam uma ampla análise de possíveis correlações estrutura-função para essas dobras interessantes [46-50]. Nossa análise detalhada da estrutura do LhKNOT e de seus homólogos estruturais apóia a ideia de que essa proteína do parasita tem as características de um peptídeo knottin com funções na defesa do hospedeiro: (a) as correspondências mais próximas do LhKNOT são peptídeos antimicrobianos; (b) a assinatura Pfam de LhKNOT o descreve como um "peptídeo antifúngico" com nó de cisteína; e (c) um clipe CPC está presente.

A análise de um login de peptídeo de cicatrização de feridas Knotin pB1 do cacto frondoso Pereskia bleo inicialmente revelou a presença de um clipe de CPC, uma assinatura estrutural conservada de proteínas de ligação à heparina [42]. Tem funções relacionadas à imunidade e sinalização na cicatrização de feridas e câncer e é usado como anticoagulante [51].

GAGs estão presentes em superfícies de células animais e tornaram-se um alvo cada vez mais popular de estudos que variam de clínicos a cosméticos [52]. O motivo do clipe CPC das proteínas de ligação à heparina é considerado o motivo mínimo necessário para a afinidade de ligação à heparina e é definido por relações espaciais específicas entre três resíduos, dois catiônicos (Arg/Lys) e um polar (Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr).

Este motivo de clipe CPC é definido pelas distâncias entre ambos os carbonos dos resíduos envolvidos, bem como as distâncias entre os centros de massa dos resíduos envolvidos. Sabe-se que as proteínas de ligação à heparina interagem promiscuamente com outros substratos carregados negativamente, principalmente as membranas superficiais dos micróbios [41].

Como resultado, as proteínas de ligação à heparina podem exibir atividade antimicrobiana em vários graus [53]. Embora os mecanismos precisos desse potencial antimicrobiano não estejam bem definidos, foi levantada a hipótese de que o clipe CPC pode facilitar essas interações proteína-micróbio [41]. Novos papéis potenciais da ligação da heparina estão surgindo, como nas possíveis intervenções terapêuticas para a amiloidogênese [54], portanto, entender os determinantes estruturais do clipe CPC em diversas proteínas pode ser a chave para delinear o mecanismo da interação e sua interrupção.

Uma pista para um possível mecanismo antimicrobiano para LhKNOT vem de nossa descoberta de que seu nó inibitório de cisteína e os de outros knottins aqui examinados possuem um clipe CPC intrínseco às suas dobras (Tabela Suplementar S5).

Observou-se que os requisitos estruturais e biofísicos para a capacidade das proteínas de ligação à heparina de interagir com a heparina são surpreendentemente semelhantes às características estruturais de muitos AMPs conhecidos [53]. Assim, o motivo do clipe CPC pode atender aos critérios de ambos os requisitos [41].

Nossa descoberta deste motivo de clipe CPC não apenas em LhKNOT, mas também em 75 outras proteínas knottin relacionadas ou não relacionadas (Tabela Suplementar S5) sugere que esse motivo de clipe CPC pode ser uma característica altamente conservada das proteínas knottin.

A ocorrência coincidente do motivo do clipe CPC dentro da estrutura do nó de cisteína em diversas proteínas sugere que o próprio motivo do clipe CPC pode estar subjacente à função antimicrobiana. No entanto, como esse motivo estrutural também é identificado em nós ofensivos (Tabela Suplementar S5), ele também pode servir a um papel mais geral por meio desse motivo de interação de clipe CPC mais generalizado.

A descoberta de um suposto motivo de clipe CPC em Drosomycin é intrigante, pois lança luz sobre o possível mecanismo de ação desse peptídeo antifúngico e suporta uma possível função antimicrobiana para o próprio motivo de clipe CPC. Estudos anteriores mostraram a importância dos resíduos R6 e K38 da Drosomicina, que fazem parte de seu motivo de clipe CPC (R6-S4-K38), por seu potencial antifúngico; alterações desses resíduos reduzem a atividade antifúngica [55]. Nossa análise estrutural da vespa LhKNOT e suas semelhanças com a Drosophila Drosomycin oferece informações possíveis sobre a capacidade do L. heterotoma de suprimir amplamente a via TollNF-κB em D. melanogaster e ainda ter sucesso em hospedeiros imunocomprometidos.

