Memória aprimorada de reconhecimento de objetos usando estimulação magnética transcraniana repetitiva pós-codificação Parte 1

resumo

Antecedentes: Sabe-se que a estimulação cerebral afeta vias canônicas e proteínas envolvidas na memória. No entanto, existem resultados conflitantes sobre a capacidade da estimulação cerebral de melhorar a memória, o que pode ser devido a variações no tempo de estimulação.

Existe uma estreita ligação entre estimulação cerebral e memória. A estimulação cerebral pode promover a atividade dos neurônios cerebrais, melhorando assim a memória e a capacidade cognitiva.

Primeiro, a estimulação cerebral pode promover a conexão entre os neurônios. Ao estimular o cérebro, a comunicação e a conexão entre os neurônios se tornarão mais frequentes e eficientes. Essas conexões se tornarão mais estáveis ​​e reais, tornando o cérebro mais flexível, criativo e ponderado. Essas vantagens lhe darão uma vantagem no aprendizado e na vida.

Em segundo lugar, a estimulação cerebral pode trazer uma memória mais forte. A estimulação cerebral frequente pode aumentar a vitalidade e a saúde do cérebro, melhorando assim a memória. Existe uma relação vital entre a saúde do cérebro e a memória e as atividades cognitivas. A estimulação cerebral ajudará o cérebro a se recuperar, crescer e reparar. Dessa forma, será mais fácil adquirir conhecimentos ou obter informações significativas da vida, e poderemos mantê-los melhor armazenados e lembrados no cérebro.

Além disso, a estimulação cerebral também pode promover o aprendizado e a aplicação de novas informações. Na vida, encontramos constantemente vários problemas com os quais não sabemos como lidar. Ao estimular o cérebro com frequência, podemos compreender essas informações complexas com mais rapidez e precisão, adaptar-nos gradualmente a elas, encontrar maneiras de processá-las e lidar melhor com elas, tornando-nos mais ágeis ao lidar com as coisas.

Em suma, através da estimulação cerebral, podemos ser mais flexíveis, criativos e atenciosos. Também enfrentaremos os problemas e desafios da vida com mais confiança. A estimulação cerebral é uma boa maneira de melhorar nossa capacidade cognitiva, fortalecer o aprendizado e melhorar a memória. Vamos seguir nosso plano de exercícios cerebrais, manter uma atitude positiva, ser positivos, buscar um melhor desenvolvimento pessoal e realizar nossos ideais. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e o Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque o Cistanche também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento, que são muito importantes para a memória e o aprendizado. Além disso, Cistanche também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro receba nutrição e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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Hipótese: Nossa hipótese é que a estimulação magnética transcraniana repetitiva (EMTr) dada após uma tarefa de aprendizagem e no período anterior à recuperação poderia ajudar a melhorar a memória. Métodos: Implantamos camundongos machos B6129SF2/J (n=32) com uma fixação craniana para fixar a bobina de EMTr. que os ratos poderiam receber estimulação consistente na área frontal enquanto se moviam livremente.

Os ratos então passaram pela fase de amostragem do teste de reconhecimento de objetos e receberam tratamento +3, +24, +48 horas após o teste. O tratamento consistiu em 10 min de estimulação EMTr de 10 Hz (EMT, n=10), tratamento simulado (SHAM, n=11) ou um grupo controle que não fez o teste comportamental nem recebeu EMTr (CONTROLE n=11).

Às 72h, os ratos foram testados quanto à exploração do objeto novo versus objeto familiar. Resultados: Às 72-h, apenas os ratos que receberam EMTr tiveram maior exploração do objeto novo do que do objeto familiar.

Mostramos ainda que a promoção do GluR2 sináptico e a manutenção das conexões sinápticas no córtex perirrinal e no CA1 do hipocampo são importantes para este efeito.

Além disso, encontramos evidências de que essas alterações estavam ligadas às vias CAMKII e CREB nos neurônios do hipocampo.

