Células TH17 humanas envolvem os poros da Gasdermin E para liberar IL-1 na ativação do inflamassoma NLRP3

Foi demonstrado que as respostas imunes inatas podem adotar propriedades adaptativas, como a memória. Não se sabe se as células T utilizam vias de sinalização imunológica inata para diversificar seu repertório de funções efetoras. Gasdermin E (GSDME) é uma molécula formadora de poros de membrana que demonstrou executar a morte celular piroptótica e, portanto, servir como um potencial ponto de verificação do câncer. No presente estudo, mostramos que as células T humanas expressam GSDME e, surpreendentemente, que esta expressão está associada à viabilidade durável e reaproveitada para a liberação da interleucina alarmina (IL)-1. Esta propriedade foi restrita a um subconjunto de células T auxiliares humanas tipo 17 com especificidade para Candida albicans e reguladas por um inflamassoma NLRP3 intrínseco às células T, e seu envolvimento de uma cascata proteolítica de sucessivas caspases-8, caspase{{6 }} e clivagem de GSDME após estimulação do receptor de células T e maturação de calpaína licenciada por cálcio da forma pró-IL-1. Nossos resultados indicam que a formação de poros GSDME nas células T é um mecanismo de liberação não convencional de citocinas. Esta descoberta diversifica a nossa compreensão do repertório funcional e do equipamento mecanístico das células T e tem implicações para a imunidade antifúngica.

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As células T auxiliares (células TH) são importantes promotores de respostas efetoras específicas do antígeno através da secreção de citocinas distintas. As células T auxiliares tipo 17 (células TH17), em particular, são reconhecidas por suas funções antifúngicas através da secreção de sua citocina IL-17A, que é regulada pelo receptor órfão relacionado ao fator de transcrição RAR (ROR)- t1. São também os principais culpados na patogênese das doenças autoimunes2. TH17 células foram previamente reconhecidas por apresentarem heterogeneidade funcional3. Funções pró ou anti-inflamatórias são exercidas através da coexpressão diferencial de IL-17 com interferon (IFN) - ou IL-10, respectivamente4–7. No geral, isso moldou o conceito de dualismo das células TH17 e estimulou a investigação dos sinais e alvos moleculares que controlam a dicotomia entre os dois resultados funcionais das células TH17 para aplicações terapêuticas3,4,8,9. No entanto, uma compreensão profunda da identidade e da base mecanicista do destino das células TH17 patogênicas versus imunorreguladoras permanece indefinida. Mecanismos efetores adicionais, ainda a serem encontrados, que vão além da produção de IL-17 também podem operar em células TH17 com especificidades antifúngicas ou antibacterianas. As citocinas IL-1, das quais IL-1 e IL-1 representam os membros mais proeminentes, exercem efeitos inflamatórios profundos. Ao serem liberados pelas células apresentadoras de antígenos (APCs), eles não apenas induzem respostas inflamatórias inatas rápidas, mas também orquestram a imunidade adaptativa, promovendo a polarização das células TH17 e a patogenicidade das células T na ligação ao seu receptor IL-1R1 compartilhado4,10,11 . A iniciação de células TH17 independente de IL-1-, que também foi descrita anteriormente, resulta na produção de células TH17 anti-inflamatórias4. A IL-1 de fontes celulares inatas serve, portanto, como um fator de mudança para a dicotomia do destino das células TH17 pró-versus anti-inflamatórias. Ao contrário da maioria das outras citocinas, as citocinas IL-1 não possuem um peptídeo sinal e, portanto, são secretadas por um mecanismo não convencional, independente do retículo endoplasmático (ER) –Golgi.

O Pro-IL-1 requer clivagem enzimática antes da liberação no espaço extracelular e do envolvimento de seu receptor. O inflamassoma NLRP3 é um complexo proteico citosólico multimérico que reúne infecção microbiana e dano celular e recruta caspase-1 para subsequente clivagem pró-IL-112. A saída de IL-1 também requer clivagem de gás dermin D (GSDMD) mediada por caspase-1-e formação de poros em um processo chamado piroptose, uma forma inflamatória de morte celular13,14. Acredita-se que a IL-1 seja processada independentemente do inflamassoma NLRP3 através de pontos de verificação regulatórios que ainda são pouco compreendidos10. Apesar dessas vias completamente distintas para a maturação e liberação de IL-1 e IL-1 , ambas as citocinas são produzidas em conjunto por células do sistema imunológico inato, apontando para a existência de ainda a serem identificadas rotas de co-regulação. No presente estudo, mostramos que um subconjunto de células TH17 humanas envolve uma cascata de sinalização dependente de NLRP3- para induzir a formação de poros de membrana por GSDME, que serve a liberação autócrina de IL pró-inflamatória-1. Esta descoberta revela um modo não convencional de secreção de citocinas pelas células T humanas e, assim, diversifica o repertório funcional e mecanicista das células T.

