Oligoglicosídeos feniletânicos acilados com atividade hepatoprotetora da planta do deserto Cistanche Tubulosa

para mais informações:Ali.ma@wecistanche.com

Toshio Morikawa e outros

Abstrato

O extrato metanólico de caules frescos deCistanche tubulosa(Orobanchaceae) mostrou efeitos hepatoprotetores contra lesão hepática induzida por D-galactosamina (D-GalN)/lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos. Do extrato, três novosfeniletanoideoligoglicosídeos, cancanosídeos H1 (1), H2 (2) e I (3), foram isolados juntamente com 16glicosídeos feniletanoides(4-19) e dois oligoaçúcares acilados (20,21). As estruturas de 1-3 foram determinadas com base em propriedades espectroscópicas, bem como em evidências químicas. Entre os isolados, echinacoside (4, IC50=10,2 lM), acteoside (5, 4,6 lM), isoacteoside (6,5,3 lM), 20-acetilacteoside (8, 4,8 lM) e tubuloside A (10, 8,6 lM) inibiu a morte de hepatócitos induzida por D-GalN. Esses cinco isolados, 4 (31,1 lM), 5 (17,8 lM), 6 (22,7 lM), 8 (25,7 lM) e 10 (23,2 lM), e o cistantubulosídeo B1 (11, 21,4 lM) também reduziram o TNF-a- citotoxicidade induzida em células L929. Além disso, os principais constituintes (4-6) exibiram efeitos hepatoprotetores in vivo em doses de 25-100 mg/kg, PO.

Clique para efeitos colaterais Cistanche e produtos Cistanche

1. Introdução

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) é uma planta parasita aperene que cresce nas raízes das espécies Salvadora ou Calotropis, e está distribuída no norte da África, Arábia e países asiáticos.Cistanche tubulosaassim como a salsa assistencial e o Cistanche deserticola têm sido tradicionalmente usados ​​para o tratamento da impotência, esterilidade, lombalgia e fraqueza corporal, bem como um agente promotor da circulação sanguínea.2,3 Anteriormente, váriosfeniletanoides, iridóides, monoterpenos e lignanas foram isolados da China e do PaquistãoCistanche tubulosa.2,4–9 No decorrer de nossos estudos de caracterização de constituintes bioativos neste medicamento natural, relatamos anteriormente que cinco iridóides, kankanosídeos A–D e kankanol, um monoterpeneglicosídeo, kankanosídeo E, doisfeniletanoideoligoglicosídeos,cancanosídeos F e G (23), e um oligoaçúcar acilado, kancanose(21), foram isolados do extrato metanólico de caules secos deCistanche tubulosa.10,11 Além disso, o extrato metanólico e vários isolados como echinacoside (4), acteside (5), cistanoside F (20), 21 e kankanoside F mostraram efeitos vasorrelaxantes, ou seja, efeitos inibitórios contra as contrações induzidas pela noradrenalina em aorta torácica isolada de rato.11 Em nossos estudos contínuos sobre os constituintes da planta, um extrato metanólico de caules frescos deOs túbulos de Cistanche forammostrou um efeito protetor na lesão hepática induzida por D-galactosamina (D-GalN)/lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos. Do extrato metanólico, isolamos três novosfeniletanoideoligoglicosídeos denominados cancanosídeos H1 (1), H2 (2) e I (3) juntamente com 16 glicosídeos feniletanoides (4-19) e dois oligoaçúcares acilados (20, 21). Este artigo trata do isolamento e elucidação estrutural dessas novasfeniletanoideoligoglicosídeos (1-3). Os requisitos estruturais dos glicosídeos feniletanoides para a atividade hepatoprotetora também são discutidos (Fig. 1)

2. Resultados e discussão

2.1. Efeito protetor do extrato metanólico de caules deCistanche tubulosasobre lesão hepática induzida por D-GalN/LPS em camundongos

Hastes frescas deCistanche tubulosa(cultivadas em Urumqi, província de Xinjiang, China) foram extraídas com metanol sob refluxo para produzir um extrato metanólico (8,36% das hastes frescas). Conforme mostrado na Tabela 1, nas doses de 250-500 mg/kg, PO, o extrato metanólico mostrou um efeito inibitório sobre o aumento da aspartato aminotransaminase (sAST) e alanina aminotransaminase (sALT), marcadores de lesão hepática, induzida por D- GalN/LPS em camundongos.

