Um regime heterólogo de iniciação de AZD1222 e reforço de BNT162b2 provoca mais eficientemente anticorpos neutralizantes, mas não células T de memória, do que o regime homólogo de BNT162b2

abstrato

Antecedentes: análises comparativas de SARS-CoV-2-respostas imunológicas específicas induzidas por diversos regimes prime-boost são necessárias para estabelecer regimes eficientes para o controle de COVID-19. Método: Neste estudo de coorte observacional prospectivo, imunoglobulina G específica para pico (IgG) e anticorpos neutralizantes (nAbs) juntamente com respostas de células T específicas para pico em grupos de mesma idade de vacinação homóloga BNT162b2/BNT162b2 ou AZD1222/AZD1222, heteróloga AZD1222/ Vacinação BNT162b2 e infecção/vacinação SARS-CoV{19}} do tipo selvagem anterior foram avaliadas. Resultados: As respostas imunes máximas foram alcançadas após a segunda dose de vacina nos grupos vacinados virgens e após a primeira dose no grupo de infecção/vacinação prévia. Os títulos de pico de IgG anti-spike e nAb foram significativamente maiores nos grupos de vacinação AZD1222/BNT162b2 e infecção/vacinação prévia do que nos grupos BNT162b2/BNT162b2 ou AZD1222/AZD1222. No entanto, a frequência de células T CD4+ produtoras de interferon-c foi maior no grupo de vacinação BNT162b2/BNT162b2. Resultados semelhantes foram observados na análise de células T polifuncionais. Quando as respostas de células T nAb e CD4+ contra a variante Delta foram analisadas, o grupo de infecção/vacinação anterior exibiu respostas mais altas do que os grupos de outros regimes de vacinação homólogos ou heterólogos. Conclusão: os nAbs são eficientemente induzidos pela vacinação heteróloga AZD1222/BNT162b2, bem como infecção/vacinação prévia, enquanto as respostas de células T CD4 mais específicas de pico são eficientemente induzidas pela vacinação homóloga BNT162b2. A imunidade de reconhecimento de variantes é gerada mais eficientemente por infecção/vacinação prévia do que os outros regimes de vacinação homólogos ou heterólogos.

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1. Introdução

O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) está se espalhando globalmente desde seu surgimento em dezembro de 2019, e o desenvolvimento de vacinas eficazes contra a doença de coronavírus 2019 (COVID-19) foi acelerado [1 ]. O sucesso do empreendimento foi visto de forma relativamente rápida, e várias vacinas que empregam proteína spike (S) como um antígeno vacinal demonstraram com sucesso segurança e eficiência na prevenção de COVID sintomático-19. Especificamente, a vacina baseada em mRNA BNT162b2 (Comirnaty, Pfifizer-BioNTech) e a vacina baseada em vetor de adenovírus AZD1222 (Vaxzevria, AstraZeneca) foram inicialmente aprovadas e amplamente administradas como um regime de iniciação-reforço de duas doses. Duas doses de BNT162b2 tiveram 95% (intervalo de confiança de 95% [IC], 90–98%) eficácia contra COVID sintomático-19 [2], e duas doses de AZD1222 tiveram 70% (95% CI, 55–81 por cento ) eficácia [3]. Curiosamente, regimes heterólogos de primo-reforço de vacinas COVID-19 licenciadas ganharam interesse substancial e foram subsequentemente iniciados em vários países, apesar dos dados insuficientes sobre imunogenicidade e segurança. BNT162b2 administrado como uma dose de reforço em indivíduos vacinados com AZD1222 induziu títulos robustos de anticorpos (Ab) de imunoglobulina G (IgG) específicos para S, respostas de anticorpos neutralizantes (nAb) e células T de interferon-c plus (IFN-c plus) [4 ,5]. No entanto, poucos estudos avaliaram a eficácia da vacinação heteróloga AZD1222/BNT162b2 em comparação com a vacinação homóloga BNT162b2/BNT162b2 [6–8], e esses estudos careciam de uma avaliação abrangente das respostas das células T específicas S. Consequentemente, se a vacinação heteróloga AZD1222/BNT162b2 resulta em respostas potentes de nAb de variante cruzada ou de células T permanece incerto. Outro exemplo de priming-boosting heterólogo pode ser visto em indivíduos que foram infectados com SARS-CoV-2 e posteriormente vacinados contra o vírus. Vários estudos sugeriram que os níveis de Ab e nAb de ligação específica são detectados em níveis elevados em indivíduos com infecção e vacinação anteriores, embora não houvesse análises comparativas [9,10]. Os profissionais de saúde com infecção prévia por SARS-CoV-2 têm títulos de Ab mais altos em resposta a uma dose única de vacina de mRNA do que aqueles que não foram infectados anteriormente [11]. Além disso, indivíduos com infecção prévia exibem respostas de células T específicas S e respostas de células B de memória secretoras de Ab após a primeira dose sem a dose de reforço [12]. No presente estudo, examinamos de forma abrangente a imunogenicidade humoral e celular de regimes primário-reforço homólogos e heterólogos em uma coorte observacional prospectiva com comparações lado a lado da ligação específica de S Ab, nAb e respostas de células T CD4 mais específicas . Também avaliamos os resultados imunológicos em participantes que foram infectados com SARS-CoV de tipo selvagem-2 e receberam vacinas contra COVID-19 para determinar se a infecção e a vacinação anteriores provocam com eficiência respostas imunes contra a variante Delta.