Na ausência de uma via imune Toll funcional e, conseqüentemente, sem a produção de Drosomycin, as larvas de Drosophila podem frequentemente sucumbir a patógenos oportunistas [11,13,56]. As atividades antimicrobianas putativas do LhKNOT podem defender o hospedeiro de patógenos microbianos oportunistas em larvas de hospedeiros imunocomprometidos, infectadas por vespas e pupas em desenvolvimento. Alternativamente, semelhante à Drosomycin, LhKNOT poderia induzir a apoptose de hemócitos [57]. Os EVs de L. heteroátomo entram nos hemócitos após a infecção [58], e suas atividades dentro dos EVs comprometem o encapsulamento [19,21].

Foi demonstrado que o clipe CPC se associa promiscuamente com GAGs [41], que são, no entanto, onipresentes em insetos, incluindo Drosophila [59]. Os GAGs de sulfato de heparina em moscas servem como receptores de fator de crescimento e participam na criação e manutenção de gradientes morfogênicos [60]. O clipe CPC também demonstrou associar-se promiscuamente com lipopolissacarídeos (LPS) [41]. Os LPS bacterianos, sendo os principais componentes de superfície de bactérias Gram-negativas, são estimuladores extremamente potentes da resposta imune inata em várias espécies eucarióticas, incluindo insetos [61]. GAGs em Drosophila também controlam a ligação da proteína C, um determinante de virulência do estreptococo do grupo B [62].

Assim, é possível que um clipe de CPC contendo LhKNOT e Drosomycin (e possivelmente outros AMPs de mosca, como Defensin [63]) possa modular a sinalização imune (e/ou ligação às proteínas de virulência do patógeno), afetando de forma semelhante o patógeno/metazoário bacteriano resultado do parasita. Estudos anteriores mostraram que três knottins homólogos (Alo-1, 2, 3) do besouro arlequim Acrocinus longimanus são ativos contra a levedura Candida glabrata [30]. Além disso, um peptídeo candicida formador de poros, Psacotheasin, ataca Candida albicans [64]. Por último, um fungo de ferrugem patogênica para plantas, popularmente conhecido como Melampsora, produz um peptídeo knottin como seu efetor candidato [65].

Nossa descoberta de que vários peptídeos knottin putativos podem ser secretados por vespas parasitóides adultas de Drosophila foi inesperado e intrigante. Embora suas funções não sejam conhecidas, a possível existência de uma família de genes knottin sugere alguma redundância em suas funções que pode estar ligada à história de vida do parasita. A exploração da dobra estrutural do nó em nós não relacionados e ainda a serem descobertos provará ser valiosa. Nosso trabalho fornece uma pequena lista de resíduos significativos para a atividade fisiológica proposta para a investigação de proteínas da família Knottin. Essas informações podem ser incorporadas à descoberta e design racionais de medicamentos para doenças infecciosas e terapias relacionadas.

4. Métodos

4.1. Análise de Sequência

Varreduras iniciais do banco de dados de sequências de proteínas não redundantes (nr) do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein; acessado em 4 de abril de 2018), banco de dados de sequências do Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/tsa; acessado em 16 de abril de 2018) [66], e o Protein Data Bank (PDB; https://www.rcsb.org; acessado em 5 de julho de 2018) [67] com a sequência de aminoácidos completa do peptídeo de nó de heteroátomo de L. (GAJC01011813.1) usando NCBI BLAST (BLASTp; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast. cgi; acessado em 16 abril de 2018) [68] foram usados ​​para recuperar sequências de proteínas relacionadas em outros organismos. Homólogos remotos foram pesquisados ​​usando BLAST iterativo específico de posição (PSI-BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; acessado em 4 de abril de 2022) [69] e modelos ocultos de Markov (HMMER; https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer; acessado em 6 de abril de 2022) [70,71]. As buscas BLAST foram ajustadas para tamanho de palavra 2 e matriz de pontuação BLOSUM45, enquanto parâmetros padrão foram usados ​​para HMMER.