2.2. Constituintes químicos de caules deCistanche tubulosa

Um extrato metanólico dos caules frescos deCistanche tubulosafoi submetido a cromatografia em coluna Diaion HP-20 (H2O?MeOH) para dar frações eluídas com H2O e MeOH (5,63 por cento e 2,73 por cento, respectivamente). A fração eluída com MeOH foi submetida a cromatografias de SiO2 e ODScolumn e finalmente HPLC para fornecer três novosfeniletanoideoligoglicosídeos, cancanosídeos H1 (1, 0.0008 por cento), H2(2, 0,0001 por cento) e I (3, 0,0007 por cento) juntamente com 16glicosídeos feniletanoides, echinacoside2,11 (4, 0,45 por cento ), acteoside2,11 (5, 0,28 por cento ), isoacteoside2,11 (6, 0.0 41 por cento ), cis-acteoside12,13 (7, 0.0007 por cento ), 20-acetilacteoside2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 por cento ), decafeoilactosídeo14 (9, 0.0002 por cento ), lado do túbulo A2,11 (10, 0,013 por cento), cistantubulosídeos B19 (11, 0,0020 por cento), B29 (12,0,0003 por cento), arenarioside15 (13, 0,0006 por cento), wiedemanninosídeo C16 (14,0,0008 por cento ), cistantubulosídeo A9 (15, 0,0009 por cento ), siringalida A 30-OaL ramnopiranosídeo4 (16, 0,0017 por cento ), campneosídeos I17,18 (17,0,015 por cento ) e II17,18 (18 , 0,0005 por cento ), e salidroside11 (19, 0,0027 por cento ), e dois oligoaçúcares acilados, cistanoside F11 (20, 0,0004 por cento ) e kankanose11 (21, 0,0004 por cento ).

2.3. Estruturas de cancanosídeos H1 (1), H2 (2) e I (3)

Kankanosídeo H1 (1) foi obtido como um pó branco com rotação óptica negativa (½a-24D-45.3 em MeOH). Seu espectro de IR mostrou bandas de absorção em 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{107}}70 e 1040 cm 1 atribuíveis a hidroxilas, carbonilas de éster, funções de éter, e anéis aromáticos. Os espectros FABMS de íons positivos e negativos de 1 mostraram picos de íons quasimoleculares em m/z 835(M plus Na) plus e m/z 811 (MH), respectivamente, e a fórmula molecular foi determinada como C37H48O20 por alta resolução positiva- medição de íons FABMS. Os espectros de RMN de 1H e 13C de 1 (CD3OD, Tabelas 2 e 3), que foram atribuídos por vários experimentos de RMN,19 mostraram sinais atribuíveis a dois metilenos [d 2,70(2H, m, H2-7), 3,66 , 4,07 (1H cada, ambos m, H2-8)], prótons aromáticos do tipo ABC orto e meta-acoplados [d 6,52 (1H, dd, J=1,8,7,8 Hz, H{ {50}}), 6,65 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2), 6,67 (1H, d, J=7,8 Hz,H{{62) }})], duas porções de bD-glucopiranosil [d 4,29 (1H, d, J=7,8 Hz, terminal-Glc-H-1), 4,54 (1H, d, J {{76) }},2 Hz, Glc-H interno-1)], e fração aa-L-ramnopiranosil [d 1,06 (3H, d, J=6,0 Hz, Rha-H{{89) }}),4,80 (1H, br s, Rha-H-1)] juntamente com um grupo acetil [d 1,98(3H, s)] e um grupo trans-p-cumaroil {uma trans-olefina [d 6,34,7,67 (1H cada, ambos d, J=16,0 Hz, H-8 e 7)] e prótons aromáticos do tipo A2B{112}}orto-acoplados [d 6,80, 7,46 (2H cada , ambos d,J=8.7 Hz, H-3,5 e 2,6)]}. As conectividades entre as porções de oligoglicosídeo e acil em 1 foram caracterizadas por um experimento HMBC, que mostrou correlações de longo alcance entre os seguintes pares de prótons e carbonos: inner-Glc-H-1 e C-8 (dC71.9 ); interno-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, dd-like)] e o acetilcarbonilcarbono (dC 171,4); interno-Glc-H-4 [d 5,08 (1H, dd, J=9,6, 9,6 Hz)] e o carbono p-cumaroil carbonil (dC 168,2); Rha-H-1 e interno-Glc-C-3 (dC 80,5); e terminal-Glc-H-1 e interno-Glc-C-6 (dC69.3) (Fig. 2). Finalmente, a hidrólise alcalina de 1 com 5 por cento de hidróxido de potássio (KOH) liberou ácido trans-p-cumárico, que foi identificado por análise de HPLC, juntamente com um produto desacilado. O produto desacilado foi sucessivamente tratado com ácido clorídrico (HCl) 1,0 M para liberar L-ramnose e D-glicose, que foram identificados por análise de HPLC usando um detector de rotação óptica. }}(3,4-diidroxifenil)etil OaL-ramnopiranosil-(1- 3)-[bD-glucopiranosil-(1-6)]-2-O-acetil{{196 }}O-trans-p-cumaroil-bD-glucopiranosídeo (1).

