A causa da doença renal crônica (DRC) - Anemia

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PARTE Ⅰ: A doença renal crônica proteinúrica está associada à alteração da vida útil dos glóbulos vermelhos, deformabilidade e metabolismo

Rosi Bissinger, Travis Nemkov & et al.

O desenvolvimento deanemiaé uma complicação típica de avançadodoença renal crônica(DRC) e está associada à qualidade de vida prejudicada¹e aumento do risco de eventos cardiovasculares²e internação,³assim como o declínio cognitivo.⁴A gravidade deanemiatem sido visto como um preditor independente de mortalidade em DRC dependente de diálise e não-diálise.doença renal crônica) pacientes.⁵A fisiopatologia da doença renal associadaanemiaé complexo e envolve deficiência de ferro e eritropoietina (EPO) no cenário de inflamação de baixo grau, que, por sua vez, compromete a eritropoiese normal na DRC.doença renal crônica) pacientes.⁶Na DRC avançada (doença renal crônica), a resposta da EPO é inadequadamente baixa em relação ao grau deanemia.^7,8 A alta prevalência de deficiência de ferro concomitante na DRC (doença renal crônica) é uma consequência do distúrbio da homeostase do ferro.⁹ Um mecanismo negligenciado de perda de ferro na DRC (doença renal crônica) é a proteinúria, que pode levar a perdas urinárias de ferro ligado à transferrina (até 0,3 mg/d) quando a proteinúria atinge a faixa nefrótica.¹⁰Outro fator que se acredita contribuir paraanemiaem CKD (doença renal crônica) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >60 anos atrás.^6,11,12

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Um estudo recente usando um teste respiratório com monóxido de carbono demonstrou que a expectativa de vida dos eritrócitos diminuiu progressivamente a partir de 120 dias em pacientes com DRC estágio 1.doença renal crônica) a 60 dias em pacientes com DRC estágio 5 (doença renal crônica).¹³ Notavelmente, a transfusão de hemácias alogênicas de doadores saudáveis ​​para DRC (doença renal crônica) foi seguido por rápida depuração de hemácias transfundidas sem evidência de hemólise.¹²Um mecanismo plausível para esta observação pode ser a estimulação da morte celular semelhante à apoptose em hemácias anucleadas, denotando um padrão de lesão em que a integridade da membrana celular não é comprometida e o conteúdo citoplasmático permanece intacto.¹⁴As hemácias que sofrem morte celular exibem várias alterações morfológicas resultantes de danos no citoesqueleto, como formação de bolhas na superfície, perda de elasticidade da membrana e/ou desidratação celular.¹⁵Em um nível molecular, a morte de eritrócitos está associada ao acúmulo intracelular de Ca2+, estado energético celular alterado e quebra da assimetria fosfolipídica, levando à externalização da fosfatidilserina (PS) na membrana plasmática externa.^15,16Como consequência, macrófagos e células dendríticas especializadas reconhecem rapidamente as hemácias externalizadas por PS, levando à fagocitose eritrose e seu catabolismo no baço e no fígado.¹⁷Por causa da fisiopatologia confusa dedoenca renal-associadoanemiaem humanos, estudos em animais são necessários para identificar os mecanismos contribuintes. Nefropatia induzida por doxorrubicina (DIN) em camundongos 129S1/SvImJ¹⁸e camundongos com deficiência induzível de podocina (Nphs2Dipod)¹⁹são 2 modelos caracterizados pela indução de proteinúria nefrótica em poucos dias, progressão para insuficiência renal após 3 semanas e morte em 6 a 7 semanas.^19–21Ambos os modelos de camundongos recapitulam efetivamente todos os estágios da DRC humana (doença renal crônica). No presente estudo, testamos se a insuficiência renal progressiva nesses camundongos com proteinúriadoenca renalafeta a vida útil das hemácias e contribui paraanemia. Paralelamente, examinamos o fenótipo RBC em sangue coletado de DRC (doença renal crônica) pacientes com proteinúria nefrótica.

CKD (doença renal crônica) eanemia: CISTANCHE

MÉTODOS

Informações detalhadas sobre os materiais e métodos são fornecidas nos Materiais e Métodos Suplementares.

Estudos com ratos

Os experimentos foram realizados em camundongos 129S1/SvImJ de tipo selvagem de 8-semanas de ambos os sexos (Charles River). A DIN foi induzida por uma única injeção de doxorrubicina (14,5 mg/g de peso corporal), conforme descrito anteriormente.^18,22Para controlar o efeito mielotóxico da doxorrubicina não relacionado ao desenvolvimento de nefropatia, camundongos C57BL/6 resistentes à doxorrubicina também foram submetidos ao mesmo protocolo de tratamento.²³ Além disso, experimentos semelhantes foram conduzidos em 8-camundongos de uma semana de idade com deleção induzível de podocina (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) ou camundongos Nphs2Dipod, que foram tratados com doxiciclina por 14 dias.¹⁹Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a Lei Alemã para o Bem-Estar dos Animais, com aprovação das autoridades locais (Regierungspräsidium Tübingen, números de aprovação M12/17 e M17/19G ). O desenho experimental dos estudos em camundongos é descrito na Figura Suplementar S1.

Pacientes

O estudo do paciente foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo comitê de ética local do Hospital Universitário de Tübingen (556/2018BO2). Amostras de sangue e urina com heparina de lítio foram obtidas de pacientes com proteinúria na faixa nefrótica e taxa de filtração glomerular preservada (TFG; estágios 1-2; n=10) e pacientes com TFG reduzida (DRC (doença renal crônica) estágio 3-5; n ¼ 15) no Hospital Universitário de Tübingen. Como grupo controle, o sangue de voluntários saudáveis ​​pareados por idade e sexo (n=25) foi fornecido pelo banco de sangue do Hospital Universitário de Tübingen. Todas as amostras humanas foram coletadas após consentimento informado. As características clínicas dos pacientes são indicadas emTabela 1.