Identificar homólogos de knottin em Leptopilina e Ganaspis spp selecionados. não acessíveis nos bancos de dados de proteínas, pesquisas direcionadas usando BLASTs traduzidos contra conjuntos de dados genômicos e transcriptômicos foram empregadas. Para identificar nós adicionais de heteroátomos de L., o transcriptoma abdominal feminino de L. heteroátomo GAJC [72] e os transcriptomas de corpo inteiro de Ground GHUQ (Acesso GenBank: GHUP00000000; TSA: Leptopilina heteroátomo cepa Lh14, transcriptoma shotgun) e Space GHUP (GenBank Accession: GHUQ00000000; TSA: Leptopilina heteroatom strain Lh14, transcriptoma shotgun) foram pesquisados ​​usando tblastn (limite de valor-e definido como 1, BLOSUM62, filtro de baixa complexidade ativado, filtro de cobertura de consulta definido como 20 por cento ) contra LhKNOT.

Os seguintes transcriptomas foram pesquisados ​​de forma semelhante para identificar L. boulardi knottins: transcriptoma abdominal feminino de L. boulardi GAJA [72] e transcriptomas de corpo inteiro de Ground GITC (Acesso GenBank: GITC00000000; TSA: Leptopilina boulardi cepa Lb17, transcriptoma shotgun), Space GISX (GenBank Accession: GISX00000000; TSA: Leptopilina boulardi cepa Lb17, transcriptoma shotgun) e GGGI00000000 (abdômen/cabeça feminina) [73]. Além disso, pesquisas direcionadas para Ganaspis spp. homólogos foram realizados. Para G. hookeri, o GAIW00000000 TSA: Ganaspis spp.

O conjunto de dados G1 [74] foi pesquisado (tblastn, limite de valor e definido como 1, BLOSUM45, filtro de baixa complexidade ativado, filtro de cobertura de consulta definido como 20%) usando a consulta LhKNOT. A ferramenta Expasy (web.expasy.org/translate/; acessada em 9 de dezembro de 2022) foi usada para traduzir essas sequências de TSA [75]. As sequências peptídicas previstas resultantes foram curadas manualmente com base na presença do motivo cisteína. Para G. brasiliensis, baseado em AUGUSTUS (http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus; acessado em 9 de abril de 2020) [76] previsões de genes da sequência genômica parcialmente montada (Gen-Bank: GCA{{15} }.1) foram feitas usando o módulo de treinamento do genoma de Nasonia vitripenis.

As proteínas previstas resultantes foram pesquisadas usando blastp (limite de valor e definido como 1, filtro de baixa complexidade ativado, filtro de cobertura de consulta definido como 20 por cento) contra LhKNOT. Alinhamentos e visualizações foram realizados usando Clustal Omega da EBI (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo; acessado em 9 de dezembro de 2022) [77] para confirmar a presença do motivo knottin e para posterior curadoria de as sequências.

O conjunto de sequências identificadas foi alinhado ao LhKNOT para criar um alinhamento de múltiplas sequências usando T-COFFEE (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee; acessado em 9 de dezembro de 2022) [78] e visualizado usando ESPript3 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php; acessado em 9 de dezembro de 2022) [79] para identificar quaisquer resíduos conservados e/ou motivo(s) nas sequências alinhadas.

4.2. LhKNOT Análise de Estrutura Primária

A sequência LhKNOT também foi analisada pelo banco de dados de detecção de domínio/motif Conservado Domain Database (CDD; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd. shtml; acessado em 6 de abril de 2018) e Pfam ( pfam.xfam.org; acessado em 6 de abril de 2018) para identificar quaisquer domínios ou assinaturas de sequência [80,81].

