Hipotermia induzida por oxcarbazepina após isquemia transitória do prosencéfalo exerce neuroproteção terapêutica por meio de potencial receptor transitório vanilóide tipo 1 e 4 em gerbilos, parte 2
Jul 26, 2024
2.5. Imunoreatividade TRPV1 e TRPV4
Alterações na imunorreatividade do TRPV1 e TRPV4 nas regiões CA1 de todos os grupos foram investigadas por imunohistoquímica (Figuras 5 e 6).
Os tecidos imunológicos são a principal defesa do corpo contra patógenos estranhos e também desempenham um papel importante - melhorar a nossa memória.
Estudos demonstraram que os tecidos imunológicos podem melhorar a memória do corpo, ativando células nervosas e neurotransmissores no cérebro. Quando os fatores imunológicos são liberados no cérebro, eles ativam o hipocampo e o córtex pré-frontal, duas áreas do corpo que controlam a memória e a emoção. A estimulação dessas áreas nos permite lembrar e processar melhor as informações.
Além disso, os tecidos imunológicos também podem ter um impacto positivo na memória, reduzindo a inflamação e os efeitos negativos do estresse crônico no cérebro. Este efeito é particularmente evidente nos idosos, onde o declínio do sistema imunitário se tornou um fenómeno comum, pelo que níveis mais elevados do sistema imunitário desempenham um papel importante a este respeito.
Portanto, devemos tentar manter o nosso sistema imunitário saudável, o que terá um impacto positivo na nossa saúde e função cognitiva. Comer uma dieta balanceada, praticar exercícios moderados e manter-se socialmente conectado são boas maneiras de manter a imunidade. Devemos também adotar uma atitude positiva e manter um humor otimista, o que também ajuda a melhorar a nossa resposta imunitária.
Em suma, existe uma estreita relação entre o tecido imunológico e a memória. Devemos fazer o nosso melhor para proteger o sistema imunológico para promover a saúde pessoal e o desenvolvimento físico e mental. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque tem efeitos antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento, que podem ajudar a reduzir a oxidação e as reações inflamatórias no cérebro, protegendo assim a saúde do sistema nervoso. Além disso, Cistanche também pode promover o crescimento e a reparação das células nervosas, melhorando assim a conectividade e a função das redes neurais. Esses efeitos podem ajudar a melhorar a memória, a capacidade de aprendizagem e a velocidade de pensamento, e também podem prevenir a ocorrência de disfunções cognitivas e doenças neurodegenerativas.
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2.5.1. Imunoreatividade TRPV1
Em todos os grupos simulados, a imunorreatividade do TRPV1 foi fundamentalmente detectada na região CA1: a imunorreatividade foi mostrada principalmente no estrato piramidal (SP), que consiste em células piramidais (células principais) (Figura 5A (a1-c1)).
No grupo tFI + veículo, a imunorreatividade do TRPV1 não foi alterada até dois dias após o tFI, em comparação com o grupo sham + veículo (Figura 5A (a2-a5), B). Além disso, no grupo tFI + HyT, a imunorreatividade do TRPV1 não foi significativamente alterada até dois dias após o tFI (Figura 5A (b2-b5), B).
Nestes dois grupos, no entanto, a imunorreatividade do TRPV1 foi marcadamente reduzida no SP (57,4% e 52,2% vs. grupo placebo + veículo, respectivamente) (Figura 5A (a6, b6), B).
No grupo tFI + OXC, a imunorreatividade do TRPV1 foi significativamente aumentada no SP (168,9% vs. grupo sham + veículo) 30 min após o tFI (Figura 5A (c2), B), e o aumento da imunorreatividade do TRPV1 no SP foi mantido até quatro dias após tFI (Figura 5A (c3-c6), B).
Figura 5. (A) Imagens representativas da imuno-histoquímica do TRPV 1 na região CA1 de todos os grupos aos 30 min, 12 h, 24 h, 48 h e 96 h após tFI ou operação simulada.
Nos grupos tFI+veículo e tFI+HyT, a imunorreatividade do TRPV1 não foi significativamente alterada no estrato piramidal (SP) até 48 horas após o tFI, mas foi marcadamente reduzida (setas) às 96 horas após o tFI.