Kankanosídeo H2 (2) foi isolado como um pó branco com rotação óptica negativa (½a 25 D 52,4 em MeOH). Sua fórmula molecular C37H48O20 foi encontrada para ser a mesma que a de 1 por medição FABMS de íons positivos de alta resolução. As propriedades espectroscópicas de 2 foram muito semelhantes às de 1, exceto para sinais devido ao grupo cis-p-cumaroil [d 5,79, 6,95 (1H cada, ambos d, J=12,8 Hz, H{{ 22}} e 7), 6,76, 7,73 (2H cada, ambos d, J=8,7 Hz, H-3,5 e 2,6)]. Além disso, o experimento HMBC em 2 também revelou modos semelhantes de correlações de longo alcance como aqueles detectados para 1 entre os seguintes pares de prótons e carbonos: inner-Glc-H-1 [d 4,51 (1H, d, J {{44 }},8 Hz)] e C-8 (dC 72,0); interno-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, m)] e o carbono acetil carbonil (dC 171,4); interno-Glc-H-4 [d 4,98 (1H, dd, J=9,6, 9,7 Hz)] e o carbono p-cumaroil carbonil (dC 166,7); Rha-H-1 [d 4,77 (1H, d, J=1,4 Hz, Rha-H-1)] e interno-Glc-C-3 (dC 80,7 ); e terminal-Glc-H-1 [d 4,28 (1H, d, J=7,8 Hz)] e interno-Glc-C-6 (dC 69,4) (Fig. 2) . Pelo estudo de degradação, 2 deu ácido cis-p-cumárico e dois açúcares iguais aos obtidos no caso de 1. Consequentemente, a estrutura do cancanosídeo H2 foi elucidada como 2-(3,{105}} dihidroxi fenil)etil OaL-ramnopiranosil-(1-3)- [bD-glucopiranosil-(1-6)]-2-O-acetil-4-O-cis-p-cumaroil- bD-glucopiranosídeo (2).

Kankanosídeo I (3) também foi isolado como um pó branco com rotação óptica negativa (½a- 25D-62.2 em MeOH). Sua fórmula molecular, C35H46O18, foi determinada por medidas positivas e negativas de FABMS e HRFABMS. As propriedades espectroscópicas de 3(CD3OD, Tabelas 2 e 3) foram sobreponíveis às de echinacoside (4), exceto para sinais devidos à parte aglicona {{dois metilenos {d 2,95 (2H, dd, J=7). 3, 7,8 Hz, H2-7), [3,79 (1H, m), 4,10 (1H,dt, J=16,9, 7,3 Hz), H{{32} }]}, prótons aromáticos monossubstituídos [d7,18 (1H, m, H-4), 7,26-7,28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. A hidrólise alcalina de 3 com 5 por cento de KOH liberou ácido trans-cafeico, e o produto desacilado foi sucessivamente tratado com HCl 1,0 M para liberar L-ramnose e D-glicose. Finalmente, as conectividades do grupo acil e as porções de açúcar em 3 foram esclarecidas pelo experimento HMBC, como mostrado na Figura 2. Com base nas evidências acima mencionadas, a estrutura do cancanosídeo I foi elucidada como sendo 2-feniletil OaL- ramnopiranosil-(1-3)-[bD-glucopirano-sil-(1-6)]-4-O-trans-cafeoil-bD-glucopiranosídeo (3)

2.4. Efeitos de constituintes químicos dos caules de Cistanche tubulosa na citotoxicidade induzida por D-GalN em hepatócitos de camundongos de cultura primária

A lesão hepática induzida por D-GalN/LPS é reconhecida por se desenvolver por meio de respostas imunológicas.19 Esse tipo de lesão hepática ocorre em duas formas. Primeiro, a sensibilidade ao TNF-a por depleção de trifosfato de uridina nos hepatócitos é aumentada por D-GalN. Segundo, mediadores pró-inflamatórios, como NO e TNF-a, são liberados de macrófagos ativados por LPS (células de Kupffer). A apoptose de hepatócitos por TNF-a é relatada como tendo um papel importante na lesão hepática induzida por D-GalN/LPS.20