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Resultados

A produção de IL-1 é uma característica das células TH humanas

Para investigar a heterogeneidade do subconjunto de células TH17 humanas e para revelar funções distintas e seu controle molecular, realizamos sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) de células TH17 humanas ativadas, que foram isoladas ex vivo do sangue periférico de acordo com para sua expressão única de marcadores de superfície de receptores de quimiocinas15. A análise exploratória por aproximação e projeção múltipla uniforme (UMAP) e agrupamento de Leiden de todas as células TH17 identificou seis clusters individuais (Fig. 1a). Uma população distinta e rara (6%) de células TH17 que expressam IL1A foi enriquecida seletivamente no cluster 1 (Fig. 1a, b). A comparação de todos os genes no cluster 1 com todos os outros clusters revelou que a IL1A estava significativamente regulada positivamente (Tabela Suplementar 1). Isto foi inesperado, uma vez que a IL -1 não é considerada pertencente ao repertório canônico de citocinas efetoras das células T, mas representa um sinal de perigo inato . IL1A não estava, no entanto, entre os principais genes expressos diferencialmente (DEGs) no cluster 1, o que exigiu uma estratégia de pesquisa mais profunda para desmascarar a sua regulação positiva significativa numa subpopulação de células TH17 (Figura 1 suplementar). No nível da proteína, os clones de células TH17 também segregaram em clones de células T IL-1 + e IL-1 distintos, apoiando assim a heterogeneidade da expressão da proteína IL-1 no nível de célula única dentro a população de células TH17 (Fig. 1c). Para comparar a expressão de IL1A pelas células TH17 com a de outros tipos de células imunológicas, particularmente produtores genuínos de IL -1 relatados anteriormente, interrogamos vários conjuntos de dados públicos de scRNA-seq de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs). Surpreendentemente, isto não revelou qualquer expressão de IL1A em vários tipos de células imunitárias de PBMCs em repouso, incluindo células T, células B, células natural killer (NK), células NKT, monócitos e células dendríticas (Figura 2a, b suplementar). Mesmo os monócitos não exibiram qualquer expressão de IL1A no nível unicelular, a menos que um estímulo específico indutor de IL1A, especificamente lipopolissacarídeo (LPS), fosse aplicado a essas células (Fig. Complementar 2c, d), o que desmascarou sua capacidade de produção de IL1A e a associação da expressão de IL1A com uma resposta imune inflamatória inata em curso (Figura 2e suplementar). É interessante que uma comparação transcriptômica unicelular dos DEGs entre células IL1A+ e IL1A– de células TH17 versus monócitos demonstrou quase nenhuma sobreposição na coexpressão gênica (IL1A e CCL3), o que foi altamente sugestivo de um modo diferente de regulação de IL1A em T células versus monócitos (Fig. 1d). Tomados em conjunto, esses resultados revelam a existência de uma subpopulação distinta de células que expressam IL-1 -dentro do subconjunto de células TH17.

O subconjunto{0}}produtor de IL de células TH17 é pró-inflamatório

Para explorar a relevância fisiológica da expressão de IL1A em células TH17 humanas, realizamos uma comparação transcriptômica imparcial de células IL1A + e IL1A-TH17 após scRNA-seq. A análise de enriquecimento de conjunto de genes (GSEA) para genes coexpressos com IL1A em células TH17, bem como a análise de enriquecimento usando DEGs, revelou uma associação impressionante de IL1A com ativação e proliferação de células T após uma interrogação imparcial de todos os termos de ontologia genética (GO) disponíveis ( Figura 2a e Figura Complementar 3). Esta descoberta desafiou o papel anteriormente atribuído à IL-1 na senescência e morte celular no novo contexto das células T17. A análise de enriquecimento também revelou uma forte sobre-representação para vários termos GO relacionados com 'inflamação', sugerindo que a expressão de IL1A pelas células TH17 contribuiu para uma identidade de células T patogénicas com papéis em doenças inflamatórias (Fig. 2a). Esta ideia foi apoiada pela regulação positiva de genes anotados com o termo GO 'resposta celular à interleucina-1', considerando o efeito de mudança pró-inflamatória relatado anteriormente da IL-1 na funcionalidade geral das células TH174 e o efeito supressor de IL autócrino -1 na expressão IL -10 (Dados estendidos Fig. 1a – c). Uma comparação direta de células IL1A+ versus células IL1A-TH17 em todos os clusters demonstrou que as células IL1A+ TH17 exibiram assinaturas pró-inflamatórias significativamente melhoradas, mas anti-inflamatórias reduzidas (Fig. 2b) 7. Além disso, o cluster 1, que foi enriquecido para células IL1A+ TH17, foi significativamente mais pró-inflamatório e menos antiinflamatório do que todos os outros cinco grupos, conforme indicado pelo GSEA (Fig. 2b). É interessante que uma comparação transcriptômica em massa de subconjuntos de células TH17 pró-inflamatórias e anti-inflamatórias revelou que IL1A está entre os principais genes regulados positivamente no subconjunto de células TH17 pró-inflamatórias (Fig. 2c, d e Dados Estendidos Fig. 2). A IL10, em vez disso, foi altamente regulamentada negativamente, como esperado de acordo com relatórios anteriores4,7. Esta correlação recíproca da expressão de IL -1 e IL -10 pelas células TH17 também foi observada ao nível da proteína por citometria de fluxo (Fig. 2e). A análise de enriquecimento com os DEGs demonstrou uma super-representação das vias KEGG (Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto) para doenças autoimunes, como 'artrite reumatóide' e 'doença inflamatória intestinal' (Fig. 2f), que apoiou a natureza pró-inflamatória do TH17 que expressa IL1A subconjunto de células. Na verdade, pacientes que sofrem de artrite idiopática juvenil (AIJ), uma forma altamente inflamatória de artrite reumatóide em crianças cuja patogênese foi anteriormente associada a IL inata-1 e IL-1 18,19, revelaram significativa e fortemente expressão elevada de IL -1 por células IL -17+ TH em comparação com células IL -17+ TH de sangue de controle saudável (Fig. 2g). Nenhum aumento de IFN- foi observado nas células IL-17+ TH do sangue de pacientes com AIJ em comparação com sangue de doador controle, apesar da associação previamente relatada de IFN- com patogenicidade de células TH17 (Fig. 2g, painel direito) 4. Além disso, a análise do líquido sinovial com correspondência sanguínea demonstrou frequências muito altas de células IL-1 + TH, sugerindo que as células T, além das células inatas, também poderiam representar uma fonte celular relevante da IL{{74} associada à doença. } no local da inflamação.