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2. Métodos

2.1. Design de estudo

Uma coorte prospectiva multicêntrica foi estabelecida em março de 2021 para estudar as respostas imunes à vacinação contra a COVID-19. Os participantes desta coorte foram recrutados voluntariamente entre profissionais de saúde e inicialmente agendados para receber duas doses de BNT162b2 em um intervalo de 3-semana ou AZD1222 em um intervalo de 12-semana. No entanto, uma parte dos indivíduos vacinados com AZD1222 receberam a dose de reforço de BNT162b2 entre maio e junho de 2021 e foram incluídos no grupo de vacinação AZD1222/BNT162b2. Entre os participantes da coorte, aqueles que tiveram infecção prévia por SARSCoV-2 do tipo selvagem e receberam BNT162b2 ou AZD1222 foram incluídos como o grupo de infecção/vacinação anterior. Todos os vacinados analisados ​​neste estudo foram pareados por idade entre os grupos. Amostras de sangue periférico foram coletadas de todos os participantes da coorte em cada momento (T): antes e 3 semanas após a 1ª dose da vacina (T1 e T2, respectivamente), 5 semanas após a 1ª dose de BNT162b2 ou 11 semanas após a 1ª dose dose de AZD1222 (T3) e 14 semanas após a 1ª dose de vacina (T4). Uma representação esquemática do protocolo do estudo é fornecida na Fig. 1. Para comparação, amostras convalescentes foram obtidas de pacientes não vacinados infectados com a variante SARSCoV-2 Delta confirmada por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real usando o Seegene Allplex { {38}}Kit de ensaio nCoV (Seegene, Coréia) e Illumina BTSeq SARS-CoV-2 kit de sequenciamento de genoma completo (Celemics Inc, Coréia) em um sequenciador MiSeq (150-bp paired-end mode; Illumina, San Diego, CA, EUA). A sequência base obtida por meio do BTseq foi comparada com a sequência de referência NCBI NC_045512.2 usando o software IGV 2.10 para confirmar a variante Delta. O estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucional de cada instituto participante e conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito antes da inscrição.

2.2. Participantes do estudo

Esta coorte compreendeu 22 participantes que receberam vacinação homóloga BNT162b2/BNT162b2 (idade média, 38.0 anos; 31,8 por cento homens), 20 participantes que receberam vacinação homóloga AZD1222/AZD1222 (idade média, 39,7 anos; 23,8 por cento homens) , e 9 participantes que receberam vacinação heteróloga AZD1222/ BNT162b2 (idade média, 38,2 anos; 33,3% homens). Dos 11 participantes com infecção prévia por SARS-CoV-2 do tipo selvagem (idade média de 38,5 anos; 27,3% homens), 2 e 9 foram vacinados com BNT162b2/BNT162b2 e AZD1222/AZD1222, respectivamente. Os dados demográficos dos diferentes grupos vacinados são fornecidos na Tabela Complementar 2. Todos os participantes com infecção anterior por SARS-CoV -2 do tipo selvagem apresentaram COVID-19 assintomático ou leve e 3 deles tiveram pneumonia. O tempo médio desde a confirmação da COVID-19 até a primeira vacinação foi de 121,5 (intervalo interquartil [IQR], 102,3–252,5) dias. Os dados demográficos dos participantes com infecção prévia por SARS-CoV-2 do tipo selvagem e vacinação são fornecidos na Tabela Suplementar 1. Amostras convalescentes foram obtidas de 17 pacientes (idade média de 53 anos; 52,9 por cento homens) infectados com SARS -CoV-2 variante Delta e hospitalizado por COVID moderado a crítico-19 (moderado, 17,6 por cento; grave, 35,3 por cento; gravemente doente, 47,1 por cento). O tempo médio desde o início dos sintomas relacionados à COVID-19-até a amostragem foi de 24 (IQR, 22–32) dias. Os dados demográficos dos participantes convalescentes do SARS-CoV-2 Delta são fornecidos na Tabela 2 suplementar e na Tabela 3.

