Identificação de ESTs responsivos a peróxido de hidrogênio envolvidos na biossíntese de glicosídeos feniletânicos em cultura de células Cistanche Salsa
Mar 17, 2022
Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
J. CHEN et al
Abstrato
O peróxido de hidrogênio é um elicitor abiótico eficaz que pode induzir a biossíntese de metabólitos secundários em plantas. Mostramos que na cultura em suspensão de células de uma planta medicinal tolerante ao salCistanchesalsa, a produção de componentes bioativosfeniletanoideglicosídeos(PeGs) aumentou após o tratamento com H2O2. Para identificar genes relacionados a PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese afetada por H2O2, construímos uma biblioteca de hibridização subtrativa de supressão de genes responsivos a H2O2 usando umCistanchesalsalinhagem celular e identificaram 105 marcadores de sequência expressa (ESTs) e 85 genes. A anotação funcional da biblioteca EST e análises de ontologia gênica mostraram genes relacionados a várias respostas ao estresse, biossíntese de metabólitos secundários e regulação transcricional. Entre eles, identificamos dois genes relacionados aos PeGs(feniletanoideglicosídeos)via de biossíntese (4-cumarato coenzima A ligase e cinamato 4-hidroxilase), e dois fatores de transcrição do tipo WRKY. As expressões dos genes selecionados após o tratamento com H2O2 foram analisadas por RT-qPCR. Aumento precoce da transcrição de PeG(feniletanoideglicosídeos)genes da via de biossíntese após o tratamento revelaram que H2O2 induziu PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese via up-regulation de seus genes-chave.
Palavras-chave adicionais: cinamato-4-hidroxilase, 4-coumarato coenzima A ligase, hibridização subtrativa de supressão.Cistanchesalsa. feniletanoideglicosídeos.
Introdução
Cistanchesalsaé um parasita de plantas perenes na raiz de Haloxylos ammodendrun, e cresce na área desértica do oeste da China. Durante séculos,Cistancheespécie tem sido usada como fitoterapia tradicional (Wang et al. 2012). Os componentes bioativos sãofeniletanoideglicosídeos(PeGs) que têm um efeito notável na eliminação de espécies reativas de oxigênio (ROS), proteção contra radiação, aumento da imunidade e antienvelhecimento (Nan et al. 2013). PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese emCistancheé iniciado a partir da fenilalanina (Fig. 1 Supl.) e o ácido cafeico sintetizado é ainda glicosilado para formar vários PeGs(feniletanoideglicosídeos)(Wang et al. 2012). Três principais PeGs(feniletanoideglicosídeos), echinacoside, acteoside e 2'-acetilacteoside, são considerados os componentes mais ativos emCistanche(Kobayashi et ai. 1984). A fim de melhorar o seu conteúdo emCistanchecultura de células, vários elicitores foram testados, incluindo quitosana, putrescina, Ag plus e estresse osmótico (Ouyang et al. 2005a,b, Cheng et al. 2005, 2006, Liu et al. 2007, Liu e Cheng 2008). No entanto, genes envolvidos em PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese emCistanche, principalmente genes da via do metabolismo da fenilalanina, raramente foram identificados. Apenas um gene que codifica a fenilalanina amônia-liase (PAL) foi recentemente identificado em Cistanche deserticola (Hu et al. 2011). Outros genes que codificam, por exemplo, cinamato-4-hidroxilase (C4H), que pode catalisar a conversão de cinamato em ácido cumárico, e 4-coumarato coenzima A ligase (4CL), um gene essencial para lignina e flavonóides biossínteses, não foram encontrados emCistanche.
Utilizamos a cultura de células deCistanchesalsaestudar PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese e expressão de genes relacionados. Também investigamos o efeito de um elicitor H2O2 eficaz em PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese. Além disso, encontrar genes responsivos precoces envolvidos em PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese, realizamos hibridização subtrativa de supressão (SSH) para construir uma biblioteca de cDNA de genes responsivos a H2O2-.