Em nossos estudos anteriores sobre compostos hepatoprotetores de medicamentos naturais, relatamos que vários constituintes de Hovenia Dulcis,21 Bupleurum scorzonerifolium,22,23 Curcuma zedoaria,24–26Angelica furcijuga,27,28 Betula sativum,30 Salacia reticulata,31 Tilia argentea,32 Anastatica hierochuntica,33 Panax notoginseng,34 Cyperus longus,35 Erycibe expansa,36Camellia sinensis,37 Sedum sarmentosum,38,39 Sinocrassula indica,40Hedychium coronarium41 e Piper chaba42,43 mostraram efeitos hepatoprotetores sobre a lesão hepática induzida por D-GalN/LPS em camundongos e/ou platyphylla var. japonica,29 Efeito inibitório de Pisum na citotoxicidade induzida por D-GalN em hepatócitos de cultura primária. Uma vez que o extrato metanólico dos caules daCistanche tubulosamostraram efeitos hepatoprotetores na lesão hepática induzida por D-GalN/LPS em camundongos (vide ante), o efeito inibitório dos constituintes na citotoxicidade induzida por D-GalN em hepatócitos de camundongos cultivados primários foi examinado usando o 3-(4,{ {6}}dimetiltiazol-2-il)-2,5-ensaio de brometo de difeniltetrazólio (MTT). Conforme mostrado na Tabela 4, echinacoside (4, IC50=10.2 lM), acteosídeo (5, 4,6 lM), isoaceteoside(6, 5,3 lM), 20-acetilacteoside (8, 4,8 lM), os tubulósidos A (10,8,6 lM) e B11 (22, 14,6 lM) e o cancanosídeo G11 (23, 14,8 lM) apresentaram forte atividade. Suas atividades foram maiores que a da silibina comercial (38,8 lM),33-43 como controle positivo.44,45 Os requisitos estruturais doglicosídeos feniletanoides for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM)]; (2) a aglicona possuindo o grupo 3,4-di-hidroxila apresentou atividade mais forte do que aquela possuindo o grupo hidroxila 4-(6 > 23); (3) a fração 60-ObD-glucopiranosil reduziu a atividade (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" a="" parte="" 8-obd-glucopiranosil="" com="" o="" grupo="" 40-o-cafeoil="" mostrou="" atividade="" mais="" forte="" do="" que="" aquela="" com="" o="" grupo="" 60-o-cafeoil="" (5="6," 8=""> 22 ); e (5) a introdução do 20-O-acetilmoiety reduziu a atividade (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, dados não mostrados). Assim, verificou-se que estes compostos não afetam as superproduções de NO e TNF-a de macrófagos ativados por LPS.

2.5. Efeitos dos constituintes químicos na citotoxicidade induzida por TNF-a em células L929

A fim de esclarecer os efeitos dos constituintes sobre a sensibilidade dos hepatócitos ao TNF-a, a diminuição da viabilidade das células L929 induzida pelo TNF-a, uma linhagem celular sensível ao TNF-a,48 foi examinada usando o ensaio MTT. Sem amostras de teste, a viabilidade celular foi reduzida para ca. 60 por cento após a incubação das células com 20 ng/mL de TNF-a por 44 h em comparação com o caso sem TNF-a. Conforme mostrado na Tabela 5, echinacoside (4, IC50=31,1 lM), acteosídeo (5, 17,8 lM), isoaceteoside (6, 22,7 lM), 20-acetilacteoside (8, 25,7 lM), tubulósido A (10,23,2 lM) e cistantubulosídeo B1 (11, 21,4 lM) inibiram a diminuição da viabilidade celular, e suas atividades foram maiores que as da piperina42,43 e da silibina. Os requisitos estruturais doglicosídeos feniletanoides for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)]; e (5) a introdução da fração 20-O-acetil reduziu a atividade (8 < 5,="" 22="">< 6).="" esses="" requisitos="" foram="" encontrados="" semelhantes="" aos="" observados="" no="" capítulo="" anterior="" sobre="" os="" efeitos="" inibitórios="" sobre="" a="" citotoxicidade="" induzida="" por="" d-galn="" em="" hepatócitos="" de="" camundongos="" de="" cultura="">

Esses achados in vitro sugerem os seguintes possíveis mecanismos de ação para o efeito hepatoprotetor dos constituintes dos caules deCistanche tubulosa: (i) diminuição da citotoxicidade induzida por D-GalN (4-6, 8, 10, 22 e 23) e (ii) diminuição da citotoxicidade induzida por TNF-a (4-6, 8, 10 e 11) .

2.6. Efeitos protetores de echinacoside (4), acteoside (5), andisoacteoside (6) contra lesão hepática induzida por D-GalN/LPS em camundongos e seu modo de ação

Por fim, examinamos o efeito do principalglicosídeos feniletanoides, echinacoside (4), acteoside (5) e isoacteoside (6) na lesão hepática induzida por D-GalN/LPS em camundongos. Conforme mostrado nas Tabelas 6 e 4-6, inibiu significativamente o aumento de sAST e sALT induzido por D-GalN/LPS em camundongos em doses de 25-100 mg/kg, PO. Por outro lado, 4-6 não afetou a superprodução de TNF-a de macrófagos ativados por LPS. Além disso, 4-6 inibiram significativamente a morte das células L929 causada pelo TNF-a, indicando uma diminuição da sensibilidade das células L929 ao TNF-a (vide ante). Esses achados sugerem que 4-6 reduzem a sensibilidade dessas células à citotoxicidade induzida pelo TNF-a. Muitos compostos que inibem a morte celular induzida por D-GalN e a produção de TNF-a foram relatados,24,26,32 mas há poucos compostos que reduzem seletivamente a sensibilidade dos hepatócitos ao TNF-a.42,43,49,50