Conclusão: Ao vincular os efeitos biológicos conhecidos da EMTr às vias de memória, fornecemos evidências de que a EMTr é eficaz na melhoria da memória quando administrada durante as fases de consolidação e manutenção.

1. Introdução

Sabe-se que a estimulação cerebral não invasiva afeta vias canônicas e proteínas envolvidas na memória. No entanto, estudos atuais que examinaram os efeitos da estimulação cerebral, especificamente a estimulação magnética transcraniana repetitiva (EMTr), na memória, tiveram resultados conflitantes [1].

Uma razão para isso poderia ser o direcionamento da estimulação em momentos diferentes durante a formação e recuperação da memória [1]. As evidências sugerem que direcionar a EMTr nas fases pós-codificação ou consolidação pode ser benéfica para o desenvolvimento de memórias estáveis ​​de longo prazo [2]e4].

A consolidação é a fase que faz a transição de uma memória de curto prazo para uma memória de longo prazo (LTM). O processo depende da síntese proteica específica do tempo, que transforma as novas informações em modificações sinápticas estáveis ​​com densidades aumentadas de receptores pós-sinápticos [5,6].

A importância desta síntese proteica específica do tempo e da região foi demonstrada em estudos que bloqueiam a síntese proteica denovo. Por exemplo, um estudo que bloqueou a síntese de proteínas no hipocampo 3-h, mas não 6-h após um evento de aprendizagem, prejudicou o LTM, mas não a memória de curto prazo em ratos [7].

Destas proteínas, foram identificadas várias vias de sinalização importantes que são reguladas positivamente e importantes neste processo.

Existem múltiplas vias de sinalização na sinapse que sinalizam a inervação do receptor e a estabilidade da coluna necessária para o LTM. Estes são ativados através de um evento de estímulo de potenciação de longo prazo (LTP) e são frequentemente aumentados com fatores neurotróficos, como o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) [8].

O BDNF é de particular importância na criação de memórias de longo prazo, pois ao bloquear a síntese do BDNF em momentos específicos, o aprendizado seguinte bloqueia sua consolidação [5].

O BDNF liga-se aos receptores de tirosina quinase (TrkB) e pode iniciar múltiplas vias de sinalização, como a proteína quinase ativada por mitógeno / quinase regulada por sinal extracelular (ERK) ou vias de fosfolipase Cg. Essas vias de sinalização convergem para a ativação da proteína de ligação ao elemento responsiva ao AMP cíclico do fator de regulação da transcrição (CREB).

Proteínas ativadas por cálcio, como a proteína quinase II dependente de cálcio / calmodulina (CAMKII), também desempenham um papel na regulação do gene ativado por CREB [9e11] e também podem mediar diretamente a expressão sináptica dos receptores AMPA glutamatérgicos e estabilizar a estrutura sináptica [12e15] .

Juntas, essas vias de sinalização resultam em uma expressão e translocação do receptor shiftina que medeia o aumento da ativação na sinapse, servindo assim para estabilizar as sinapses e contribuir para a manutenção da LTP prolongada [16]. É importante ressaltar que estudos anteriores mostraram que é possível melhorar a consolidação da memória. através da reativação periódica dessas vias de consolidação em ambientes experimentais [17].

Estudos anteriores demonstraram a capacidade da EMTr de influenciar diretamente essas vias específicas no cérebro. Estudos in vivo mostraram que a EMTr aumenta os níveis de BDNF no cérebro [18e20]. Mais diretamente, a EMTr in vitro resulta em aumento de Ca2+ nos neurônios, uma molécula de sinalização predominante na via CAMKII [18]. O aumento da fosforilação de CAMKII e CREB também foi demonstrado in vitro após EMTr [20,21].

A EMTr também influencia diretamente a expressão do receptor sináptico, aumentando a densidade do receptor AMPA [22e24] e regulando as subunidades do receptor AMPA, Receptor de Glutamato 1 (GluR1) e Receptor de Glutamato 2 (GluR2) [25,26].