Fig. 1. Expressão gênica relativa determinada por RT-qPCR após tratamento com H2O2. CsWRKY1 - fator de transcrição WRKY (Contig07), CsC4H1 - cinamato 4-hidroxilase (Contig09), Cs4CL1 - 4-cumarato: ligase (Contig03), CsHSP1 - proteína de choque térmico 70 kDa (Contig 01) e CsSOD1 - superóxido dismutase (Contig16). As células foram tratadas com 80 ug dm-3 H2O2 em meio líquido por 2 h e as expressões foram comparadas com um controle tratado com água. Médias mais - DP de três repetições biológicas; * - P < 0,05,="" **="" -="" p=""><>
Materiais e métodos
A linhagem celular CS2001 foi estabelecida a partir de pétalas deCistanchesalsa(CA Mey.) Beck coletado na província de Neimenggu e subcultivado. O método de cultura foi semelhante a um protocolo publicado anteriormente (Liu et al. 2007). Geralmente, um meio sólido de Murashige e Skoog (1962; MS) foi usado para subcultura e um meio líquido para PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese (foi o meio MS modificado suplementado com 30 g dm-3 de glicose e 2,0 mg dm-3 indol-3-ácido acético). Para o tratamento com H2O2, 5.0 ± 0,2 g de células em período de crescimento rápido, geralmente 20 a 30 d após serem subcultivadas no meio sólido, foram inoculadas em meio líquido de 50 cm3 em um Erlenmeyer de 250 cm3 e cultivadas no escuro com ou sem diferentes concentrações de H2O2. Os PeGs(feniletanoideglicosídeos)o conteúdo após 10 d de indução por H2O2 foi analisado de acordo com um método publicado anteriormente (Liu et al. 2007) baseado em cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa com eluição em gradiente de metanol.
As células 2 h após o tratamento com H2O2 foram coletadas do meio por meio de papel de filtro usando um funil de Büchner, e então foram congeladas em nitrogênio líquido e moídas em pó. Cada 2 g de pó celular foi lisado usando uma mistura de 1 cm3 de 2-mercaptoetanol, 1 cm3 de 200 g dm{{10}} sarcosil, e 8 cm3 de um tampão GTC (isotiocianato de guanidínio 5 M, Tris-HCl 62,5 mM, pH 8,0, EDTA 6,25 mM, pH 8,0, tioureia 5 mM e ditiotreitol 10 mM). As células foram então incubadas em gelo por 15 min, então 1/3 do volume de 8,5 M CH3COOK, pH 6,0, foi adicionado e as células foram incubadas em gelo por 15 min e depois centrifugadas a 15 000 g por 15 min . O sobrenadante foi adicionado a um volume igual de isopropanol para precipitar o RNA total. O RNA total foi posteriormente purificado por um mini kit RNeasy (Qiagen, Hilden, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA mensageiro foi isolado do RNA total usando um kit midi Oligotex mRNA (Qiagen).
feniletanoideglicosídeosdentroCistanchesalsa
Uma biblioteca SSH foi gerada a partir de amostras de células de controle e 30 por cento de H2O2-induzidas 2 h após a eliciação usando um kit de subtração de cDNA selecionado por PCR (Clontech, Mountain View, EUA). Para a construção da biblioteca, os produtos foram purificados separadamente usando um kit de purificação de gel (Qiagen) e clonados em um vetor pGEM usando um kit de clonagem TA (Tiangen, Pequim, China). Plasmídeos de clones independentes foram isolados e sequenciados usando o primer T7. Todas as sequências de tag de sequência expressa (EST) da biblioteca (com as sequências de vetor removidas) foram usadas para montagem de contig com CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3). As ESTs foram agrupadas em contigs e singletons; eles foram usados para busca de homologia usando o programa BLASTx no NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). As sequências foram então anotadas, analisadas e classificadas de acordo com termos de ontologia genética (GO) usando Blast2GO (http://www.blast2go.com).