Em conclusão, a partir de caules frescos deCistanche tubulosa, três novosglicosídeos feniletanoides, cancanosídeos H1 (1), H2 (2) e I (3) juntamente com 16glicosídeos feniletanoides(4-19) e oligoaçúcares doisacilados (20, 21) foram isolados. Os requisitos estruturais para seus efeitos protetores na lesão de hepatócitos induzida por D-GalN e efeitos citoprotetores em células L929 causados ​​por TNF-a foram os seguintes; (1) a parte aglicona foi essencial para a atividade; (2) a aglicona com o grupo 3,4-diidróxi mostrou atividade mais forte do que aquela com o grupo 4-hidróxi; (3) a fração 60-ObD-glucopiranosil reduziu a atividade; (4)a parte 8-ObD-glucopiranosil com o grupo 40-O-cafeoil mostrou atividade mais forte do que aquela com o grupo 60-O-cafeoil; e (5) introdução do {{27 }} A fração O-acetil reduziu a atividade.glicosídeos feniletanoides, echinacoside(4), acteoside (5) e isoacteoside (6), inibiram o aumento de AST e sALT em doses de 25-100 mg/kg PO em camundongos tratados com D-GalN/LPS, e esses efeitos inibitórios foram sugeridos como sendo dependente da sensibilidade reduzida dos hepatócitos ao TNF-a. Os detalhados mecanismos de ação doglicosídeos feniletanoidesdeveria ser mais estudado.

3. Experimental

3.1. Em geral

Os seguintes instrumentos foram usados ​​para obter dados espectrais e físicos: rotações específicas, Horiba SEPA-300 polarímetro digital (l=5 cm); espectro UV, espectrômetro Shimadzu UV-1600; espectro IR, espectrômetro Shimadzu FTIR-8100; espectros de RMN de 1H e 13C, espectrômetros JEOLJNM-ECA600 (600 e 150 MHz) e JEOL JNM-ECS400 (400 e 100 HMz) com tetrametilsilano como padrão interno; FABMS e FABMS de alta resolução, espectrômetro de massa JEOL JMS-SX 102A; Detector de HPLC, Shimadzu RID-10A índice de refração, Shimadzu SPD-10A UV-vis e detectores de rotação óptica Shodex OR-2. Coluna de HPLC, Cosmosil 5C18-MS-II, e colunas pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4,6 mm id) e (250 - 20 mm id) foram usadas para fins analíticos e preparativos, respectivamente.

As seguintes condições experimentais foram usadas para cromatografia: cromatografia em coluna de sílica gel de fase normal (CC), sílica gel 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, malha 63-210, esférica, neutra ); sílica gel de fase reversa CC, Diaion HP-20 (NipponRensui) e Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); TLC de fase normal, placas de TLC pré-revestidas com gel de sílica 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC de fase reversa, placas de TLC pré-revestidas com gel de sílica RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC de fase reversa, placas de TLC pré-revestidas com sílica gel RP-18 WF254S(Merck, 0,25 mm), a detecção foi alcançada por pulverização com 1% de Ce(SO4)2-10% de H2SO4 aquoso, seguido de aquecimento .

3.2. Material vegetal

Hastes frescas deCistanche tubulosacultivadas em Urumqi, província de Xinjiang, China foram coletadas em setembro de 2007. O material vegetal foi identificado por um dos autores (MY). Um voucher para o material vegetal está arquivado em nosso laboratório.