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A expressão IL-1 é regulada por um programa TH17

Para investigar se a expressão de IL-1 é uma propriedade geral das células T, enriquecemos subconjuntos individuais de células TH de PBMCs de acordo com sua expressão diferencial de receptores de quimiocinas (Extended Data Fig. 3) e comparamos sua IL-1 secreção. IL -1 foi produzido especificamente pelo subconjunto de células TH17, mas não pelo subconjunto de células TH1, subconjunto de células TH2 ou células T reguladoras (células Treg) (Fig. 3a-c). Surpreendentemente, o seu nível de secreção na estimulação com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 correspondeu ao dos monócitos humanos estimulados com LPS e nigericina, indicando que as células TH17 humanas, apesar da sua identidade imunitária adaptativa, servem como uma fonte importante do sinal de perigo IL. -1 (Fig. 3a). A expressão intracelular da proteína IL -1 estava ausente em células TH em repouso recém-isoladas, mas indutível na ativação do receptor de células T (TCR), com enriquecimento significativo em células TH17 em comparação com células TH enriquecidas com células TH1, TH2 e Treg (Fig. 3b ,c). Essas descobertas parecem ser específicas do sistema imunológico humano porque relatórios anteriores excluíram a produção de IL-1 por células T de camundongos16. A associação única de IL-1 com o subconjunto de células TH17 nos levou a dissecar mecanicamente a regulação desta citocina. É interessante que a expressão de IL-1 tenha sido reduzida na inibição específica de ROR-t, o fator mestre de transcrição das células TH17 (Fig. 3d, e) 1. Esses dados estão de acordo com a presença de sítios de ligação putativos para ROR-t e ROR- nas regiões promotoras e intensificadoras de IL1A (Extended Data Fig. 4a, b). O destino de um subconjunto específico de células TH é determinado pelo microambiente polarizador distinto de citocinas durante a estimulação de células T ingênuas. Observamos a maior expressão intracelular e secreção de IL -1 na preparação de células T virgens em condições de polarização de células TH17 (IL -1 e fator de crescimento transformador (TGF) -) (Fig. 3f, g). No entanto, tratamentos únicos com IL-1 ou TGF- sozinhos não levaram à expressão significativa de IL-1 em células T virgens, enfatizando o efeito sinérgico das citocinas combinatórias de priming de células TH17 na indução de novo de IL -1 (Fig. Complementar 4). As condições de priming celular TH1 (IL-12) e TH2 (IL-4), em contraste, não alteraram significativamente a secreção de IL-1 em comparação com aquela sob estimulação na ausência de citocinas polarizadoras. Juntas, essas descobertas demonstram que as células T virgens adquirem a capacidade de produzir IL-1 através de citocinas polarizadoras de células TH17. As células TH de memória também exibiram uma regulação positiva adicional significativa de sua citocina efetora IL-1 em microambientes IL-1 e TGF- (Fig. 3h).

Figura 1|Um subconjunto distinto de células TH17 humanas pode expressar IL-1.

A identidade dos subconjuntos de células TH também é caracterizada por propriedades de migração distintas, que estão associadas à expressão diferencial de receptores de quimiocinas20. Observamos que a expressão de IL-1 foi enriquecida em células T CCR6+ mas não em células T CCR6– e foi reduzida em células T CXCR3– em comparação com células T CXCR3+, embora não tenha havido diferença em Expressão de IL -1 entre células T CCR 4+ e CCR4– (Fig. 3i). Esses dados demonstram que as células produtoras de IL exibem o padrão de migração previamente atribuído às células produtoras de IL15. Tomados em conjunto, estes dados mostram consistentemente que IL-1 é uma função única das células TH17 humanas.

Figura 2|Células TH17 produtoras de IL-1 são pró-inflamatórias

Figura 3|A produção de IL-1 pelas células T é restrita ao destino das células TH17

Calpaína é um pré-requisito para a secreção de IL-1 pelas células TH17

Para explorar o mecanismo de secreção de IL-1, tratamos células TH17 com o inibidor de exportação de proteína brefeldina A (BFA) e descobrimos que a secreção de IL-1 não foi afetada, ao contrário das citocinas convencionais, como como IL-17A (dados estendidos Fig. 5a – c). Isto apoia a existência de uma via não convencional independente de ER-Golgi para a secreção de IL -1 pelas células T e está de acordo com relatos anteriores para tipos de células inatas . Uma propriedade única que foi previamente atribuída à IL-1 é a sua localização simultânea no citoplasma e na membrana plasmática23. Descobrimos, no entanto, que as células TH17, em contraste com os monócitos, não exibiam IL ligada à membrana -1 (Extended Data Fig. 5d). Embora a clivagem de pró-IL-1 seja necessária para gerar IL extracelular bioativa-1 , sabe-se que IL-1 é liberada passivamente na morte celular e exerce seu potencial bioativo após ligação a IL{ {19}}RI em sua forma não clivada ou clivada24. Para determinar se o pró-IL-1 sofre processamento intracelular para liberação controlada por células T humanas, avaliamos as formas completas e maduras de IL-1 no sobrenadante de células TH17 ativadas. Para excluir quaisquer monócitos contaminantes como uma fonte potencial de IL secretada -1, geramos clones de células TH17 durante um período de 2 semanas e os estimulamos novamente com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 por mais 5 dias antes do imunotransferência. Em todos os seis clones de células TH17 testados, encontramos enriquecimento preferencial da forma clivada de IL -1 nos sobrenadantes da cultura (Fig. 4a). Os lisados ​​​​de células TH17, em contraste, mostraram enriquecimento preferencial da forma pró-IL -1 não clivada, como esperado (Figura 5a suplementar). Esses resultados excluem a liberação passiva de pró-IL-1 durante a necrose celular como a modalidade de saída padrão de IL-1 em células T e, em vez disso, sugerem que as células TH17 humanas devem possuir maquinaria molecular para pró-IL{{ 46}} clivagem para permitir a liberação extracelular controlada desta potente molécula bioativa por células T viáveis, em contraste com células inatas (Fig. Complementar 5b). Isto não exclui, no entanto, uma contribuição adicional da necrose de células T para a liberação da pró-forma bioativa de IL -1 (Figura 5a suplementar). O processamento de Pro-IL-1 em locais de clivagem distintos pode ser catalisado por diversas proteases17,25,26. A calpaína é uma cisteína protease dependente de cálcio que pode dar origem ao fragmento IL -1 p17 maduro, que identificamos aqui. Detectamos atividade de calpaína em células TH17. Aumentou na ativação com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 (Fig. 4b). A secreção de IL -1 pelas células TH17 era dependente da atividade intrínseca da calpaína às células T porque a inibição farmacológica da calpaína reduziu a secreção de IL -1 pelas células TH17 ativadas no espaço extracelular de maneira dependente da dose (Fig. 4c) . Correspondentemente, a inibição da calpaína resultou no acúmulo intracelular de pró-IL -1 (Fig. 4d). Para corroborar a dependência da secreção de IL -1 na calpaína, também eliminamos geneticamente a calpaína em células TH17 humanas usando repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) –Cas9. Isto revelou um papel para o CAPN2, mas não para o CAPN1, na secreção de IL -1 pelas células TH17 humanas (Fig. 4e). Em contraste, a secreção de IL -1 induzida por LPS / nigericina pelos monócitos não foi dependente da calpaína (Fig. 4f). Estes dados foram consistentes com a expressão preferencial de CAPN2 mas não de CAPN1 por subconjuntos de células T humanas em contraste com células dendríticas, que exibiram um padrão de expressão do gene da calpaína invertido (Figura 6 suplementar). A secreção de IL-1 em células TH17 aumentou no acúmulo intracelular de cálcio e na inibição da sarco-/ER Ca2+ ATPase com tapsigargina (Fig. 4g) e diminuiu na quelação de cálcio extracelular com (etilenobis(oxinitreto) )tetra-acetato (EGTA) (Fig. 4h), consistente com a função dependente de cálcio da calpaína e secreção de IL{100}} dependente de TCR26. Juntos, esses dados demonstraram que a atividade proteolítica da protease calpaína dependente de cálcio é um pré-requisito para a secreção não convencional de IL-1 por células TH17 humanas ativadas por TCR.