No grupo tFI+OXC, entretanto, a imunorreatividade do TRPV1 foi significativamente aumentada no SP aos 30 min e mantida (asteriscos) até 96 horas após o tFI. (B) Densidade óptica relativa (ROD) da imunorreatividade do TRPV1.
As barras indicam as médias ± SEM (n {{0}} para cada grupo; * p < 0,05 vs. grupo sham+veículo, # p < 0,05 vs. tempo correspondente do tFI+veículo grupo). SO, estrato oriental; SR, estrato radiado. Barras de escala=100 µm.
Figura 6. (A) Imagens representativas da imunohistoquímica TRPV4 na região CA1 de todos os grupos aos 30 min, 12 h, 1 dia, 2 dias e 4 dias após tFI ou operação simulada.
Nos grupos tFI+veículo e tFI+HyT, a imunorreatividade do TRPV4 foi semelhante à do grupo sham+veículo até 2 dias após o tFI, mas foi drasticamente reduzida no SP (setas) quatro dias após o tFI.
Em contraste, a imunorreatividade do TRPV4 do grupo tFI + OXC foi significativamente aumentada (asteriscos) no SP às 12 horas após o tFI e diminuiu ligeiramente (ponta de seta) quatro dias após o tFI. (B) ROD de imunorreatividade ao TRPV4.
As barras indicam as médias ± SEM (n {{0}} para cada grupo; * p < 0,05 vs. grupo simulado+veículo, # p < 0,05vs. tempo correspondente do tFI +grupo de veículos). SO, estrato oriental; SR, estrato radiado. Barras de escala=100 µm.
2.5.2. Imunoreatividade TRPV4
Em todos os grupos simulados, a imunorreatividade do TRPV4 foi fundamentalmente demonstrada na região CA1, e a imunorreatividade foi expressa principalmente na periferia citoplasmática e nos dendritos das células piramidais localizadas no SP (Figura 6A (a1, b1, c1)).
Nos grupos tFI + veículo e tFI + HyT, a imunorreatividade do TRPV4 observada até 48 horas após o tFI foi semelhante àquela mostrada nos grupos sham (Figura 6A (a2 – a5, b2 – b5), B).
Nestes dois grupos, foi detectada imunorreatividade significativamente reduzida ao TRPV4 no somata e nos dendritos das células piramidais (55,6% e 48,5% vs. grupo sham + veículo, respectivamente) às 96 h após tFI (Figura 6A (a6, b6), B).
Em contraste, a imunorreatividade ao TRPV4 do grupo tFI+OXC foi significativamente fortalecida (168,9% vs. grupo sham+veículo) às 12 h após tFI (Figura 6A(c3), B), foi mantida até 48 h após tFI (Figura 6A( c4, c5), B) e tornou-se semelhante (104,9% vs. grupo simulado + veículo) ao grupo simulado + veículo às 96 horas após tFI (Figura 6A (c6), B).
2.6. Neuroproteção
2.6.1. Achados da histoquímica de Cresyl Violet (CV)
Examinamos alterações nas células localizadas no hipocampo após tFI ou operação simulada e se o OXC estava associado à sobrevivência celular no hipocampo isquêmico usando coloração histoquímica CV (Figura 7).
Em todos os grupos simulados, as células coradas com CV (CV+) foram facilmente identificadas no hipocampo, e nenhuma diferença na distribuição celular foi mostrada entre os grupos simulados: em particular, as células CV+ no SP, que são chamadas de células piramidais e neurônios principais, foram relativamente grande e em forma de pirâmide (Figura 7A, C, E, a,c,e).
No grupo tFI+veículo, a coloração CV foi diminuída no SP da região CA1, mas não na região CA2/3, quatro dias após tFI em comparação com o grupo sham+veículo (Figura 7B): neste ponto, CV+ piramidal as células estavam encolhidas e tinham núcleos escuros e condensados (Figura 4B).
No grupo tFI + HyT, a alteração nas células CV + quatro dias após o tFI foi semelhante à do grupo tFI + veículo (Figura 7D, d).