A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) foi realizada de acordo com Bustin et al. (2009). As amostras de cDNA foram sintetizadas usando um kit de reagentes PrimeScript RT (Takara, Dalian, China) a partir de 0,5 ug de RNA total. A RT-qPCR foi realizada usando os kits SYBR Premix Ex Taq II e ROX plus (Takara) em um sistema de PCR em tempo real ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, EUA) com três réplicas técnicas. Os primers foram projetados usando o software online Primer3 de acordo com as instruções fornecidas pela Takara; iniciadores usados neste estudo estão listados na Tabela 1 Supl. As expressões gênicas foram normalizadas para RNA 18S, cuja expressão foi estável em todas as amostras.
Os resultados foram analisados por meio do R versão 3.1.1, a significância das diferenças foi verificada pelo teste t de Student.
Resultados
O peróxido de hidrogênio induziu a biossíntese de todos os três principais PeGs(feniletanoideglicosídeos)dentroCistanchesalsacélulas em suspensão (Tabela 1), mas sem efeito óbvio no crescimento celular (Fig. S2). O conteúdo de echinacoside aumentou já após o tratamento de 10 ug dm-3 H2O2 (P < 0.05),="" um="" aumento="" maior="" foi="" registrado="" após="" o="" tratamento="" de="" 20="" ug="" dm="" -3="" tratamento="" com="" h2o2="" (p="">< 0,01),="" e="" o="" maior="" aumento="" foi="" após="" os="" tratamentos="" de="" 40,="" 80="" e="" 160="" ug="" dm-3="" h2o2.="" resultados="" semelhantes="" são="" mostrados="" para="" o="" acteosídeo,="" mas="" seu="" conteúdo="" atingiu="" o="" pico="" após="" o="" tratamento="" de="" 80="" ug="" dm-3="" h2o2.="" a="" biossíntese="" de="" 2'-acetilacteoside="" foi="" menos="" sensível="" ao="" tratamento="" com="" h2o2;="" um="" aumento="" significativo="" de="" seu="" conteúdo="" (p="">< 0,05)="" foi="" em="" concentrações="" de="" h2o2="" acima="" de="" 40="" ug="" dm-3.="" após="" o="" tratamento="" de="" 80="" ug="" dm-3="" h2o2,="" a="" quantidade="" de="" todos="" os="" três="" pegs="">(feniletanoideglicosídeos)aumentou significativamente (P < 0.01)="" sobre="" o="" controle.="" portanto,="" essa="" concentração="" foi="" usada="" em="" outros="">
Para gerar uma biblioteca enriquecida para genes responsivos precoces que são regulados positivamente por H2O2, usamos cDNA deCistanchesalsacélulas em suspensão tratadas com 80 ug dm-3 H2O2 por 2 h. O sequenciamento de passagem única de 129 clones recombinantes na biblioteca SSH rendeu 105 ESTs limpos após a exclusão da sequência vetorial. Esses ESTs claros foram usados para montagem por CAP3, e 18 contigs e 67 singletons foram gerados (Tabela 2). Assim, 85 genes foram isolados nesta biblioteca. O comprimento médio dos 105 ESTs limpos foi de 527 bp, o que é adequado para uma classificação funcional baseada em similaridade de sequência.
feniletanoideglicosídeosdentroCistanchesalsa
Todos os 85 genes obtidos na biblioteca foram recuperados pelo BLASTx contra o banco de dados de proteínas não redundantes GenBank para similaridade de sequência (valor E menor ou igual a 0.001). Vinte e um genes não mostraram acertos no banco de dados, eles podem ser específicos paraCistanchesalsa. Os resultados com BLASThits foram importados para o software Blast2GO para análises adicionais de enriquecimento da via GO e KEGG. Dos 64 genes com acertos BLAST, 50 foram anotados de acordo com a descrição de genes homólogos de outras espécies. Os genes anotados foram nomeados de acordo com a descrição dos acertos do BLAST. A análise GO (Fig. 3 Supl.) mostra que entre esses 50 genes, havia 14 genes envolvidos em respostas a estímulos e mais de 30 genes relacionados a processos metabólicos (Tabelas 1 e 2). Entre esses genes, dois homólogos do gene da via de biossíntese do PeG foram isolados como esperado: 4-coumarato coenzima A ligase (denominada Cs4CL1: Contig03) e cinamato 4-hidroxilase (denominada CsC4H1: Contig14). Além disso, RT-qPCR foi realizado para confirmar expressões induzidas de genes da biblioteca após o tratamento com H2O2.