2.3. Anticorpos de ligação

Os Abs de ligação específicos de SARS-CoV-2 S foram analisados ​​usando um imunoensaio comercial. O Elecsys anti-S protein assay (Roche Diagnostics, Alemanha) é um imunoensaio de eletroquimioluminescência usado para detectar SARS-CoV-2 anticorpos específicos S no analisador Cobas e411 (Roche Diagnostics, Alemanha), com uma faixa de medição de { {8}},4 U/mL a 250 U/mL (até 2.500 U/mL com diluição integrada de 1:10 e até 12.500 U/mL com diluição integrada de 1:50). O domínio de ligação ao receptor recombinante da proteína S foi usado com um princípio de sanduíche de antígeno duplo. Os antígenos no reagente capturam predominantemente anti-SARSCoV-2 IgG. O ensaio de proteína anti-nucleocapsídeo Elecsys (Roche Diagnostics, Alemanha) foi usado para detectar infecções anteriores por SARS-CoV-2, com um índice de corte de 1,0.

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2.4. Ensaio de neutralização de redução de placa

Ensaios de neutralização de redução de placa para vírus SARS-CoV- 2 de tipo selvagem (BetaCoV/Korea/KCDC03/2020) e a cepa variante Delta YS117 (número de acesso GenBank MZ798798 e número de acesso GISAID EPI{ {8}}ISL_3411836) foram realizados usando amostras de plasma. O vírus foi cultivado em células Vero E6 em um laboratório de nível 3 de biossegurança no Avison Biomedical Research Center em Seul, Coréia. Amostras de plasma inativado (135 lL) de amostras de plasma inativado foram diluídas em série 2-vezes (1:40 a 1:1280) e adicionadas a um volume igual de 100 vezes a dose infecciosa de 50 por cento da cultura de tecidos (TCID50) do vírus. Os isolados contendo 100 vezes o TCID50 foram incubados em placas de 96-poços por 60 min a 37 C. As misturas vírus-plasma foram incubadas por 60 min a 37 C em uma incubadora de CO2. As misturas de vírus-plasma foram então adicionadas a células Vero E6 semeadas em uma placa de 24-poços com 1x105 células/poço e incubadas por 1 h a 37 C. Meio de sobreposição composto por 2 por cento de soro bovino fetal (FBS) em DMEM e 1 por cento de ágar foi adicionado às células E6 e incubadas por 3 dias em 37 C em uma incubadora de CO2. Após a formação da placa, solução de formaldeído a 10 por cento e vermelho neutro a 0,33 por cento em solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram usados ​​para fixar e corar a camada de cultura celular. A diluição neutralizante de cada amostra foi determinada identificando o poço com a maior diluição de plasma sem um efeito citopático observável. As doses de neutralização de 50 por cento (ND50) foram expressas como a diluição recíproca do plasma, o que resultou em uma redução de 50 por cento no número de placas em comparação com o controle de vírus positivo. O método de Spearman-Kärber foi usado para calcular os títulos de ND50. Em comparação com os soros padrão internacional da OMS (NIBSC 20–136; título de nAb: 1.000 UI/mL), os títulos de nAb foram convertidos em unidades internacionais por mililitro (UI/mL).

Fig. 1. Representação esquemática das coortes de receptores da vacina. Esquema de estudo para a detecção de SARS-CoV-2 anticorpos de ligação específica ao pico, anticorpos neutralizantes e respostas de células T em amostras de sangue periférico de indivíduos vacinados para COVID-19. O estudo inclui BNT162b2/BNT162b2 (n=22), AZD1222/AZD1222 (n=20), AZD1222/BNT162b2 (n=9) e SARS-CoV de tipo selvagem anterior{{20 }} grupos de infecção/vacinação (n=11). Entre a infecção/vacinação SARS-CoV-2 de tipo selvagem anterior, 2 e 9 foram vacinados com BNT162b2/BNT162b2 e AZD1222/AZD1222, respectivamente. O histórico de infecção por SARS-CoV-2 foi confirmado por um teste positivo de anticorpo anti-SARS-CoV-2 nucleocapsídeo. T, ponto no tempo; semanas, semanas.