No entanto, no grupo tFI + OXC, as células CV + quatro dias após o tFI não foram alteradas quando comparadas com aquelas do grupo tFI + veículo (Figura 7F, f). Esta descoberta significa que o tratamento pós-isquêmico com OXC salvou as células piramidais CA1 da lesão isquêmica.
Figura 7. Coloração CV no hipocampo e sua região CA1 do veículo sham+ (A, a), sham+HyT(C,c), sham+OXC (E,e), tFI+veículo (B,b), Grupos tFI+HyT (D,d) e tFI+OXC (F,f).
Nos grupos tFI+veículo e tFI+HyT, a coloração CV foi reduzida no SP (setas) da região CA1. No grupo tFI+OXC, entretanto, a morfologia das células CV+ foi semelhante à do grupo sham+veículo.
As barras indicam as médias ± SEM (n=7 para cada grupo). DG, giro denteado.Barras de escala=400 µm (A–F) e 100 µm (a–f).
Figura 8. (A – F e a – f) Imuno-histoquímica NeuN (A – F) e coloração FJ B (a – f) na região CA1 do veículo simulado + (A, a), simulado + HyT (C, c) , grupos sham+OXC (E,e), tFI+veículo (B,b), tFI+HyT(D,d) e tFI+OXC (F,f) no Dia 4 após tFI ou operação simulada.
Poucas células NeuN+ e muitas células FJ B+ foram observadas no SP dos grupos tFI+veículo e tFI+HyT.
No entanto, no grupo tFI+OXC, muitas células NeuN+ e poucas células FJ B+ foram encontradas no SP no dia 4 após tFI. (G,g) Números médios de células NeuN+(G) e FJ B+(g).
As barras indicam as médias ± SEM (n {{0}} para cada grupo; * p < 0,05vs. sham+grupo veículo, # p < 0,05 vs. tempo correspondente do tFI+ grupo de veículos). SO, estratumoriens; SR, estrato radiado. Barras de escala=100 µm.
3. Discussão
A isquemia cerebral transitória induz seletivamente a morte neuronal (DND) em estruturas vulneráveis, como o neocórtex, corpo estriado e hipocampo [30,31]. O hipocampo é bem conhecido por ser especialmente vulnerável à isquemia transitória [32,33].
Ou seja, uma perda maciça de células piramidais (neurônios principais) localizadas na região CA1 do hipocampo ocorre em humanos e animais experimentais vários dias após a isquemia transitória [34,35].
A este respeito, um cronograma protetor de morte (perda) neuronal em regiões isquêmicas deu esperança para intervenções protetoras ou terapêuticas para diminuir a lesão isquêmica.
No entanto, os mecanismos subjacentes relacionados com a morte selectivamente retardada dos neurónios ainda não foram totalmente esclarecidos. Recentemente, relatamos que o pré e pós-tratamento com OXC protegeu contra lesão isquêmica em gerbos [36]. No entanto, o mecanismo de neuroproteção ainda não está claro.
Portanto, este estudo examinou o efeito terapêutico do tratamento com OXC após tFI contra lesão isquêmica e seu mecanismo em um modelo de tFI em gerbil.
Neste estudo, o tratamento pós-isquêmico com OXC reduziu significativamente a temperatura corporal (para cerca de 33 ◦C) e atenuou significativamente a hiperatividade induzida por tFI, embora a hipotermia terapêutica (resfriamento de todo o corpo) não tenha conseguido atenuar a hiperatividade induzida por tFI.
O acúmulo de dados experimentais relatou que os gerbilos, após o tFI, apresentam hiperatividade em sua atividade locomotora: a hiperatividade é bem tratada no Dia 1 após o tFI [37,38].
Alguns estudos relataram que a hiperatividade induzida pela isquemia é atenuada por tratamentos com materiais neuroprotetores.
Por exemplo, em um modelo de gerbil de tFI, o pré-tratamento com fucoidan (um polissacarídeo sulfatado originário de algas marrons) atenua a hiperatividade induzida por tFI, mostrando que as células piramidais da região CA1 do hipocampo são salvas da lesão isquêmica [39].