Portanto, a EMTr ativa essas vias e seria mais eficaz para melhorar a memória durante a fase de consolidação. Este estudo examinou o uso da EMTr para melhorar a memória, visando a estimulação das fases de consolidação e manutenção da memória.

Nossa hipótese é que a EMTr administrada após uma tarefa de aprendizagem, e dentro do período anterior à recuperação, poderia melhorar o desempenho da memória. Isso seria resultado da reativação periódica de vias envolvidas na memória, que também são influenciadas pela EMTr.

Usando um modelo animal de um LTM episódico específico, mostramos que a EMTr melhorou a memória do objeto quando administrada dentro do 72-h entre a codificação e a recuperação, enquanto os ratos que receberam o tratamento SHAM não mantiveram a memória.

Este efeito foi apoiado por alterações nas conexões sinápticas no córtex perirrinal e CA1, ativação elevada de CREB e CAMKII e uma mudança dinâmica nas subunidades do receptor AMPA na sinapse.

2. Materiais e métodos

2.1. Animais

Utilizamos n=33 camundongos machos B6129SF2/J com idade entre 2 e 4 meses para este estudo. Todos os ratos viveram sob um ciclo de 12-h claro/12-h escuro com acesso livre a ração seca e água. Todos os cuidados e procedimentos com animais estavam em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e foram de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal de VA Palo Alto.

2.2. Cirurgia de suporte de bobina

Cada um dos ratos foi submetido a uma cirurgia para fixar um suporte de bobina que permitiu a estimulação consistente da EMTr dos animais acordados. Detalhes sobre o procedimento cirúrgico podem ser encontrados em Poh et al., 2018[27].

Resumidamente, os animais foram anestesiados com isoflurano a 3% e mantidos a 2e3% com cone nasal. Após barbear e limpar o local para esterilidade, foi feita uma incisão sagital de aproximadamente 10 mm de comprimento com lâmina de bisturi.

O periósteo foi raspado suavemente e um suporte de bobina pré-fabricado foi fixado no bregma com cianoacrilato e reforçado com cimento dentário. A ferida foi então suturada ao redor do suporte da bobina.

2.3. Procedimentos de comportamento e estimulação

Para uma visão geral dos procedimentos de comportamento e estimulação, consulte a Fig. 1a. Após cinco dias de recuperação da cirurgia de suporte de bobina, os camundongos foram habituados a uma gaiola de estimulação separada e a procedimentos de bobina por três dias.

No último dia de habituação da bobina, os ratos foram submetidos ao Teste de Campo Aberto (OFT) por 10-min, que também serviu como habituação para o Teste de Reconhecimento de Objetos (ORT). No dia seguinte os ratos foram expostos à fase de amostragem ORT com dois dos mesmos objetos durante 10 minutos. Os objetos eram de tamanho semelhante, mas com cores e formas diferentes. Esses objetos foram colocados em cantos opostos de uma arena quadrada de testes.

Três horas depois, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos de tratamento, TMS, que recebeu estimulação ativa de 10-minuto de EMTr de 10 Hz, e SHAM, que foram tratados da mesma forma, exceto com a bobina desligada durante a estimulação.

Os ratos TMS e SHAM foram tratados novamente24- e 48-h após a familiarização. No último dia (72-h pós-familiarização), os ratos foram expostos à fase de teste ORT por 10-min com um objeto familiar e um objeto novo.

Para determinar se a exploração do objeto novo foi maior do que o objeto familiar, calculamos o índice de discriminação (((exploração de objeto novo) - (exploração de objeto familiar))/((exploração de objeto novo)þ(exploração de objeto familiar))). Escolhemos 72-h, pois estudos anteriores [28] e dados piloto (não mostrados) demonstraram que, em condições normais, os ratos não retêm a memória ORT neste momento.