A secreção de IL-1 pelas células TH17 é regulada pela ativação do inflamassoma NLRP3

Apesar do papel essencial da calpaína na maturação pró-IL-1, o mecanismo que leva à saída extracelular da IL clivada-1 permaneceu desconhecido e, portanto, foi abordado a seguir. A liberação extracelular de IL-1 pelas células mieloides já foi associada à ativação do inflamassoma NLRP3, à atividade não enzimática da caspase-1 e à liberação de IL-1 16,27. Testamos se as células TH17 humanas possuíam a estrutura molecular do inflamassoma NLRP3 e encontramos a expressão proteica de NLRP3 e a molécula adaptadora, proteína semelhante a uma mancha associada à apoptose contendo um CARD (ASC), em células TH17 humanas (Extended Data Fig. 6a, b). Observamos a ativação contínua do inflamassoma em células TH17 ativadas por TCR pela identificação de partículas ASC usando a tecnologia ImageStream (Fig. 5a, b) 28,29. Surpreendentemente, as frequências aumentadas de partículas ASC foram exclusivamente confinadas ao subconjunto de células TH17 (Fig. 5b, esquerda). As células TH17 aproximaram-se até da formação de partículas ASC de macrófagos estimulados por LPS e ATP (Fig. 5b, direita). Os subconjuntos de células TH1 e TH2, em contraste, exibiram níveis de manchas ASC de fundo (Fig. 5b, esquerda). Além disso, a formação de manchas ASC e NLRP3-foi completamente anulada na presença do inibidor específico do inflamassoma NLRP3 MCC950, substanciando a existência de ativação contínua do inflamassoma NLRP3 em células TH17 (Fig. 5b, à esquerda e Dados Estendidos Fig. 6c). O envolvimento seletivo do inflamassoma NLRP3 pelas células TH17 foi ainda apoiado pela forte indução de transcritos de NLRP3 na estimulação de células T na presença das citocinas polarizadoras de células TH17 IL -1 e TGF- (Fig. 5c). É importante ressaltar que a secreção de IL-1 pelas células TH17 foi significativamente reduzida pela inibição específica do inflamassoma NLRP3 com MCC950 (Fig. 5d), demonstrando assim o papel crítico do inflamassoma NLRP3 na secreção de IL-1 por células TH17 humanas. Caspase-1 é a proteína efetora canônica no complexo inflamassoma NLRP330. Observamos expressão de pró-caspase -1 em células TH17 humanas ativadas (Fig. 5e). No entanto, em contraste com os resultados em monócitos estimulados por LPS e nigericina, nenhuma caspase clivada -1 foi detectada em lisados ​​​​de células TH17 humanas (Fig. 5e). Esta observação foi corroborada pela ausência de coloração de caspase -1 FLICA em células TH17 que foram estimuladas na presença ou ausência de estímulos de citocinas promotoras de IL -1 (Extended Data Fig. 7a – e). Excluímos ainda a liberação extracelular de caspase -1 por ELISA após estimulação de células TH17 com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 por 5 dias (Fig. 5f). Mesmo na presença do estímulo IL-1 IL-1, a secreção de caspase-1 não foi induzível e permaneceu tão baixa quanto a dos monócitos em repouso (Fig. 5f). A inibição farmacológica da caspase-1 com Ac-YVAD-CMK não reduziu a secreção de IL-1 na presença ou ausência de indução de IL-1 por IL-1. Em vez disso, observamos secreção ligeiramente elevada de IL -1 na inibição da caspase -1 (Fig. Complementar 7a, b). É importante ressaltar que as células TH17 não mostraram qualquer alteração na secreção de IL -1 na depleção da expressão de CASP1 projetada por CRISPR-Cas 9- (Fig. 5g). Em consonância com a ausência de caspase bioativa-1, não observamos qualquer secreção de IL-1 pelas células TH17 humanas. Isso contrastou com o caso dos monócitos, que demonstraram secreção de IL{101}}dependente de caspases na estimulação com LPS e ATP (Extended Data Fig. 7f). Além disso, nenhuma IL{103}} intracelular foi detectável ou induzível por citocinas polarizadoras de IL-1 -em células TH17 ou clones de células TH17 ou detectável em células TH17 ativadas por análise de scRNA-seq (Extended Data Fig. 7g,h, eu). Isso contrastou com a descoberta dos monócitos, que coexpressaram IL-1 e IL-1 no nível unicelular, consistente com a secreção sugerida anteriormente e o suposto padrão de co-regulação de ambos IL-1 citocinas (Extended Data Fig. 7g) 16,27. Cumulativamente, esses dados demonstram que as células TH17 humanas produzem IL-1 independentemente da caspase-1 e IL-1, ao contrário dos monócitos e presumivelmente de outras células do sistema imunológico inato, apesar do claro envolvimento do inflamassoma NLRP3.