3.3. Extração e isolamento

As hastes frescas deCistanche tubulosa(2,98 kg) foram finamente cortados e extraídos três vezes com metanol sob refluxo por 3 h. A evaporação do solvente sob pressão reduzida forneceu um extrato metanólico (249,1 g, 8,36 por cento). O extrato metanólico foi submetido a Diaion HP 20 CC (5.0 kg, H2O?MeOH) para dar frações eluídas com H2O e MeOH (167,84 g, 5,63 por cento e 81,21 g, 2,73 por cento , respectivamente). A fração eluída com MeOH (61.00 g) foi submetida a sílica gel de fase normal CC[1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0,4?1{{48} }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH] para dar sete frações [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4(10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) e 7 (4,60 g)]. A fração 2 (9,56 g) foi separada por sílica gel de fase reversa CC [400 g,MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?acetona] para dar cinco frações [Fr. 2–1 (55,9 mg), 2–2 (4,48 g), 2–3 (3,42 g), 2–4 (1,16 g) e 2–5 (31,9 mg)]. A fração 2–3 (1.00 g) foi submetida a HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN–1 por cento de AcOH aquoso (7:93, v/ v)] para dar sete frações [Fr. 2–3–1 (66,5 mg), 2–3–2 (20,4 mg), 2–3–3 (26,0 mg), 2–3–4 (136,6 mg), 2–3–5 (38{{300}},6 mg), 2–3–7 (84,9 mg)]. A fração 2–3–4 (106,6 mg) foi ainda purificada por HPLC [Cosmosil pNAP,CH3CN–1 por cento de AcOH aquoso (5:95, v/v)] para dar salidroside (19,13,7 mg, {{340}}.0{{409}}27 por cento). A fração 4 (10,69 g) foi separada por sílica gel de fase reversa CC [500 g, MeOH–H2O (30:7 0,v/v)?MeOH?acetona] para dar quatro frações [Fr. 4–1 (878,2 mg), 4–2 (7.06 g), 4–3 (1,57 g) e 4–4 (792,8 mg)]. A fração 4–2(1,5{{560}} g) foi submetida a HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 por cento de AcOH aquoso (2{{57{{586}) }}}:80, v/v)] para dar cinco frações {Fr. 4–2–1(42,9 mg), 4–2–2 [= campneoside I (17, 67.0 mg, 0,014 por cento)], 4–2– 3 [= acteosídeo (5, 1,21 g, 0,26 por cento)], 4–2–4 (41,6 mg) e 4–2–5 (181,3 mg)}. A fração 4-2-4 (41,6 mg) foi ainda purificada por HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 por cento de AcOH aquoso (18:82, v/v)] para dar isoacteoside (6, 19,1 mg, 0,0040 por cento) e cis-acteoside (7,3,4 mg, 0,0007 por cento). A fração 4-3 (1,57 g) foi purificada por HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 por cento de AcOH aquoso (20:80, v/v)] para dar 11 frações [Fr. 4–3–1 (30,4 mg), 4–3–2 (55,2 mg), 4–3–3 (= 17,22,1 mg, 0,0010 por cento), 4–3–4 (= 5 , 224,6 mg, 0,010 por cento ), 4–3–5 (27,4 mg), 4–3–6 (43,6 mg), 4–3–7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 por cento), 4–3 –8 [= siringa lide A 30-OaL-ramnopiranosídeo (16, 37,6 mg, 0,0017 por cento)], 4–3–9(39,8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetilacteoside (8, 85,4 mg, 0,0038 por cento)] e 4-3-11 (64,6 mg)]. A fração 4-3-6 (43,6 mg) foi ainda purificada por HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 por cento de AcOH aquoso (18:82, v/v)] para dar cancanosídeos H1 (1, 17,0 mg, 0,0008 por cento) e H2 (2,3,3 mg, 0,0001 por cento). A fração 4-3-9 (39,8 mg) foi ainda purificada por HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 por cento de AcOH aquoso (18:82, v/v)] para dar kankanosídeo I (3, 15,4 mg, 0,0007 por cento) e 6 ( 3,1 mg, 0,0001 por cento). A fração 5 (8,84 g) foi separada por gel de sílica de fase reversaCC [400 g, MeOH–H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH?acetona] para dar sete frações [Fr. 5–1 (870,2 mg), 5–2 (478,9 mg), 5–3 (3,72 g), 5–4 (979,9 mg), 5–5 (1,19 g), 5–6 (1,27 g) e 5 -7(130,1 mg)]. A fração 5-1 (870,2 mg) foi purificada por HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN-1 por cento AcOH aquoso (5:95, v/v)] para dar decafeoy lacteoside (9, 5,1 mg, 0,0002 por cento) e cistanoside F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 por cento). A fração 5–3 (3,72 g) foi purificada por HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN–1 por cento de AcOH aquoso (15:85, v/v)] para dar seis frações [Fr. 5–3–1 (128,6 mg), 5–3–2 [= kankanose (21, 9,4 mg, 0,0004 por cento)], 5–3–3 (64,6 mg), 5–3–4 (72,3 mg), 5–3–5 [= lado echinaco (4, 2,54 g, 0,11 por cento) e 5–3–6 (318,5 mg)]. A fração 5-3-4 (72,3 mg) foi ainda purificada por HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 por cento AcOH aquoso (10:90, v/v)] para dar campneoside II (18,10,6 mg, 0,0005 por cento). A fração 5–4 (979,9 mg) foi purificada por HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 por cento de AcOH aquoso (15:85, v/v)] para frações de dadaina [Fr. 5–4–1 (28,6 mg), 5–4–2 (90,5 mg), 5–4–3 (99,7 mg), 5–4–4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 por cento), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 por cento) e5– 4-9 (134,7 mg)]. A fração 5-4-6 (318,5 mg) foi purificada por HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 por cento AcOH aquoso (15:85, v/v)] para dar cistantubulosídeos B1 (11, 44,9 mg, 0,0020 por cento), B2 (12 , 7,6 mg, 0,0003 por cento), e A (15, 21,1 mg, 0,0009 por cento) e wiedemanninosídeo C (14, 17,2 mg, 0,0008 por cento). A fração 5-5 (1,19 g) foi purificada por HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 por cento de AcOH aquoso (18:82, v/v)] para dar tubulósido A (10, 300,3 mg, 0,013 por cento) e arenarioside (13,5,8 mg, 0,0006 por cento). A fração 6 (12,52 g) foi separada por sílica gel CC de fase reversa [600 g, MeOH–H2O (20:80–30:70,v/v)?MeOH?acetona] para dar quatro frações [Fr. 6–1 (553,8 mg), 6–2 (10,69 g), 6–3 (1,40 g) e 6–4 (17,8 mg)]. A fração 6–2 (500,0 mg) foi purificada por HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 por cento de AcOH aquoso (25:75, v/v)] para dar 4 (353,1 mg, 0,34 por cento ).