Tanto os tipos de objetos quanto a localização do novo objeto foram equilibrados entre os grupos. Para a habituação, amostragem e sessão de sondagem, os camundongos sempre tiveram 30 minutos para se aclimatarem à sala de experimentos antes dos testes, e os objetos e a arena foram limpos com etanol 70% após cada camundongo.

Para investigar os efeitos apenas da tarefa comportamental, também incluímos um grupo que foi tratado da mesma forma que os camundongos SHAM, exceto que não fizeram a TRO.

Em vez disso, eles foram expostos a uma sessão de amostragem e sondagem, mas sem objetos. Um camundongo no grupo TMS não atingiu o limite exigido de uma exploração total de 20-s de ambos os objetos na sessão de amostragem e, portanto, foi excluído do estudo. Este rato foi excluído da análise bioquímica subsequente.

Todos os outros ratos atingiram os critérios tanto na sessão de amostragem quanto na sessão de sondagem. Excluindo um camundongo, os números finais nos grupos experimentais foram TMS n=10, SHAM n=11 e CONTROLn=11.

2.4. Mancha ocidental

Três horas após a sessão de sondagem, os camundongos foram sacrificados com overdose de cetamina, e os tecidos do hipocampo e do córtex frontal foram rapidamente dissecados em gelo seco e armazenados a 80°C.

Essas amostras foram homogeneizadas com 300 mL de Reagente de Extração de Proteína Sináptica Syn-Per gelado (Thermo Scientific) com 1x Coquetel Inibidor de Protease (Roche) e 1x Coquetel Inibidor de Fosfatase (Roche) (por 10 ml), por 5 s.

Os homogeneizados foram centrifugados a 1200 g por 10 minutos para remover restos celulares. O sobrenadante foi retirado e uma porção do sobrenadante foi aliquotada para análise do homogeneizado completo. O restante foi centrifugado a 15,{3}} g por 20-min a 4 C.

Os pellets, contendo sinaptossomas, foram suavemente ressuspensos em Syn-Per a 1,5 ml/g de tecido, para criar o homogeneizado sináptico. Uma nanogota foi usada para quantificar a concentração de proteína na amostra.

O Homogenato Completo e o Homogenato Sináptico foram armazenados a 80°C até a análise. Ambos os homogenatos Full e Synaptic foram diluídos para 4 mg/ml em PBS gelado e misturados com tampão de carga de proteína 1:4 (LiCor) e mercaptoetanol 1:4000. Eles foram então aquecidos a 95°C por 5-min e carregados em Mini PROTEAN TGX Gels (Bio-Rad).

Após separação por eletroforese a 100 V, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare Lifesciences). As membranas foram lavadas em solução de pré-tratamento de antígeno SuperSignal WesternBlot Enhancer (Thermo Scientific) e depois bloqueadas com tampão de bloqueio (Rockland) e soro de cabra a 1% por 1-h.

Após o bloqueio, a membrana foi incubada com anticorpos primários diluídos em SuperSignal Western Blot Enhancer Primary Antibody Diluent (Thermo Scientific) durante a noite à temperatura ambiente.

Os anticorpos primários utilizados foram ERK 1/2 monoclonal de camundongo (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), fosfo-p44/42 MAPK monoclonal de coelho (pERK 1:1000, Cell SignalingTechnologies), CREB monoclonal de camundongo (1:500, Cell SignalingTechnologies), monoclonal de coelho fosfo-CREB (S133) (pCREB1:500, Cell Signaling Technologies), CAMKIIalpha monoclonal de coelho (1:1000, Cell Signaling Technologies), fosfo-CAMKII monoclonal de camundongo (Thr286) (pCAMKII 1:1000, Invitrogen), GluR1 monoclonal de camundongo (1: 750, Santa Cruz Biotechnology), fosfo-GluA1 monoclonal de coelho (S845) (pGluR1(845) 1:750, CellSignaling Technologies), fosfo-GluA1 monoclonal de coelho (S831)(pGluR1(831) 1:750, Cell Signaling Technologies), camundongo GluR2 monoclonal (1:750, Invitrogen), fosfo-GluR2 policlonal de coelho (S880) (pGluR2 1:500, Invitrogen), TrkB monoclonal de camundongo (1:500, BD Transduction Laboratories) ou fosfo-TrkB policlonal de coelho ( Tyr816) (pTrkB 1:500, EMD Millipore).