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IL-1a sai das células TH17 através dos poros GSDME

As gasderminas pertencem a uma família de moléculas efetoras formadoras de poros recentemente identificadas que permitem a liberação de mediadores inflamatórios31. Nossa análise do transcriptoma revelou uma regulação positiva seletiva da expressão de GSDME no subconjunto de células TH17 estimuladas por IL pró-inflamatória, mas nenhuma regulação de qualquer outro membro da família da gastrina (Fig. 6a). Isto foi surpreendente considerando que a expressão de GSDME nunca havia sido relatada em células T primárias. Em contraste, o GSDMD, que é conhecido por ser regulado pelo inflamassoma NLRP3 e por ser um alvo da caspase -1 (ref. 31), não foi regulado positivamente, apoiando a ideia de sinalização não-canônica do inflamassoma NLRP3. Foi demonstrado anteriormente que o GSDME forma poros de membrana em células do sistema imunológico inato que podem servir como canais para a liberação extracelular de alarminas e iniciar a morte celular piroptótica semelhante ao GSDMD32. Para testar a associação do GSDME com o subconjunto de células TH17, avaliamos se as citocinas polarizadoras de células TH17 co-regulam o GSDME. Somente a combinação de TGF- com IL-1 (TH17), mas não IL-12 (TH1) ou IL-4 (TH2), aumentou os níveis de transcrição de GSDME conforme avaliado por transcrição reversa – quantitativa PCR (RT-qPCR) (Fig. 6b). Isto foi apoiado pela existência de sítios de ligação putativos para os fatores de transcrição associados às células TH17 ROR- e BATF (fator básico de transcrição de zíper de leucina, semelhante a ATF) nas regiões promotoras de GSDME (Extended Data Fig. 8a, b) . A expressão de GSDMD, em contraste, não foi regulada por citocinas polarizadoras de células T (Figura 8 suplementar). Este resultado levou-nos a avaliar a expressão de GSDME ao nível da proteína em células TH17 humanas. A forma pró-GSDME foi induzível na ativação do TCR. A indução da proteína GSDME em resposta a este sinal imune adaptativo foi inesperada, mas ainda apoiada pela existência de sítios de ligação putativos de fatores de transcrição responsivos à sinalização de TCR, como NFAT, FOS, JUN e RELA em regiões promotoras de GSDME (Extended Data Fig. 8a ,b). O GSDME foi expresso 24 horas após a estimulação policlonal. O GSDME formador de poros N-terminal clivado foi detectável em momentos tardios, 3-4 dias após a estimulação com TCR de células TH17 (Fig. 6c). GSDMD completo foi induzido concomitantemente na ativação de células T. Em contraste, nenhuma clivagem de GSDMD foi observada, como previsto pela ausência de secreção de caspases -1 e IL -1, deixando o papel de GSDMD nas células TH17 aberto para análise posterior (Fig. 6c). Em seguida, pretendemos explorar se os poros do GSDME servem como canais para a liberação extracelular de IL-1 em células TH17. Portanto, eliminamos o GSDME com a tecnologia CRISPR – Cas9 e monitoramos a liberação de IL-1 no sobrenadante ao longo do tempo por ELISA. A ausência de GSDME, mas não de GSDMD, inibiu significativamente a liberação de IL -1 pelas células TH17 (Fig. 6d). Isto demonstra claramente que a formação de poros GSDME serve como mecanismo para a liberação não convencional de IL-1 pelas células TH17 humanas.

Figura 4|Calpaína é um pré-requisito para a liberação de IL clivada-1 por células TH17 humanas

Figura 5|A ativação não convencional do inflamassoma NLRP3 regula a produção de IL-1 por células TH17 humanas

A cascata de clivagem caspase-8/3 GSDME permite a secreção de IL3-dependente-1 de NLRP

Em seguida, exploramos a possibilidade de crosstalk mecanístico entre a ativação do inflamassoma NLRP3 e a clivagem de GSDME em células TH17 humanas. Foi recentemente demonstrado que a caspase -3 cliva o GSDME, que por sua vez é um alvo da caspase interatora do inflamassoma NLRP3 -8 (refs. 34,35). Na verdade, tanto a pró-caspase-8 quanto a pró-caspase-3 foram detectadas em células TH17. Descobrimos que a clivagem de ambas as caspases ocorreu na estimulação do TCR e precedeu a clivagem do GSDME (Fig. 6e). Em contraste, nenhum produto clivado de caspase -8 e caspase -3 foi detectado em monócitos estimulados por nigericina e LPS (Fig. 6e). Para estabelecer um papel causal para essas caspases na clivagem de GSDME e na secreção de IL-1 pelas células T, bloqueamos farmacologicamente a atividade da caspase-3 ou da caspase-8 com o inibidor Z-DEVD -FMK ou Z-IETD-FMK, respectivamente. A inibição da atividade da caspase-8 com Z-IETD-FMK anulou a clivagem da caspase alvo a jusante-3, em linha com relatórios anteriores sobre outros tipos de células36. Ambos os tratamentos reduziram a clivagem de GSDME e ao mesmo tempo anularam a secreção de IL -1 (Fig. 6f – i e Dados Estendidos Fig. 9a, b). A inibição da caspase -1, por outro lado, não afetou a clivagem da caspase -3 ou do GSDME (Figura 9 suplementar). Esses dados demonstraram claramente que o eixo caspase-8–caspase-3–GSDME estava operando em células TH17 humanas na ativação do TCR e que regulava a secreção de IL-1 nessas células. Para finalmente estabelecer a ligação entre esta cascata de clivagem proteolítica e o inflamassoma NLRP3, aplicamos MCC950 às células TH17 estimuladas, o que, de fato, produziu uma redução significativa na clivagem de caspase -3 e GSDME no dia 5 (Fig. 6f, g e Dados Estendidos Fig. 9c). Uma redução na clivagem da caspase -8 foi, no entanto, menos pronunciada no mesmo momento da análise, o que estava em linha com a sua janela de tempo de ativação anterior (Fig. 6e, f). Em resumo, a inibição direcionada de cada ator molecular individual estabeleceu a cascata inflamassoma-caspase-8-caspase-3–GSDME NLRP3 como a via proteolítica envolvida na liberação extracelular de IL bioativa-1 por seres humanos Células TH17.