Para confirmar que os genes essenciais identificados na biblioteca SSH foram responsivos ao tratamento com H2O2, as expressões de dois PeGs(feniletanoideglicosídeos)genes relacionados à via de biossíntese (Cs4CL1, CsC4H1), dois genes induzidos por ROS (CsSOD1: Contig 16, CsHSP1: CISTH099) e um gene semelhante ao fator de transcrição da família WRKY (CsWRKY1: Contig 07) foram medidos por RT-qPCR após o tratamento com H2O2 (Fig. 1). As expressões CsC4H1, Cs4CL1, CsSOD1 e CsWRKY1 foram reguladas mais de 15-fold, 3-fold, 45-fold e 4-fold, respectivamente 2 h após o H2O2 tratamento. A expressão de CsHSP1 foi alterada apenas 1,8 vezes após o tratamento com H2O2.
O curso de tempo das expressões de CsWRKY1, CsC4H1 e Cs4CL1 após o tratamento com H2O2 foi ainda analisado por RT-qPCR (Fig. 2). As expressões CsC4H1 e Cs4CL1 foram altamente aumentadas (mais de 80-vezes e 50-vezes, respectivamente) após o tratamento com 16-h e, em seguida, reguladas negativamente após 32 h. A expressão de CsWRKY1 foi regulada para cima mais de 20-vezes em 4 h e, em seguida, diminuiu de 8 h depois (Fig. 2).
Fig. 2. A expressão relativa de CsWRKY1 (A), CsC4H1 (B) e Cs4CL1 (C) em diferentes momentos após o tratamento com 80 ug dm-3 H2O2. As expressões foram normalizadas para um controle; (tratado com água). Médias mais - DP de três repetições biológicas; * - P < 0,05,="" **="" -="" p=""><>
Discussão
O peróxido de hidrogênio é um elicitor de plantas bem conhecido que mostra vários efeitos nas plantas. Como ROS, pode induzir o sistema de eliminação de ROS composto por superóxido dismutase, catalase, peroxidases, etc., e serve como sinal a jusante de sal, osmótico e desidratação
(Wi et al. 2006, Kar 2011, Furlan et al. 2013, Sathiyaraj et al. 2014). Foi sugerido que a geração de H2O2 em plantas é acompanhada pela biossíntese induzida de metabólitos secundários noCistanchesalsacultura de células. Como esperado, nossos resultados revelam que PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese noMolho de Cistanchea cultura celular foi induzida após o tratamento com H2O2 (Tabela 1). O conteúdo de três PeGs principais(feniletanoideglicosídeos)aumentou após o tratamento com H2O2, indicando seu papel fundamental na biossíntese de PeGs. Genes enriquecidos na biblioteca SSH sugeriram ainda seu efeito sobre PeGs(feniletanoideglicosídeos)indução da biossínteseMolho de Cistanche.