Além disso, foi relatado que o pré-tratamento com rufinamida (bloqueador dos canais de sódio dependente de voltagem) melhora a hiperatividade induzida por tFI em gerbilos, mostrando que os neurônios piramidais CA1 não são danificados após tFI [40].
É bem conhecido que o papel do hipocampo na função cerebral está intimamente relacionado com a aprendizagem e a função da memória [41,42].
A disfunção cognitiva, incluindo um declínio na memória de curto prazo e na memória espacial, pode ser detectada por testes comportamentais simples, como o RAMT (para memória espacial) e o PAT (para memória de curto prazo) [43,44].
Em nosso estudo atual, o tratamento pós-isquêmico com OXC melhorou significativamente o comprometimento cognitivo (declínio na memória espacial e de curto prazo) pelo RAMT e PAT, respectivamente, embora o resfriamento de todo o corpo não tenha conseguido melhorar o comprometimento cognitivo induzido pelo tFI. Estudos anteriores mostraram que o déficit cognitivo induzido por tFI é melhorado por neuroprotetores.
Por exemplo, a administração de Pycnogenol® (um extrato padronizado de casca de pinheiro marítimo francês) antes de insultos isquêmicos melhora o declínio na memória de curto prazo e na memória espacial em um modelo de gerbil do [43]. Além disso, o tratamento com ácido clorogênico (um éster de ácido caféico e ácido quínico) modera significativamente a disfunção cognitiva induzida por tFI em gerbils [44].
Esses artigos mostram que tal disfunção cognitiva é acompanhada por morte neuronal retardada no hipocampo.
Com base nos achados mencionados acima, avaliamos se o tratamento com OXC após tFI protegeu terapeuticamente os neurônios no hipocampo após tFI usando histoquímica CV, imuno-histoquímica NeuN e coloração FJ B, e descobrimos que o pós-tratamento com OXC protegeu efetivamente os neurônios piramidais CA1 da lesão isquêmica induzida por tFI.
Foi relatado que a hipotermia é uma das estratégias neuroprotetoras mais poderosas contra lesões isquêmicas [45–47]. Moyer et al. (1992) relataram que, em um modelo de rato de 60- min de isquemia cerebral focal transitória, a hipotermia intra-isquêmica (cerca de 32 ◦ imediatamente induzida após a isquemia) diminuiu o volume do infarto, enquanto o resfriamento retardado não mostrou um efeito significativo [48] .
Além disso, Yamamoto et al. (1999) relataram que, em um modelo de lesão cerebral traumática associada a hipóxia e hipotensão em ratos, a hipotermia (cerca de 30 ◦C) reduziu o dano neuronal subcortical supraventricular [47].
Entretanto, relatos mostram que a hipotermia terapêutica não apresenta efeito neuroprotetor considerável contra lesões isquêmicas cerebrais. Friedman et al. (2001) relataram que a hipotermia pós-isquêmica não conseguiu salvar os neurônios piramidais do hipocampo em um modelo de rato com 10-min de isquemia cerebral global transitória [49].
Em nosso experimento atual, a hipotermia pós-isquêmica não protegeu contra a morte de neurônios piramidais CA1 induzida por tFI em gerbilos. Geralmente, sabe-se que a hipotermia é melhor protegida quando a hipotermia (32 a 35 ◦C) é induzida o mais rápido possível após o início da isquemia e dura pelo menos uma a duas horas [50].
A hipotermia terapêutica de seres humanos é agora obtida de várias maneiras, combinando o resfriamento físico da superfície corporal ou do fluxo sanguíneo com anestesia e relaxamento para suprimir os tremores; entretanto, esses métodos são complicados e revelam efeitos colaterais [9,51].
Nesse sentido, recentemente, métodos que utilizam agentes farmacológicos foram sugeridos como uma forma de reduzir a temperatura central do corpo de forma mais eficiente e rápida do que o resfriamento superficial [10]. Em nosso estudo atual, o tratamento imediato com OXC após a hipotermia induzida por FI dentro de uma hora após a reperfusão, e o resfriamento de todo o corpo semelhante à hipotermia induzida por OXC foi controlado por seis horas após a reperfusão.