2.5. ensaios de células T

As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade usando tubos Leucosep (Greiner Bio-One) contendo meio de separação de linfócitos. Após centrifugação a 800g por 15 min com o freio, a fração celular enriquecida consistindo de PBMCs foi colhida e lavada com 20 mL de PBS. Após centrifugação a 300g por 10 min, o pellet celular foi ressuspenso em 10 mL de PBS para contagem. Após centrifugação a 300 g por 10 min, as células foram criopreservadas em FBS com 10 por cento de dimetil sulfóxido a 180 C até o uso. Para coloração de citocina intracelular (ICS) de IFN-c, interleucina-2 (IL-2) e fator de necrose tumoral (TNF), usamos pools de peptídeos de 15-mer peptídeos sobrepostos por 11 aminoácidos que cobrem as partes imunodominantes da proteína SARS-CoV-2 Wuhan S (aa 304–338, 421–475, 492–519, 683–707, 741–770, 785–802 e 885–1273; Miltenyi Biotec). Para comparar as respostas das células T contra as cepas Wuhan e Delta, usamos dois conjuntos diferentes de pools de peptídeos S compreendendo regiões não conservadas de sequências S entre as cepas Wuhan e Delta (linhagem B.1.617.2) (Miltenyi Biotec). Depois de descongelar PBMCs e deixá-los descansar durante a noite, 1  106 PBMCs foram estimulados com pools de peptídeos em uma concentração final de 1 mg/mL e CD28/CD49d anti-humano (1 mg/mL; BD Biosciences) por 1 h em um { {45}}placa de poço em meio RPMI-1640 contendo 1 por cento de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 10 por cento de FBS. A cultura de PBMC foi incubada por mais 5 h após a adição de brefeldina A e monensina (BD Biosciences) a 37 C em 5 por cento de CO2. Após a estimulação, as células foram lavadas com PBS e coradas com Live/Dead-Aqua (Invitrogen) por 20 min em temperatura ambiente, seguido por um coquetel de Abs de superfície por 20 min em temperatura ambiente, incluindo anti-CD14- BV510, anti-CD19-BV510, anti-CD4- BV650, anti-CD3-BV786 e anti-CD8-APC-Cy7 (BD Bioscience). As células foram fixadas e permeabilizadas usando um Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience) e, em seguida, coradas com um coquetel de Abs intracelulares, incluindo anti-TNF-FITC, anti-IL-2-PE (eBioscience) e anti- IFN-c-APC (BD Biosciences) por 20 min em temperatura ambiente. Após a conclusão da coloração, as células foram analisadas em um instrumento LSR II com FACSDiva (BD Biosciences) e os dados foram analisados ​​no software FlowJo (FlowJo LLC).

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2.6. Análise estatística

Os dados plotados em escala linear foram expressos como média ± desvio padrão. Os dados plotados em escalas logarítmicas foram expressos como média geométrica ± desvio padrão geométrico. Os testes Mann-Whitney U ou Wilcoxon foram aplicados para comparações não pareadas ou pareadas, respectivamente. As análises estatísticas foram {{0}}caudadas, com P < 0,05 considerado significativo. Todas as análises foram realizadas no R studio ou GraphPad Prism v9.0.

3. Resultados

3.1. Cinética das respostas imunes induzidas por diferentes regimes de vacinação

Primeiro, examinamos os títulos de anti-S IgG após a vacinação com diferentes regimes. Como esperado, a primeira dose aumentou significativamente os títulos de anti-S IgG (T2), e a segunda dose aumentou ainda mais significativamente os títulos de anti-S IgG na vacinação homóloga BNT162b2/BNT162b2 (T3) e AZD1222/AZD1222 (T4) e heteróloga AZD1222/ Grupos de vacinação BNT162b2 (T4) (Fig. 2A). No grupo de infecção/vacinação prévia, a primeira dose aumentou ao máximo os títulos de anti-S IgG (T3), mas a segunda dose não aumentou ainda mais os títulos de anti-S IgG (T4). Também examinamos as respostas de células T CD4 mais específicas de S após estimulação ex vivo direta com pools de peptídeos cobrindo a sequência de proteína S de tipo selvagem de Wuhan -2 de SARSCoV. Com base no ICS, a primeira dose aumentou significativamente a frequência de células produtoras de IFN-c entre as células T CD4+, e a segunda dose aumentou significativamente ainda mais a frequência nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2 (T3) e AZD1222/BNT162b2 (T4) (Fig. 2B). Nos grupos AZD1222/AZD1222 e infecção/vacinação prévia, a primeira dose aumentou significativamente a frequência de células IFN-c plus entre as células T CD4 plus, mas a segunda dose não aumentou ainda mais a frequência.