A sequência foi analisada posteriormente usando o software de previsão de sequência de sinal SignalP{{0}}.0 (https://services.healthtech.dtu. dk/service.php?SignalP-5 .0; acessado em 6 de abril de 2018) [82] e Phobius (https://www. ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobias; acessado em 6 de abril de 2018) [83] para identificar a localização da sequência de sinal e permitem uma caracterização mais precisa do peptídeo. O peptídeo maduro de 36 aminoácidos (com a sequência de sinal prevista, resíduos 1–24, removidos) foi usado para análise posterior.

A estrutura secundária do peptídeo foi prevista usando o meta-servidor Sympred (https://www.ibi.vu.nl/programs/sympredwww; acessado em 6 de abril de 2018) [84] e analisada para confirmar sua correspondência com o secundário esperado estrutura para uma dobra em nó: um segmento alfa-helicoidal inicial (sequência de sinal prevista) seguido por três fitas beta antiparalelas.

4.3. Previsão e avaliação da estrutura terciária de LhKNOT e seus homólogos

Os programas I-Tasser (https://zhanggroup.org/I-TASSER; acessado em 16 de abril de 2018) [85], Modeller (https://salilab.org/modeller; acessado em 16 de abril de 2018) [{{7 }}] e HHPred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred; acessado em 6 de abril de 2018) [37] foram usados ​​para modelar a estrutura terciária do LhKNOT. Três homólogos estruturais com a dobra Alo-3 (PDB: 1Q3J) [30], ômega-agatoxina-IVA (PDB: 1IVA) [28] e PAFP-S (PDB: 1DKC) [25] foram identificados como principais candidatos e usados ​​como modelos em programas de construção de modelos.

O modelo previsto para LhKNOT foi avaliado por Verify3D (https://www.doe-mbi.ucla.edu/verify3d; acessado em 18 de abril de 2018) [39], VoroMQA (https://bioinformatics.lt/wtsam/voromqa; acessado em 18 de abril de 2018) [40] e Prosaweb (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php; acessado em 18 de abril de 2018) [38]. Avaliar pequenos peptídeos com ferramentas de avaliação padrão pode ter limitações.

Assim, pontuações de estruturas terciárias resolvidas de NMR e peptídeos derivados de cristalografia de tamanho e forma semelhantes (PDB: 1Q3J, 1IVA e 1DKC) foram usadas para interpretar as pontuações de avaliação de nossos modelos LhKNOT. O modelo mais bem classificado foi criado usando HHPred [37], um programa de modelagem que usa o programa de construção de modelo subjacente, Modeller [86] usando uma abordagem de modelagem comparativa baseada em restrições. Além disso, a ferramenta KNOTER3D do banco de dados KNOTTIN (https://www.dsimb.inserm.fr/KNOTTIN/knoter3d.php; acessado em 15 de maio de 2020) [36] foi usada para avaliar a estrutura terciária do modelo, confirmando a adoção do LhKNOT da Dobra de nó. Todos os homólogos identificados sem estruturas conhecidas foram modelados usando o modelo superior identificado no HHPred [37].

4.4. Identificação do Motivo do Clipe CPC

Superposição do modelo estrutural de LhKNOT com as estruturas conhecidas de um clipe CPC contendo peptídeo knottin do cacto Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] usando os programas Superpose (http://superpose.wishartlab.com; acessado em 12 de setembro 2{ {11}}18) [87] e MultiProt (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt; acessado em 12 de setembro de 2018) [88] sugeriram a presença de um motivo de clipe CPC de ligação à heparina. Para confirmar a presença do clipe CPC no LhKNOT, análise de encaixe usando o programa ClusPro 2.0 (que oferece parâmetros específicos para heparina como ligante; https://cluspro.org; acessado em 2 de março de 2019) [89] e análise subsequente de cenários de ancoragem previstos no programa de visualização, PyMOL (https://pymol.org; acessado em 10 de março de 2019) [90] foi realizado.