Muitos genes responsivos a H2O2-conhecidos, como ascorbato peroxidase (CISTH069, Karyotou e Donaldson 2005), h-quinona oxidorredutase (CISTH125, Bello, et al. 2001), CsSOD1, CsHSP1 (Baruah et al. 2014), e genes de resposta de resistência a doenças (Contig10, Nanda, et al. 2010), foram enriquecidos na biblioteca SSH (Tabela 3, Tabela 2 Supl.). Alguns desses genes responsivos a ROS típicos com uma expressão induzida após o tratamento com H2O2 foram ainda confirmados por RT-qPCR (Figs. 1 e 2), indicando que uma biblioteca SSH qualificada foi construída aqui. Dois genes da via de biossíntese de PeG, CsC4H1 e Cs4CL1, também foram encontrados nesta biblioteca e essas duas expressões gênicas foram induzidas pelo tratamento com H2O2 de maneira dependente do tempo (Fig. 2). Isso sugere que o tratamento com H2O2 induziu PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese no nível genético através da regulação dos genes da via PAL. No entanto, PAL e outros genes de biossíntese de PeGs a jusante (Wang et al. 2012) não foram identificados na biblioteca SSH; pode ser porque a biblioteca não foi sequenciada suficientemente. Uma relação entre as expressões induzidas por CsC4H1 e Cs4CL1 e uma biossíntese aumentada de PeGs após o tratamento com H2O2 deve ser esclarecida por análises adicionais.
Além dos genes da via PAL induzidos pelo tratamento com H2O2, dois fatores de transcrição da família WRKY (CsWRKY1, CsWRKY2) foram encontrados na biblioteca SSH (Tabela 3 e Tabela 2 Supl.), e uma expressão induzida por CsWRKY1 foi confirmada por RT-qPCR . Sua expressão foi responsiva ao tratamento com H2O2 antes da expressão de dois genes da via PAL, Cs4CL1 e CsC4H1 (Fig. 2). A partir de estudos anteriores, a co-expressão de alguns fatores de transcrição WRKY e genes da via PAL foi observada em arroz (Gupta et al. 2012). Além disso, a expressão do gene PAL é regulada positivamente em um mutante de superexpressão de OsWRKY03 (Liu et al. 2005). Os dois fatores de transcrição da família WRKY mencionados acima também podem estar envolvidos em PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese emCistanchesalsa. Curiosamente, ESTs relacionados à desidratação (CISTH067, CISTH064) foram encontrados na biblioteca SSH, o que pode sugerir que o tratamento com H2O2 estava relacionado à expressão de genes responsivos à desidratação emCistanchesalsacomo observado em outras plantas (Schmidt et al. 2013, Zhou et al. 2013). Um gene relacionado à sinalização de giberelina (GA), receptor de giberelina gid1b-like (CISTH092), foi identificado na biblioteca SSH implicando a conexão da sinalização de GA e tratamento com H2O2 emCistanchesalsa, que também foi relatado em cevada (Bahin et al. 2011). No entanto, mais estudos são necessários para confirmar se esses genes estão relacionados aos PeGs(feniletanoideglicosídeos)biossíntese. Além dos genes mencionados acima, a biblioteca SSH aqui construída também apresenta genes com ou sem BLAST hits. Melhora a nossa compreensão do efeito do H2O2 em C. salsa e, em primeiro lugar, fornece as informações de seus genes envolvidos na biossíntese de PeGs.
Em conclusão, avaliamos o efeito de H2O2 em PeGs(feniletanoideglicosídeos)indução noCistanchesalsacultura de células. A biblioteca SSH foi construída após o tratamento com H2O2 e a expressão dos genes selecionados foi confirmada por RT-qPCR. Dois genes relacionados à via de biossíntese de PeG e outros genes responsivos a H2O2-foram identificados. Essas descobertas ampliarão nossa compreensão dos PeGs induzidos por H2O2-(feniletanoideglicosídeos)biossíntese emCistanchesalsaao nível molecular, fornecendo as informações para a manipulação gênica deCistanchesalsaculturas de células para melhorar PeGs(feniletanoideglicosídeos)Produção.
De: ' Identificação de ESTs responsivos a peróxido de hidrogênio envolvidos na biossíntese de glicosídeo feniletanoide em cultura de células Cistanche salsa' porJ. CHEN et al.
--- BIOLOGIA PLANTARUM 59 (4): 695-700, 2015 J. CHEN et al. DOI: 10.1007/s10535-015-0541-y
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