3.2. Comparação de títulos de Ab entre diferentes regimes

Em seguida, comparamos os títulos de pico de Ab de ligação entre os diferentes regimes de vacinação. Como títulos de pico, selecionamos títulos anti-S IgG após a segunda dose nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e após a primeira dose no grupo de infecção/vacinação prévia. Os títulos máximos de anti-S IgG foram significativamente maiores no grupo de vacinação AZD1222/BNT162b2 do que nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2 ou AZD1222/AZD1222 (Fig. 3A). Da mesma forma, os títulos máximos de anti-S IgG foram significativamente maiores no grupo de infecção/vacinação prévia do que nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2 ou AZD1222/AZD1222. Não houve diferença nos títulos anti-S IgG entre os grupos AZD1222/BNT162b2 e infecção prévia/vacinação. Também avaliamos os títulos de nAb nos momentos de pico: após a segunda dose nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e após a primeira dose no grupo de infecção/vacinação anterior. Notavelmente, os títulos de nAb foram significativamente maiores no grupo de vacinação AZD1222/BNT162b2 do que nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2 ou AZD1222/AZD1222 (Fig. 3B). Além disso, os títulos de nAb foram significativamente maiores no grupo de infecção/vacinação anterior do que nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2 ou AZD1222/AZD1222. Não houve diferença nos títulos de nAb entre os grupos AZD1222/BNT162b2 e infecção/vacinação prévia. O nível de resposta humoral induzida por diversos regimes de vacinação foi categorizado em respondedores fortes, moderados e nenhum/fraco com base na classificação percentil. A proporção de respondedores fortes foi maior no grupo de infecção/vacinação anterior, seguido pelo grupo de vacinação AZD1222/BNT162b2 em relação à análise de anti-S IgG (Fig. 3C) e nAb (Fig. 3D). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que iniciação e reforço heterólogos, incluindo vacinação AZD1222/BNT162b2 e infecção/vacinação prévia, são mais eficientes na geração de respostas humorais do que iniciação e reforço homólogos.

3.3. Comparação de respostas de células T CD4 mais específicas de S entre diferentes regimes

Também comparamos as respostas de células T CD4 mais específicas entre os diferentes regimes de vacinação nos pontos de pico: após a segunda dose nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e após a primeira dose nos grupos de vacinação anteriores grupo infecção/vacinação. Ao contrário dos títulos anti-S IgG e nAb, a frequência de células IFN-c mais entre as células T CD4 mais foi maior no grupo de vacinação BNT162b2/BNT162b2 (Fig. 4A). A proporção de respondedores fortes também foi maior no grupo de vacinação BNT162b2/BNT162b2, seguido pelo grupo de infecção/vacinação anterior (Fig. 4B). Esses resultados mostram que a imunização com o segundo reforço homólogo de BNT162b2 provoca respostas de células T de memória com mais eficiência do que a segunda vacinação de reforço heterólogo ou a primeira dose de vacinação após infecção natural por SARS-CoV-2. Pelo contrário, os regimes primário-reforço heterólogos são mais propensos a desenvolver níveis mais elevados de respostas imunes humorais. Também analisamos a frequência relativa de células T CD4+ polifuncionais que produzem simultaneamente múltiplas citocinas (isto é, IFN-c, IL-2 e/ou TNF). O grupo de vacinação BNT162b2/BNT162b2 exibiu frequências significativamente mais altas de células polifuncionais produzindo 2 citocinas entre as células T CD4 mais específicas de S do que os grupos de vacinação AZD1222/AZD1222 ou AZD1222/BNT162b2 (Fig. 4C). Não houve diferença na frequência entre os grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2 e infecção/vacinação prévia. A frequência de células polifuncionais foi significativamente maior no grupo de vacinação AZD1222/BNT162b2 do que no grupo de vacinação AZD1222/AZD1222. Gráficos de pizza representando células T CD4+ simples, duplas e triplamente positivas em termos de produção de citocinas respondendo a conjuntos de peptídeos sobrepostos S também indicaram uma frequência relativamente alta de células duplas ou triplamente positivas na vacinação BNT162b2/BNT162b2 e anteriores grupos de infecção/- vacinação (Fig. 4D).