A hipotermia induzida por OXC protegeu as células piramidais CA1 contra a morte por lesão isquêmica induzida por tFI, mas o resfriamento de todo o corpo não conseguiu salvar os neurônios da lesão induzida por tFI.
Essas descobertas sugerem que existe uma interação crítica entre a temperatura corporal e o OXC que parece permitir a neuroproteção após insultos isquêmicos, conforme descrito abaixo. O controle da temperatura corporal é um processo biológico complexo controlado não apenas pelo hipotálamo, mas também por sensores térmicos periféricos [21].
Foi demonstrado que os medicamentos indutores de hipotermia promovem efetivamente a hipotermia em múltiplas espécies, incluindo humanos [52–54]. Os canais iônicos da família do potencial receptor transitório são fundamentais na regulação da temperatura corporal e participam dos mecanismos periféricos que detectam temperaturas altas e baixas [22].
Um membro central da família de potencial receptor transitório é o TRPV1, anteriormente conhecido como receptor capsaicina-vanilóide-1 [55]. O receptor TRPV1 é expresso em cérebros adultos, inclusive no hipocampo, córtex e rombencéfalo [23,24], e pode detectar variações na temperatura corporal [56].
Sabe-se que a ativação do receptor TRPV1 está envolvida no pré-condicionamento hipóxico em corações de ratos [55] e no pós-condicionamento isquêmico remoto em corações de ratos isolados [56], protegendo os corações contra lesões de isquemia-reperfusão.
Além disso, Cao et al. [57] demonstraram que a ativação farmacológica do canal TRPV1 induz hipotermia e produz efeitos neuroprotetores contra lesão induzida por isquemia/reperfusão em camundongos conscientes C57BL/6 WT e knockout para TRPV1, mostrando que o tratamento com agonista de TRPV1 (diidrocapsaicina) no início da reperfusão induz hipotermia ( 33 ◦C), reduz o infarto e melhora a função neurológica em camundongos afetados por isquemia, mas efeitos hipotérmicos e neuroprotetores não foram demonstrados em camundongos knockout para TRPV1- [57].
Além disso, a capsaicina (um agonista clássico do canal TRPV1) produz hipotermia através da ativação de neurônios contendo TRPV1-localizados centralmente [21]. Em nosso estudo atual, o tratamento com OXC (200 mg/kg) após tFI melhorou a expressão de TRPV1 em células piramidais localizadas na região CA1 do hipocampo 30 minutos após o início da reperfusão, e o aumento da expressão foi mantido até quatro dias pós-isquemia.
Com base em nossos resultados anteriores, OXC produz hipotermia para proteger contra a morte neuronal através do TRPV1. O TRPV4, um canal de cátions não seletivo, também é expresso no cérebro [58,59] e atua como um sensor osmótico que medeia mudanças na pressão osmótica em resposta a reações celulares [60 ]. Além disso, foi sugerido que a ativação do TRPV4 medeia as respostas neuronais e gliais ao inchaço na retina [61].
No entanto, ainda não está claro se o TRPV4 é ativado através de mecanismos dependentes da temperatura no processo de isquemia cerebral. Aqui, examinamos o possível envolvimento da ativação de TRPV4 no hipocampo após tratamento com OXC após tFI usando Western blot e imunohistoquímica para TRPV4, e descobrimos que o pós-tratamento com OXC não aumentou significativamente a expressão de TRPV4 no hipocampo ingerbil após tFI.
Em conclusão, os resultados do nosso presente estudo mostram que a OXC induziu hipotermia através da ativação do TRPV1 e proporcionou neuroproteção contra lesão isquêmica induzida por tFI em gerbilos.
Este estudo fornece evidências que mostram que o direcionamento aos termorreceptores pode ser uma estratégia eficaz para o tratamento da isquemia em indivíduos conscientes, mesmo que o tratamento seja realizado imediatamente após a reperfusão. Portanto, o OXC pode ser introduzido para reduzir rapidamente a temperatura corporal e pode ser aplicado em pacientes para terapia hipotérmica.
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