3.3.1. Kankanosídeo H1 (1)

Um pó branco, ½a- 24D -45.3 (c 1,06, MeOH). FABMS de íons positivos de alta resolução: Calculado para C37H48O20Na (M mais Na) mais: 835,2637. Encontrado: 835,2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4,33), 293 (sh,4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 3. FABMS de iões positivos: m/z 835 (M mais Na) mais . FABMS de iões negativos: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Kankanosídeo

H2 (2) Um pó branco, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). FABMS de íons positivos de alta resolução: Calculado para C37H48O20Na (M mais Na) mais: 835,2637. Encontrado: 835.2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 2. 13C NMR (150 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 3. FABMS de íons positivos: m/z 835 (M mais Na) mais .FABMS de íons negativos : m/z 811 (MH)-.

3.3.3. Kankalado I (3)

Um pó branco, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). FABMS de íons positivos de alta resolução: Calculado para C35H46O18Na (M mais Na) mais: 777,2581. Encontrado: 777,2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3,97), 295 (sh, 4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070,1046 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: dado na Tabela 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: dado na Tabela 3. FABMS de iões positivos: m/z 777 (M mais Na) mais . FABMS de iões negativos: m/z 753 (MH)-.

3.4. Hidrólise alcalina e ácida de 1-3

Soluções de 1, 2 e 3 (cada 1,5 mg) em 5 por cento de hidróxido de potássio aquoso (KOH, 0,5 mL) foram agitadas a 40 graus por 1 h. Cada solução foi neutralizada com Dowex HCR W2 (forma H plus), e as resinas foram removidas por filtração. A evaporação do solvente sob pressão reduzida rendeu os produtos desacilados correspondentes, que foram submetidos a análise de HPLC [coluna: Cosmosil pNAP,250 - 4,6 mm id; fase móvel: CH3CN–1 por cento de AcOH aquoso (15:85, v/v); detecção: UV (254 nm); taxa de fluxo: 1.0 mL/min] a ser identificado como ácido trans-cafeico (tR 9,9 min de 3), ácido trans-p-cumárico (tR 17,1 min de 1) e ácido cis-p-cumárico (tR17,8 min de 2), respectivamente. Em seguida, cada um foi dissolvido em 1.0 MHCl (1.0 mL) e aquecido a 80 C por 3 h. Depois de resfriada, a mistura reacional foi neutralizada com Amberlite IRA-400 (forma OH), e as resinas foram removidas por filtração. Após remoção do solvente sob pressão reduzida, o resíduo foi separado pela coluna de cartucho Sep-Pak C18 (H2O?MeOH). A fração eluída com H2O foi submetida a análise de HPLC sob as seguintes condições: coluna de HPLC, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id - 250 mm(Tokyo Kasei Co., Ltd, Tóquio, Japão); detecção, rotação óptica[Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tóquio, Japão); fase móvel,CH3CN–H2O (85:15, v/v); taxa de fluxo 0,8 mL/min]. A identificação de L-ramnose (i) e D-glicose (ii) liberada de 1, 2 ou 3 na fração eluída com H2O foi realizada por comparação de seus tempos de retenção e rotação óptica com os de amostras autênticas [i,tR 9,9 min (negativo)] e [ii, tR 17,9 min (positivo)].

3.5. Bioensaio

3.5.1. Reagentes

LPS (da Salmonella enteritidis), meio essencial mínimo (MEM) e meio E de William foram adquiridos da Sigma–Aldrich Chemical (St. Louis, MO, EUA); o soro fetal bovino (FBS) era da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA); e outros produtos químicos eram da Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Japão). 96-As microplacas de poços foram adquiridas da Sumitomo Bakelite Co.,Ltd (Tóquio, Japão).

3.5.2. Animais

Os camundongos ddY machos foram adquiridos do Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Japão). Os animais foram alojados a uma temperatura constante de 23 ± 2 C e foram alimentados com uma ração de laboratório padrão (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tóquio, Japão). Todos os experimentos foram realizados com camundongos conscientes, salvo indicação em contrário. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa em Animais Experimentais da Universidade Kinki.

3.5.3. Efeitos protetores na lesão hepática induzida por D-GalN/LPS em camundongos

O método descrito por Tiegs et al.51 foi modificado e utilizado para este experimento. Resumidamente, camundongos ddY machos pesando cerca de 25-30 g em jejum por 20 h antes do experimento. D-GalN (350 mg/kg) e LPS (10 lg/kg) dissolvidos em solução salina foram injetados intraperitonealmente para produzir lesão hepática. Cada amostra de teste foi administrada oralmente 1 h antes da injeção de D-GalN/LPS. Amostras de sangue foram coletadas do plexo venoso infraorbitário 10 h após a injeção de D-GalN/LPS. Os níveis de sAST e sALT foram determinados usando o método Reitman-Frankel (kit comercial, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). A hidrocortisona foi usada como composto de referência. As amostras de teste foram suspensas com solução de goma arábica a 5 por cento, e a solução foi administrada oralmente a 10 mL/kg em cada experimento, enquanto o veículo foi administrado por via oral a 10 mL/kg no grupo controle correspondente.