3.4. Respostas imunes contra a variante Delta entre diferentes regimes

Finalmente, analisamos as respostas imunes contra a variante Delta. Nesta análise, incluímos indivíduos convalescentes que se recuperaram da infecção por SARS-CoV-2 Delta para comparação. Os títulos de nAb específicos da variante Delta foram significativamente maiores no grupo de infecção/vacinação anterior do que nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 ou AZD1222/BNT162b2, e foram ainda maiores do que nos indivíduos convalescentes Delta (Fig. 5A) . Também examinamos as respostas das células T CD4+ contra a proteína S da variante Delta. Nesta análise, realizamos ICS de IFN-c após estimulação direta ex vivo usando dois conjuntos diferentes de pools de peptídeos S compreendendo regiões não conservadas de sequências S entre as cepas Wuhan e Delta e calculamos a razão da frequência de IFN-c específico Delta S mais células para a frequência de IFN-c plus específico de Wuhan S. Como esperado, a proporção foi maior nos indivíduos convalescentes do Delta. Curiosamente, a proporção foi maior no grupo de infecção/vacinação anterior do que no grupo de vacinação BNT162b2/BNT162b2 (Fig. 5B), embora as respostas de células T CD4 mais específicas de Wuhan S tenham sido mais altas no grupo de vacinação BNT162b2/BNT162b2 (Fig. 4A). Tomados em conjunto, esses resultados indicam que as respostas de nAb e células T CD4+ que reconhecem a variante Delta são geradas com mais eficiência por infecção/vacinação prévia do que os regimes de vacinação homólogos ou heterólogos.

Fig. 2. Respostas de anticorpos e células T induzidas por diversos regimes de iniciação-reforço. Respostas imunes longitudinais de acordo com o cronograma de amostragem desde a pré-vacinação até 14 semanas após a primeira vacinação. (A) Anticorpos de ligação específica para pico SARS-CoV-2 foram medidos em BNT162b2/BNT162b2 (n=22), AZD1222/AZD1222 (n=20), AZD1222/ BNT162b2 (n {{ 20}}) e grupos de infecção/vacinação prévia (n=6). (B) SARS-CoV-2 respostas de células T CD4 específicas para pico foram medidas em BNT162b2/BNT162b2 (n=19), AZD1222/AZD1222 (n=18), AZD1222/BNT162b2 (n=9) e grupos de infecção/vacinação prévia (n=7). Os dados são apresentados como média geométrica ± DP geométrico (A) ou média ± DP (B). As análises estatísticas entre os pontos de tempo dentro de cada grupo foram realizadas usando o teste de posto sinalizado de Wilcoxon. ns, não significativo; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Fig. 3. Respostas imunes humorais em pontos de tempo de pico. (A) SARS-CoV-2 anticorpos de ligação específicos de pico foram comparados entre BNT162b2/BNT162b2 (n=22), AZD1222/ AZD1222 (n=20), AZD1222/BNT162b2 (n {{ 15}}) e grupos de infecção/vacinação anteriores (n=6) nos horários de pico. (B) Anticorpos neutralizantes foram comparados entre BNT162b2/BNT162b2 (n=22), AZD1222/AZD1222 (n=20), AZD1222/BNT162b2 (n=9) e infecção/vacinação prévia ( n=11) grupos em pontos de horário de pico. Os pontos de pico foram selecionados da seguinte forma: após a segunda dose nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e após a primeira dose no grupo de infecção/vacinação anterior. Os dados são apresentados como média geométrica ± DP geométrico e analisados ​​quanto à significância usando o teste de Mann-Whitney. (C e D) As porcentagens de participantes com níveis variados de respostas imunes humorais. A quantificação do tipo de respondedor (forte, moderado e nenhum/fraco) é expressa como uma fração do número de vacinados em cada grupo. Os tipos de respondedores foram determinados pela pontuação percentual calculada de todos os participantes vacinados. ns, não significativo; *P < {{4{42}}}}.05, **P < 0.01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