Figura 6|A cascata de clivagem NLRP3 – casp8/3 leva a poros GSDME para liberação de IL -1

Células TH17 são resilientes à piroptose apesar dos poros GSDME

A formação de poros da gasdermina já foi associada à morte celular piroptótica em vários tipos de células . Encontramos expressão da unidade N-GSDME formadora de poros clivada na membrana plasmática, mas não no citosol, que apoiou a função de formação de poros do GSDME nas células T (Fig. 7a). Surpreendentemente, uma comparação transcriptômica de células TH17 humanas em massa deficientes em GSDME, intactas e editadas pelo gene CRISPR-Cas9, pela GSEA excluiu diferenças em várias formas de morte celular; no entanto, notavelmente, revelou que os processos e vias afetados em células TH17 deficientes em GSDME estavam principalmente relacionados a genes que controlam o transporte transmembranar, em linha com os condutos formadores de poros formados por N-GSDME (Fig. 7b e Fig. Complementar 10) . Uma comparação transcriptômica unicelular de células TH17 individuais selecionadas para a presença versus ausência de expressão de GSDME apoiou a viabilidade de células TH17 que expressam GSDME pelo enriquecimento do conjunto de genes para proliferação (Fig. 7c). Finalmente validamos a resiliência de células TH17 humanas que expressam GSDME à piroptose, demonstrando a ausência de qualquer diferença na liberação de lactato desidrogenase (LDH) através de células TH17 editadas pelo gene CRISPR-Cas9, deficientes em GSDME e intactas com GSDME na estimulação de TCR (Fig. .7d). Em seguida, comparamos células IL-1 + e IL-1 – TH17 em relação à sua viabilidade e potencial de proliferação, porque as células TH17 não exibiram nenhuma expressão de superfície IL-1 em contraste com IL{{36 }}produzindo células de outras linhagens celulares, como monócitos (Extended Data Fig. 5d). Esta comparação de células IL-1 + e IL-1 – TH17 exigiu o estabelecimento de um ensaio caseiro de secreção de IL-1 -, permitindo o isolamento de células TH17 viáveis ​​de IL-1 + -por captura de células secretadas IL autócrino-1 para a superfície celular após estimulação com forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) e ionomicina. Não foi observada diferença na eficiência de clonagem de células TH17 que foram depositadas como células únicas após classificação quanto à presença ou ausência de IL de superfície-1 (Figura 11 Complementar). Esta descoberta excluiu diferenças na viabilidade e expansão das células IL-1 + e IL-1 - TH17 no nível de célula única. Nós ainda reclonamos clones TH17 que foram selecionados, com base em vários graus de expressão intracelular de IL -1, e monitoramos sua respectiva eficiência de clonagem. Se a liberação de IL-1 habilitada por GSDME estivesse associada à morte celular piroptótica, então uma correlação inversa entre a expressão de IL-1 em clones de células T e a frequência de clones em crescimento em sua reclonagem individual (eficiência de clonagem) seria seja esperado. No entanto, a eficiência da reclonagem de células T foi independente dos níveis de expressão de IL-1 nos clones de células TH17 e foi, em vez disso, semelhante à dos clones de células T de controle, selecionados com base em níveis variados de expressão de IFN- na ausência de Coexpressão IL-1 (Fig. 7e). É importante ressaltar que os clones de células IL-1 + TH17 continuaram a reexpressar IL-1 em ciclos repetitivos de reestimulação de TCR (Fig. 7f). Assim, foi excluída uma perda associada à morte celular de células produtoras de IL de sua respectiva população clonal de células T na reestimulação. Notavelmente, esta descoberta indica uma memória de citocinas de células T para IL indutível-1. Realizamos uma comparação transcriptômica entre IL-1 + e IL-1 – células TH17 e observamos um enriquecimento ainda maior para conjuntos de genes de proliferação em IL-1 + em comparação com IL-1 – célula TH17 clones (Fig. 7g). A comparação transcriptômica unicelular de células IL1A + versus IL1A-TH17 corroborou o enriquecimento transcriptômico para proliferação. Este também foi o caso da comparação do cluster 1 de Leiden, que foi enriquecido para células TH17 que expressam IL1A e assinaturas inflamatórias, com todos os outros clusters (Fig. 7h). As células IL-1 + TH17 exibiram maior expressão de Ki67 de acordo com a análise citométrica de fluxo do que suas contrapartes IL-1 após 5 dias de estimulação policlonal (Fig. 7i), novamente apoiando a ideia de que em células TH17 humanas IL{ {96}} a saída não está associada à morte celular, ao contrário das células inatas. Cumulativamente, esses dados excluem uma associação de produção de IL-1 com morte celular (piroptótica), mesmo no nível unicelular, e demonstram que as células T humanas têm uma memória de citocinas para a produção de IL-1 na reestimulação repetitiva de TCR .