Cofilin policlonal de coelho (1:2000, Sigma) foi utilizado para controle de carga padrão. Após lavagem em TBS-Tween, a membrana foi incubada durante 1 h à temperatura ambiente em cabra anti-coelho 800 e cabra anti-murganho 680 (1:3000, LiCor).

O imunotransferência foi visualizado usando o sistema de imagem infravermelho Odyssey Clx (LiCor) e a análise dos dados da intensidade da banda foi realizada usando o Image Studio (LiCor).

2.5. Imunohistoquímica

Três horas após a sessão de sondagem, os ratos sacrificados com overdose de cetamina foram então perfundidos transcardialmente com 50 ml de PBS 1 M frio.
Os cérebros foram imediatamente pós-fixados em solução de paraformaldeído a 4% a 4°C e transferidos para sacarose a 30% em PBS por pelo menos 48-h antes da criossecção em seções de 30 mm. Seções flutuantes foram bloqueadas e permeabilizadas com 10% de soro de cabra e burro em 0,1% de Triton em 1 M PBS e depois incubadas por 48-h com o PSD95 policlonal de coelho (1:300, Thermo Scientific) e SV2A monoclonal de camundongo (1:300, Biotecnologia Santa Cruz).

As seções foram então incubadas por 1-h com os anticorpos secundários Alexa Fluor cabra anti-coelho 568 (1:500, Invitrogen) e Alexa Fluorgoat anti-mouse 488 (1:500, Invitrogen. As fatias foram então lavadas com corante nuclear DAPI (1:1000, Sigma), montadas em lâminas e cobertas com Fluoromount (Thermo Scientific).

A coloração foi quantificada no córtex frontal (FC), hipocampo CA1 dorsal, córtex entorrinal (CE) e córtex perirrinal (PC).

Imagens empilhadas em Z foram tiradas com um microscópio fluorescente BZ-X700 (Keyence) com ampliação de 40x para identificar pontos sinápticos em toda a fatia. O total de pontos PDS95, pontos SV2A e colocalizados (definidos como dois pontos próximos um do outro ou sobrepostos) foram contados a partir de pelo menos quatro imagens para cada área, e a média dos resultados obtidos para cada camundongo. A quantificação de% colocalizado foi completada pela contagem (sobreposição de SV2A e PSD95)/(total de SV2A e PSD95) puncta.

2.6. Estatísticas

Todos os dados atenderam aos pressupostos de normalidade avaliados pelo exame da assimetria, da curtose e do valor de Shapiro Wilk dos resíduos calculados e não houve violações da homogeneidade da variância avaliada pela estatística de Levene.

Para os testes de comportamento, foram utilizados testes t de Student para comparar SHAM com TMS, para a exploração de objetos novos e familiares dentro dos grupos foi utilizada uma ANOVA bidirecional de medidas repetidas.

Os dados de imunohistoquímica e Western blot foram testados quanto à significância usando uma One-WayANOVA. Para todas as comparações post-hoc pareadas, foi utilizado um ajuste de Tukey com significância em p < 0,05.

Caso a homogeneidade da variância fosse violada, a significância era determinada com o Teste de Welch e posterior post-hoc corrigido com Games-Howell, casos estes anotados nos resultados. Todas as estatísticas foram realizadas no SPSS (versão 22, IBM) e os gráficos foram produzidos no GraphPad (versão 7, Prism).

For more information:1950477648nn@gmail.com