4. Discussão

As vacinas de mRNA atualmente autorizadas e as vacinas de vetores de adenovírus demonstraram eficácia notável na prevenção da COVID-19. No entanto, a vacinação primária-reforço heteróloga tem sido considerada para melhorar a imunogenicidade e mitigar a escassez intermitente de suprimentos [13]. Além disso, questões de segurança foram levantadas com as vacinas de vetor de adenovírus após o reconhecimento de eventos adversos graves, incluindo trombose venosa com risco de vida associada à vacinação com AZD1222, especialmente em mulheres mais jovens [14,15]. Isso levou à imunização de reforço de mRNA heterólogo para aqueles que já haviam recebido a primeira dose de AZD1222. Embora nenhum dado de eficiência estivesse disponível, muitas autoridades nacionais de saúde adotaram regimes heterólogos de vacinas COVID-19 autorizadas. Assim, um estudo comparativo das respostas imunes humoral e celular induzidas por diversos esquemas de vacinação de reforço-primário é informativo e ajuda a entender melhor os desafios do mundo real. No presente estudo, demonstramos a indução diferencial de imunidade humoral e celular por vacinações heterólogas prime-boost (Tabela Complementar 4). Em total contraste com os níveis de Ab de ligação específica e títulos de neutralização, que foram mais altos no grupo de vacinação AZD1222/BNT162b2, as respostas de células T CD4 mais específicas S foram mais altas no grupo de vacinação BNT162b2/BNT162b2, não no grupo de vacinação AZD1222/BNT162b2 grupo. Os níveis relativamente baixos de respostas de células CD4 mais T específicas do S em participantes vacinados com AZD1222/BNT162b2-foram inesperados e ainda podem colocar esses indivíduos em risco de infecção grave por SARS-CoV-2. Nossos achados diferem daqueles relatados por Schmidt e colegas, que sugeriram que, após o reforço heterólogo de BNT162b2, os títulos de nAb e as respostas de células T aumentaram significativamente em indivíduos preparados com AZD1222-[7]. No entanto, a frequência absoluta de células CD69 mais IFN-c mais entre as células T CD4 mais aumentou apenas marginalmente, e este estudo excluiu análises aprofundadas da polifuncionalidade das respostas das células T específicas para S. Para indivíduos previamente infectados, a primeira dose da vacina pode atuar como uma imunização de reforço e induzir potentemente respostas humorais e celulares [16,17]. Como se presume que o título de nAb seja um correlato chave da proteção contra a infecção por SARS-CoV-2 [18], nossos resultados se encaixam bem com a descoberta recente de um aumento benéfico da imunidade adquirida por infecção, com eficácia vacinal ajustada de > 90 por cento após a primeira dose em receptores de vacina que tiveram infecção prévia por SARS-CoV-2 [19]. Além disso, apesar da fuga considerável de respostas nAb contra a variante Delta entre os participantes do estudo, observamos os níveis mais altos de nAb reconhecendo a variante Delta no grupo de participantes com infecção prévia por SARS-CoV-2 do tipo selvagem e vacinação. No entanto, de acordo com o grupo de vacinação heteróloga AZD1222/BNT162b2, aqueles com infecção prévia que foram vacinados tiveram uma resposta de células T CD4 mais específica S mais fraca do que indivíduos com vacinação homóloga BNT162b2/BNT162b2 sem infecção prévia. Notavelmente, nossos resultados mostram que duas doses de BNT162b2 levam a uma indução confiável e robusta de respostas de células T CD4 mais específicas de S, significativamente mais altas do que outros regimes de vacinação de iniciação e reforço. Essas descobertas são consistentes com um relatório recente sobre quatro vacinas COVID-19 diferentes [20], enquanto nossa análise incluiu regimes heterólogos de iniciação-reforço e imunidade híbrida de infecção e vacinação anteriores. Consequentemente, as plataformas de vacina de mRNA podem ser selecionadas por sua capacidade de induzir respostas robustas de células CD4 mais T de memória. À medida que a incidência de infecção após a vacinação aumenta em todo o mundo, há um interesse crescente na proteção da imunidade contra COVID grave-19. À medida que novas variantes de SARS-CoV-2 continuam a surgir e evitam as defesas imunológicas humorais, a imunidade celular, que visa um amplo espectro de epítopos de SARS-CoV-2 reconhecidos por células T, pode fornecer imunidade protetora estável [21 ], embora os determinantes das respostas celulares na proteção mediada por vacinas ainda não estejam definidos com precisão. Portanto, ainda não está claro se o aumento da imunogenicidade humoral da vacinação heteróloga AZD1222/BNT162b2 se traduz em proteção melhorada, e isso requer mais estudos. Além disso, é preciso investigar se as pessoas que desenvolveram respostas ruins de células T após a vacinação, como aquelas preparadas com AZD1222, podem se beneficiar de formulações de vacinas de células T [22]. Tanto a imunidade induzida por infecção quanto a imunidade induzida por vacina diminuem naturalmente com o tempo; no entanto, maior proteção parece ser conferida a pessoas que já foram infectadas com SARS-CoV-2 [23]. Em indivíduos vacinados, o avanço da infecção com a variante Omicron induz respostas nAb menores do que a infecção com a variante Delta [24], e relativamente pouco se sabe sobre as possíveis consequências da imunidade híbrida conferida pela infecção e vacinação com diferentes cepas. No entanto, a presença de células T específicas S polifuncionais em participantes previamente infectados e vacinados em nosso estudo é consistente com um declínio mais lento na proteção contra COVID grave-19 nessa população e pode contribuir para modificar a gravidade da doença após a reinfecção com SARS -CoV-2 variantes [25,26]. O presente estudo tem várias limitações. Primeiro, os pequenos tamanhos de amostra na coorte tornam a análise estatística robusta desafiadora; portanto, nossos achados precisarão ser mais validados em coortes maiores. Em segundo lugar, não fomos capazes de testar amostras em pontos de tempo posteriores para determinar a durabilidade e diminuição das respostas imunes humorais e celulares. Terceiro, nossos resultados podem subestimar o impacto dos epítopos de células T subdominantes fora dos epítopos dominantes. Em quarto lugar, estudamos apenas linfócitos circulantes, e estudos futuros de drenagem de gânglios linfáticos após a vacinação podem ser necessários para entender os mecanismos subjacentes às respostas diferenciais observadas aqui. Em resumo, o estudo atual com comparações diretas de acordo com a idade lança luz sobre a imunogenicidade humoral e celular discordante de priming e reforço heterólogo no contexto de exposições ao antígeno SARS-CoV-2. Nossas descobertas destacam como a experiência imunológica individual molda a resposta imune subsequente provocada pela vacinação{107}} da COVID. Dados adicionais de eficácia no mundo real e investigações laboratoriais informarão melhor a estratégia de vacinação mais adequada para proteção contra variantes emergentes de SARS-CoV-2, com implicações para o desenvolvimento de plataformas de vacinas de última geração.