IL derivada de células T-1 contribui para a defesa antifúngica do hospedeiro

Nossa descoberta de que as células TH17 humanas produzem o sinal de perigo inato IL -1 e reaproveitam o maquinário de sinalização inato para sua liberação extracelular confunde a distinção entre respostas imunes adaptativas e inatas e, assim, amplia o repertório funcional geral das células T. Uma característica crítica que permanece característica das respostas de memória adaptativa é a especificidade do antígeno dotada de TCR. Portanto, investigamos se a capacidade das células TH17 humanas de produzir IL-1 está restrita a especificidades específicas do antígeno. Foi demonstrado anteriormente que as células TH17 são altamente enriquecidas em células específicas para antígenos de C. albicans e Staphylococcus aureus . É interessante que tenhamos observado expressão e secreção significativamente maior de IL -1 por clones de células TH17 específicos de C. albicans do que por clones de células TH17 específicos de S. aureus (Fig. 8a). Em seguida, investigamos se as células T virgens que reconhecem C. albicans em vez de S. aureus seriam estimuladas pelo seu antígeno cognato para produzir seletivamente IL-1. Células TH virgens (CD45RA+ CCR7+) foram cocultivadas com monócitos autólogos pulsados ​​com antígenos de C. albicans ou S. aureus inativados pelo calor ou estimuladas policlonalmente com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 e depois clonadas no dia 7 com células alimentadoras alogênicas. Todos os clones foram reestimulados no dia 14 com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 durante 5 dias para ELISA dos seus sobrenadantes. Surpreendentemente, descobrimos que C. albicans, mas não S. aureus ou ativação policlonal de TCR, induziu a produção de novo de IL -1 em células TH17 de diferenciação humana (Fig. 8b). Nossa abordagem combinada de recall ex vivo e priming in vitro estabelece, portanto, que a capacidade de produzir IL-1 está confinada a células T com especificidade de TCR para C. albicans. Finalmente testamos se a capacidade distinta das células TH17 específicas de C. albicans de produzir IL-1 está associada a um papel fisiológico na defesa antifúngica do hospedeiro. Para isso, cocultivamos monócitos humanos com sobrenadantes de células TH17 humanas após sua reestimulação policlonal com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 por 5 dias. Observamos um aumento significativo da fagocitose de C. albicans marcada com FITC por monócitos usando citometria de fluxo. É importante ressaltar que o aumento da fagocitose de C. albicans pelos sobrenadantes de células TH17 foi dependente de IL-1, como mostrado pela anulação significativa da fagocitose de C. albicans se os sobrenadantes de células TH17 fossem desprovidos de IL-1 após imunoabsorção ou CRISPR-Cas{ Depleção de {46}}IL direcionada-1 em células TH17 (Fig. 8c). A imagem in vitro de células vivas corroborou ainda o aumento da captação e eliminação de C. albicans pelos monócitos na presença de sobrenadantes de células TH17 contendo IL -1 - (Fig. 8d, dados de vídeo). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que as células TH17 eliminam as infecções por C. albicans não apenas através da sua produção de IL-17, como se pensava anteriormente38, mas também, numa extensão significativa, através da capacidade de um subconjunto único de células TH17 para produzir IL-1 . Cumulativamente, as descobertas que identificam a formação de poros de GSDME em células T como uma estratégia de saída para IL pró-inflamatória-1 e a regulação de GSDME pelo eixo NLRP3 inflamassoma-caspase-8–caspase-3 revelam um novo modo de secreção de citocinas de células T que está associado a um subconjunto pró-inflamatório de células TH17 com especificidades antifúngicas de TCR. Isto fornece novos alvos terapêuticos para a modulação de células TH17 humanas que são relevantes para a defesa antifúngica do hospedeiro e também podem participar na patogénese de doenças inflamatórias crónicas.