Todos os cenários de ancoragem potenciais foram analisados ​​para identificar resíduos que formam o suposto motivo de clipe CPC usando as seguintes etapas. Todas as interações polares entre LhKNOT e heparina foram visualizadas em PyMOL e listas de resíduos participantes foram compiladas. As previsões que continham as interações necessárias de cátion-polar-cátion foram então examinadas para aderência ao parâmetro de motivo de clipe CPC medindo as distâncias entre os carbonos alfa dos resíduos participantes, bem como as distâncias entre o centro de massa dos resíduos participantes. A ferramenta "Measurements" Wizard do PyMOL foi usada para medir as distâncias entre os carbonos dos resíduos participantes.

Para avaliar as distâncias entre os centros de massa, um script gerado pelo usuário disponível no site Pymolwiki (Henschel, https://pymolwiki.org/index.php/Center_of_mass; acessado em 15 de março de 2019) foi usado para gerar pseudo-átomos no centro de massa da cadeia lateral calculado. O plug-in de eletrostática APBS do PyMOL [91] foi usado para renderizar a superfície eletrostática para o LhKNOT modelado. Etapas semelhantes foram realizadas para identificar o motivo do clipe CPC em cada uma das proteínas knottin restantes na Tabela Suplementar S5.

4.5. Associação de LhKNOT com outros GAGs

Para avaliar se o clipe CPC facilitaria a ligação com GAGs adicionais, foi realizado docking adicional com ácido hialurônico (PDB: 1HYA) e sulfato de queratano (PDB: 1KES). No caso do ácido hialurônico, átomos estranhos (O, Na) foram removidos do espaço ao redor da molécula. O modelo de sulfato de queratana foi usado como está. O encaixe foi realizado usando AutoDock (https://autodock.scripps.edu; acessado em 7 de abril de 2020) [92] e os resultados foram visualizados em PyMOL. Os resultados foram então inseridos no PDBSum (http://www.ebi.ac. uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html; acessado em 10 de abril de 2020) [93] para gerar Ligplots para confirmar a ligação do clipe GAG-CPC .

4.6. Análise de ancoragem de proteína-heparina para clipe de CPC mutante em LhKNOT

Para investigar a importância do clipe CPC na ligação da heparina, modelos mutantes de LhKNOT foram gerados usando a ferramenta de mutagênese PyMOL, substituindo os resíduos do clipe CPC por alanina. Os modelos foram criados por partes, primeiro substituindo apenas R14, depois R1 e R14 e, finalmente, R14, R1 e S3. O ancoramento de heparina de todos os modelos foi realizado usando ClusPro, e a análise foi realizada conforme descrito anteriormente.

4.7. Análise de Docking Proteína-Heparina em Homólogos Estruturais e Drosomicina

Para avaliar ainda mais a presença do motivo do clipe CPC na família de peptídeos knottin, os métodos anteriores foram expandidos para (a) homólogos estruturais de LhKNOT (PDB: 5XBD, 1Q3J, 1IVA e 1DKC) [25,26,28,30 ]; (b) Drosophila Drosomycin (PDB: 1MYN) [43], um peptídeo com conhecida atividade antifúngica; (c) proteínas knottin homólogas modeladas e (d) knottins representativos de diferentes categorias no banco de dados KNOTTIN. Os resultados foram considerados como aderentes ao motivo se as medições caíssem dentro de 3Å dos parâmetros do clipe CPC, para permitir alguma flexibilidade de conformações de loop de proteína.

Materiais Suplementares:

As seguintes informações de suporte podem ser baixadas em https://www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens12010143/s1. Tabela S1. Homólogos identificados de LhKNOT usando diferentes abordagens baseadas em sequência. Tabela S2. Homólogos putativos de L. heterotoma de LhKNOT. As sequências foram identificadas via tblastn a partir de três conjuntos de dados de transcriptoma Lh14 (ver Métodos para números de acesso).

As transcrições agrupadas por células sombreadas codificam peptídeos knottin idênticos. Os números de acesso da transcrição mostrados em negrito codificam dois peptídeos distintos. Os resultados foram recuperados da Tabela de descrição disponível nos resultados do NCBI blast. Tabela S3. Homólogos putativos de L. boulardi knottin de LhKNOT. As sequências foram identificadas via tblastn de quatro conjuntos de dados de transcriptoma de L. boulardi (ver Métodos para números de acesso). Peptídeos Knotin idênticos derivados de transcrições diferentes são agrupados por cor. Os resultados foram recuperados da tabela de descrição dos resultados do NCBI blast. Tabela S4.