3.5.4. Efeitos protetores na citotoxicidade induzida por D-GalN em hepatócitos de camundongo cultivados primários

O efeito hepatoprotetor dos constituintes foi determinado pelo brometo de {{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazólio (MTT ) ensaio colorimétrico usando hepatócitos de camundongos de cultura primária.33–43 Hepatócitos foram isolados de camundongos maleddY (30–35 g) pelo método de perfusão com colagenase. Uma suspensão de células em 4 - 104 células em 100 lL de meio William's E contendo FBS (10 por cento), penicilina G (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 lg/mL) foi inoculada em uma 96-microplaca de poço e pré-cultivado por 4 h a 37 graus sob uma atmosfera de 5 por cento de CO2. O meio foi adicionado com 100 lL do meio fresco contendo D-GalN(2 mM) com ou sem a amostra teste e os hepatócitos foram cultivados por 44 h. O meio foi trocado por 100 lL de meio fresco e 10 lL de solução de MTT [5 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS)] foi adicionado ao meio. Após 4 h de incubação, o meio foi removido e 100 lL de isopropanol contendo HCl 0,04 M foram então adicionados para dissolver o formazan produzido nas células. A densidade óptica (DO) da solução de formazan foi medida por um leitor de microplacas a 570 nm (referência: 655 nm). A inibição (porcentagem) foi obtida pela seguinte fórmula.

Inibição ( por cento )= [(OD(amostra) - OD(controle))/(OD(normal)-OD(controle))] x 100

3.5.5. Efeitos sobre a produção de NO em macrófagos peritoneais de camundongos estimulados por LPS

Um teste de triagem para a produção de NO usando macrófagos peritoneais de camundongo induzidos por TGC foi realizado conforme descrito anteriormente.43,46,

3.5.6. Efeitos sobre a produção de TNF-a em macrófagos peritoneais de camundongos estimulados por LPS

O TNF-a liberado no meio foi determinado conforme descrito anteriormente28 com uma leve modificação. Resumidamente, macrófagos peritoneais de camundongos induzidos por TGC (5 - 105 células/poço) foram coletados das cavidades peritoneais de camundongos ddY machos, suspensos em 100 l de RPMI 1640 suplementado com 5 por cento de FBS, penicilina (100 unidades/ mL) e estreptomicina (100 lg/mL) e pré-cultivadas em 96-microplacas de poços a 37 graus em 5 por cento de CO2 no ar por 1 h. As células não aderentes foram removidas por lavagem com PBS e foram adicionados 100 l de meio fresco contendo várias concentrações do composto de teste. Após 10 min, 100 l do meio contendo 10 lg/mL de LPS foram adicionados e incubados por 4 h. A produção de TNF-a em cada poço foi determinada usando um kit ELISA (kit Rato TNF-a ELISA, Invitrogen). Cada composto de teste foi dissolvido em DMSO e a solução foi adicionada ao meio (concentração final de DMSO 0,5 por cento)

3.5.7. Efeitos inibitórios na morte celular induzida por TNF-a em células L929

As células L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japão) foram mantidas em meio mínimo essencial Eagle (MEM, Sigma–Aldrich) contendo 10 por cento de FBS, 1 por cento de aminoácidos não essenciais MEM (Invitrogen), penicilina G (100 unidades /mL) e estreptomicina (100 lg/mL) a 37°C sob uma atmosfera de 5% de CO2. As células foram inoculadas em uma 96-placa de cultura de tecidos de poço [3 -104 células/poço em 100 l/poço em MEM]. Após 44 h de incubação no meio TNF-a (20 ng/mL) com ou sem a amostra teste, a viabilidade das células foi avaliada pelo ensaio colorimétrico MTT (videante).49,50 Cada composto teste foi dissolvido em DMSO, e a solução foi adicionada ao meio (concentração final em DMSO0,5 por cento).

3.6. Estatisticas

Os valores são expressos como médias ± SEM A análise de variância de um fator (ANOVA) seguida pelo teste de Dunnett foi usada para análise estatística. Valores de probabilidade (p) inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Agradecimentos

TM, KN e OM foram apoiados por uma Bolsa de Ajuda para Pesquisa Científica do Projeto 'Centro de Pesquisa de Alta Tecnologia' para Universidades Privadas: subsídio de fundo de contrapartida de uma Bolsa de Ajuda para Pesquisa Científica do Ministério da Educação, Cultura , Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT) do Japão, 2007–2011 e também apoiado por uma Subvenção para Pesquisa Científica do MEXT. MY e HM foram apoiados pelo 21st COE Program, Academic Frontier Project e um Grant-in-Aid for Scientific Research do MEX

De: ' Aciladofeniletanoideoligoglicosídeos com atividade hepatoprotetora da planta do desertoCistanche tubulosa' porToshio Morikawa e outros

---Química Bioorgânica e Medicinal 18 (2010) 1882–1890.