Fig. 4. Respostas imunes celulares em pontos de pico. (A) As frequências de células IFN-c mais específicas de pico entre as células T CD4 mais foram comparadas entre BNT162b2/BNT162b2 (n=19), AZD1222/AZD1222 (n=18), AZD1222/BNT162b2 ( n=9) e grupos de infecção/vacinação anteriores (n=7) nos horários de pico. Os pontos de pico foram selecionados da seguinte forma: após a segunda dose nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e após a primeira dose no grupo de infecção/vacinação anterior. (B) As porcentagens de participantes com níveis variados de respostas imunes celulares. A quantificação do tipo de respondedor (forte, moderado e nenhum/fraco) é expressa como uma fração do número de vacinados em cada grupo. Os tipos de respondedores foram determinados pela pontuação percentual calculada de todos os participantes vacinados. (C) As frequências de células T CD4 mais específicas de pico polifuncionais que produzem qualquer combinação de IFN-c, IL-2 ou TNF em cada grupo de participantes vacinados. (D) A fração de células T CD4 mais específicas de pico é positiva para um determinado número de citocinas. Os dados são apresentados como média ± DP. A significância foi analisada por meio do teste de Mann-Whitney (A e C). ns, não significativo; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

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Fig. 5. Respostas imunes variantes cruzadas contra o Delta induzidas por diversos regimes primário-reforço. (A) As amostras de plasma foram analisadas por ensaios de neutralização de redução de placas para a variante SARS-CoV-2 Delta em BNT162b2/BNT162b2 (n {{1{55}}}}), AZD1222/AZD1222 (n {{ 13}}), AZD1222/BNT162b2 (n=9), infecção/vacinação prévia (n=11) e grupos Delta-convalescentes (n {{20}}). Os anticorpos neutralizantes delta foram comparados entre os grupos nos seguintes momentos: após a segunda dose nos grupos de vacinação BNT162b2/BNT162b2, AZD1222/AZD1222 e AZD1222/BNT162b2 e após a primeira dose no grupo de infecção/vacinação anterior. (B) PBMCs foram analisados ​​por coloração intracelular para IFN-c após estimulação direta ex vivo usando dois conjuntos diferentes de conjuntos de peptídeos S compreendendo regiões não conservadas de sequências de pico entre as cepas Wuhan e Delta em BNT162b2/BNT162b2 (n {{37} }), AZD1222/AZD1222 (n {{4{59}}}}), AZD1222/BNT162b2 (n=9), infecção/vacinação prévia (n=7) e Delta-convalescente ( n=17) grupos. A razão entre a frequência de células T CD4 plus produtoras de IFN-c contra o pico Delta e a frequência de células T CD4 plus produtoras de IFN-c contra o pico Wuhan foi calculada em cada grupo. Os dados são apresentados como média geométrica ± DP geométrico (A) ou média ± DP (B) e analisados ​​quanto à significância usando o teste de Mann-Whitney. ns, não significativo; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

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