cistanche tubulosa – melhora o sistema imunológico

Discussão

Em resumo, nossas descobertas revelam uma via biológica anteriormente desconhecida e uma modalidade de secreção de citocinas em células T humanas que diversifica a funcionalidade geral da população de células T. Descobrimos que a expressão de IL-1 estava exclusivamente confinada ao destino das células TH17, como evidenciado por sua coexpressão com IL-17A, regulação por ROR-t, indução pelas citocinas IL{{ 6}} e TGF- e pelo seu perfil de expressão do receptor de quimiocina associado a células TH17. Esses achados são consistentes com a existência de sítios de ligação para ROR-t e ROR- nas regiões intensificadoras e promotoras de IL1Α, conforme descrito no presente estudo, e com os sítios de ligação de ROR-t relatados anteriormente na região promotora de NLRP3 . Observamos ainda que as citocinas estimuladoras de células TH17 aumentaram a expressão de NLRP3 e GSDME. Consequentemente, os reguladores principais do destino das células TH17, tais como ROR e BATF, bem como múltiplos factores de transcrição indutíveis por TCR, exibiram sítios de ligação putativos nas regiões potenciadoras de GSDME. A polarização das células TH17 promoveu, portanto, não apenas a expressão de IL-1, mas também sua saída extracelular (Extended Data Fig. 10, resumo gráfico). Inesperadamente, descobrimos que o inflamassoma NLRP3 estava ativo e reaproveitado para a liberação de IL-1 em vez de IL-1 em células TH17 ativadas por TCR. Ao contrário das células inatas, as células T não são especializadas na detecção de perigo inata, que é conhecida por desencadear a montagem dos componentes do inflamassoma NLRP3. No entanto, foi demonstrado anteriormente que a elevação do Ca citoplasmático 2+ contorna a sinalização de perigo inata para a ativação do inflamassoma NLRP3 . Isto é consistente com a nossa descoberta de que a ativação do TCR, que é acompanhada pelo fluxo de cálcio, é um requisito para a liberação de IL -1 pelas células TH17 humanas. Observamos que as células TH17 engajaram uma cascata alternativa de sinalização downstream NLRP3 através do envolvimento da caspase -8. Isso pode ter sido facilitado pela ausência de clivagem de caspase -1 porque o recrutamento competitivo de caspase -1 versus caspase -8 inflamassoma foi demonstrado anteriormente . Também encontramos pró-caspase-1 e GSDMD não clivado em células TH17 humanas, mas nenhuma evidência de sua clivagem regulada pelo inflamassoma NLRP3 ou de produção de IL-1. A expressão de seus precursores levanta a questão de saber se a sinalização clássica do inflamassoma NLRP3 e a liberação de IL -1 também podem operar em células TH17 humanas se estímulos alternativos ainda a serem identificados forem aplicados. Isso implica que mecanismos contrarregulatórios dependentes de caspase-8- versus caspase-1-podem controlar uma dicotomia de produção de IL-1 versus IL-1 pelas células T, consolidando os papéis sugeridos anteriormente para o inflamassoma NLRP3 na liberação de IL-1 em células TH1 humanas42 e células TH17 murinas43. Uma observação intrigante do nosso estudo foi a identificação da expressão e clivagem de GSDME em células T. Isto revelou que a secreção não convencional de citocinas através dos poros da membrana pode ocorrer nas células T. Várias das funções recentemente atribuídas ao GSDME foram associadas à piroptose e subsequente aumento da morte de células tumorais e a um microambiente inflamatório 32,44. Surpreendentemente, descobrimos que as células TH17 que expressam GSDME exibiam viabilidade preservada e proliferação contínua na estimulação repetitiva de TCR em comparação com células T deficientes em GSDME. Os mesmos resultados foram observados para IL-1 + em comparação com IL-1 – células T. Essas descobertas foram inesperadas, considerando que a produção de IL -1 até agora tem sido considerada uma marca registrada da senescência e, portanto, de células com replicação interrompida ou morrendo . Isto evoca a ideia de que o sinal de perigo IL -1 pode fazer parte de uma memória de citocinas associada a células T que é reexcitável no reconhecimento do antígeno cognato . Além disso, os poros GSDME podem servir uma função fisiológica para permitir que as células TH17 liberem moléculas adicionais ainda não identificadas além da IL -1 que são definidas pelo seu tamanho ou carga . Isso seria consistente com os resultados de nossa comparação transcriptômica imparcial de células TH17 deficientes em GSDME, intactas com GSDME ou CRISPR-Cas, que revelaram múltiplas funções para GSDME no transporte transmembrana, mas não na morte celular. O mecanismo pelo qual a viabilidade e a memória de citocinas IL-1 de longo prazo em células T com poros GSDME são preservadas ainda precisa ser explorado no futuro. A disponibilidade de IL-1 de diferentes fontes celulares, particularmente de APCs inatas, levanta a questão sobre a contribuição relativa da IL derivada de células T-1 para a saúde e doenças humanas. Embora as células T IL-1 + constituam apenas um pequeno subconjunto dentro da linhagem de células T, sua capacidade de produzir IL-1 foi quantitativamente comparável à dos monócitos estimulados por LPS, apoiando o novo conceito de que as células T podem servir como fonte relevante de IL inflamatória-1 . Nossas descobertas de análises transcriptômicas e funcionais revelam que a IL{100}} está associada ao destino pró-inflamatório das células TH17. A subpopulação IL{102}} de células TH17 humanas exibiu assinaturas transcriptômicas de patogenicidade inflamatória aprimorada e associações com doenças inflamatórias crônicas. A expressão significativamente melhorada de IL-1 pelas células TH17 circulantes de pacientes com AIJ e sua localização abundante no líquido sinovial inflamado apoiam esse potencial patogênico do subconjunto IL-1 + de células TH17. Uma relação causal rigorosa entre células TH17{108}}produtoras de IL e a patogênese da AIJ ainda precisa ser estabelecida e o impacto relativo das células TH17{110}} de IL será validado em ensaios clínicos futuros. Uma observação surpreendente foi que a produção de IL-1 pelas células T está ligada à sua especificidade de TCR. Embora a produção de IL-1 por fontes celulares inatas seja desencadeada por estímulos de estresse inespecíficos, descobrimos que a produção de IL-1 por células TH17 humanas está associada a uma especificidade de TCR para C. albicans. Em vez disso, células TH17 específicas de S. aureus apresentaram produção significativamente reduzida de IL-1. Essas descobertas são consistentes com o requisito diferencial de IL-1 para a geração de células TH17 específicas de C. albicans, mas não de S. aureus, como relatado anteriormente4 e, consequentemente, com o papel crítico da IL{{126} } para a indução da expressão IL-1, conforme relatado aqui. Além disso, descobrimos que a secreção de IL-1 depende da estimulação do TCR e dos sinais de cálcio, enfatizando sua estreita associação com a sinalização imune adaptativa específica através do TCR. As células TH17 são conhecidas por serem as protagonistas na eliminação de infecções por C. albicans através da secreção de IL-17, o que é exemplificado pela disbiose por C. albicans em situações de deficiências genéticas ou terapêuticas de IL-1738. Descobrimos que o produto celular TH17 IL -1 está envolvido na depuração de C. albicans porque sua ausência nos sobrenadantes de células TH17 reduziu significativamente a fagocitose de C. albicans pelos monócitos. Isto sugere que as funções efetoras das células antifúngicas TH17 são exercidas não apenas através da IL-17A/F, como sugerido anteriormente, mas também através da IL-1 de maneira específica do TCR. Se a regulação aberrante da via molecular que leva à produção de IL -1 pelas células TH17 poderia predispor ao comprometimento da defesa antifúngica do hospedeiro, será necessário testar no futuro. Cumulativamente, nossas descobertas abrem caminho para uma investigação sistemática das contribuições das células TH17 produtoras de IL em diversas doenças inflamatórias e na defesa antifúngica do hospedeiro. O eixo TCR-NLRP3 inflamassoma-caspase-8-caspase-3-GSDME não apenas representa um modo anteriormente negligenciado de sinalização imunológica e instrução de destino em células TH, mas também fornece alvos moleculares para interromper uma célula TH17 patogênica identidade ou aproveitá-la para defesa do hospedeiro.

Figura 7|As células TH17 são resilientes à piroptose apesar dos poros da membrana plasmática GSDME.

Figura 8|A especificidade do TCR controla a produção de IL-1 contribuindo para a eliminação de C. albicans

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