Sequências de knottinas putativas de Ganaspis spp., homólogas a LhKNOT. As seqüências de G. hookeri foram identificadas com tblastn, enquanto as seqüências de G. brasiliensis foram identificadas com blast. Os resultados para G. hookeri e G. brasiliensis foram recuperados da Tabela de Descrição disponível nos resultados de pesquisa do NCBI. As sequências sombreadas codificam peptídeos idênticos. Tabela S5.

Uma lista de resíduos de aminoácidos nos clipes CPC de knottin conhecido examinado, peptídeos de knottin modelados e Drosomycin. São mostradas medições de distância (Å) de carbono alfa e centro de massa da cadeia lateral (via pseudo-átomo) de resíduos participantes de motivos de clipe CPC identificados. Legenda: mais Knottins ofensivos conhecidos (toxinas), Φ modelos in silico, * dobra não-knottin, ±peptídeo putativo alternativo, destacado em verde e amarelo para demarcar peptídeos decorrentes do mesmo transcrito. Figura S1: (A) Perfil de avaliação do Prosa-web. O Z-score do modelo é representado como um ponto preto em um fundo de Z-scores de estruturas conhecidas do PDB (esquerda) e visualização do modelo tridimensional LhKNOT com resíduos coloridos de azul a vermelho em ordem crescente energia residual (à direita). (B) Verificar perfil de avaliação. O gráfico mostra as pontuações médias e brutas 1D-3D para LhKNOT e o painel na parte superior lista a porcentagem de resíduos que pontuaram uma média de 0.2 ou superior.

Um modelo aprovado tem pelo menos 80 por cento de sua pontuação de resíduos acima de 0,2. (C) Perfil de avaliação VoroMQA. Pontuações globais do VoroMQA no contexto de pontuações de estruturas de raios X de alta qualidade (esquerda) e plotagem da pontuação local e pontuação geral para LhKNOT (direita). Figura S2. Ligplot mostrando interações de LhKNOT com sulfato de queratano (PDB: 1KES) incluem os resíduos do clipe CPC (R1-S3-R14). As linhas tracejadas verdes representam as interações das ligações de hidrogênio. Figura S3. Ligplot mostrando interações de LhKNOT com ácido hialurônico (PDB: 1HYA) incluem os resíduos do clipe CPC (R1-S3-R14).

As linhas tracejadas verdes representam as interações das ligações de hidrogênio. Figura S4. (A) Ligplot mostrando interações de tipo selvagem LhKNOT interagindo com heparina por meio do clipe CPC primário (R1-S3-R14). (B) Ligplot mostrando interações do mutante R14A LhKNOT interagindo com heparina por meio de um clipe CPC secundário (R1-S3-R30). As linhas tracejadas verdes representam as interações das ligações de hidrogênio. As referências [94–111] são citadas nos Materiais Suplementares.

Contribuições do autor:

Conceituação, SS, SG e JA; metodologia, JA e SS; validação, SS, SG, JA, JL e LVC; análise formal, JA, JL e LVC; investigação, JA, JL e LVC; recursos, SS e SG; curadoria de dados, JA, JL e LVC; redação—preparação do rascunho original, JA; redação—revisão e edição, SS, SG, JA, JL e LVC; visualização, JA e JL; supervisão, SS e SG; administração do projeto, SS e SG Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento:

Esta pesquisa não recebeu financiamento.

Declaração do Conselho de Revisão Institucional:

Não aplicável.

Declaração de Consentimento Informado:

Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados:

Os dados apresentados neste estudo estão disponíveis no artigo e Materiais Suplementares.

Agradecimentos:

Somos gratos a Brian Wey por sua ajuda com as previsões do gene G. brasiliensis e SA Tasnim Ahmed por sua ajuda com a formatação das figuras.

Conflitos de interesse:

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências

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