Tabela 1|Características dos pacientes com DRC (doença renal crônica) e doadores de sangue saudáveis

Análises de citometria de fluxo

Diferentes parâmetros de morte celular de RBC foram determinados por citometria de colegas.¹⁴ Para determinar a vida útil das hemácias in vivo, 25 ml de corante de 5,6-diacetato de succinimidil éster de carboxifluoresceína [5(6)-CFDA, SE] foram injetados a uma concentração de 9,96 mM (solubilizado em dimetilsulfóxido) no retro-orbital plexo de 129S1/SvImJ de tipo selvagem e camundongos injetados com doxorrubicina, conforme descrito anteriormente.24 Nos pontos de tempo indicados, o sangue foi coletado do plexo retro-orbital dos camundongos e a porcentagem de 5(6)-CFDA, SE+ células foi detectada por análise de citometria de colegas. Finalmente, os dados foram analisados ​​usando o software FlowJo (FlowJo LLC).

Deformabilidade RBC e ektacitometria de gradiente osmótico

A deformabilidade RBC foi medida usando o Analisador de Célula Rotacional Óptica Assistida por Laser (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), que foi descrito em detalhes em outro lugar.²⁵As análises de ektacitometria de gradiente osmótico (cosmos can) também foram realizadas usando o LORCA Max Sis e medem a deformabilidade sob várias condições osmóticas.²⁶

Exame histológico

Para coloração de hematoxilina e eosina, baços e fêmures foram corados com hematoxilina e eosina. Todas as lâminas foram coradas com o anticorpo primário Ter119 (BD Pharmingen; diluição 1:500). Para coloração de ácido periódico-Schiff, fatias de 2.5-mm de espessura dorinsforam corados com ácido periódico – reagente de Schiff (Carl Roth) e hematoxilina (Abcam). A coloração de May-Grünwald-Giemsa (método de Pappenheim) foi realizada para determinar as mudanças na forma de RBC, conforme descrito anteriormente.²⁷ O isolamento de glomérulos foi feito usando uma abordagem de biotinilação e classificação de células.¹⁹Para detecção de proteína de podocina, foi aplicado um anticorpo da Sigma (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Carl Roth) foi usado para corar os núcleos.

Cromatografia líquida de ultra-alta performance-espectrometria de massa metabolômica de eritrócitos de camundongos

As análises foram realizadas conforme publicado anteriormente.²⁸Resumidamente, a plataforma analítica emprega um sistema de cromatografia líquida de ultra-alta performance Vanquish (Thermo Fisher Scientific) acoplado online a um espectrômetro de massa Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

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análise estatística

Os dados são fornecidos como média aritmética SEM ou como mediana com intervalo interquartil (percentil 25–75) com n representando o número de animais usados ​​ou pacientes incluídos, respectivamente. Os dados foram testados para normalidade com o teste de Kolmogorov-Smirnov, o teste de D'Agostino e o teste de Shapiro-Wilk. As variâncias foram analisadas pelo teste de Bartlett para variâncias iguais. O pós-teste de comparação múltipla de Tukey ou Dunn, o teste t de Student não pareado ou o teste U de Mann-Whitney foram realizados pelo GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P < 0,05="" com="" teste="" de="" cauda="" 2-="" foi="" considerado="" estatisticamente="" significativo.="" gráficos="" adicionais="" foram="" plotados="" através="" do="" graphpad="" prism="">

RESULTADOS

A doença renal proteinúrica experimental induzanemiaem camundongos Após a indução, camundongos 129S1/SvImJ com camundongos DIN e Nphs2Dipod desenvolveram proteinúria na faixa nefrótica (Figura 1a e Figura Suplementar S2C) e insuficiência renal progressiva caracterizada por altos níveis de uréia no plasma a partir do dia 20 (Figura 1b e Figura Suplementar S2D). Durante os primeiros 10 dias, os camundongos experimentaram ganho de peso corporal com ascite (Figura 1c e Figura Suplementar S2E), refletindo a retenção de sódio causada pela excreção de serina proteases ou proteinúria.¹⁸Após a reversão espontânea da retenção de sódio, esses camundongos perderam peso de forma constante. Em camundongos com DIN e em camundongos Nphs2Dipod, imagens de microscopia de luz, capturadas após 10 dias, revelaram alterações histomorfológicas típicas consistentes com esclerose glomerular segmentar focal (Figura 1d e Figura Suplementar S2B). Estes estavam ausentes em camundongos C57BL/6 injetados com doxorrubicina (Figura 1d). O tratamento com doxorrubicina induziu um forte declínio na hemoglobina, contagem de hemácias e hematócrito (Figura 1e-g) a partir do dia 10 em camundongos 129S1/SvImJ e C57BL/6, que neste último foram normalizados nos dias 20 e 30. Em contraste, em dias 20 e 30, 129S1/SvImJ injetado com doxorrubicina e camundongos deficientes em podocina desenvolveramanemia, caracterizada por volume corpuscular médio reduzido (Figura 1h) e hemoglobina reduzida (Figura complementar S2F), sugerindo queanemiaestá associado à insuficiência renal progressiva e não ao tratamento com doxorrubicina.

Figura 1|Função renal e anemia evidente em camundongos 129S1/SvImJ injetados com doxorrubicina.(a–d) camundongos 129S1/SvImJ injetados com doxorrubicina desenvolveram (a) proteinúria alta, (b) aumento progressivo da concentração de uréia plasmática, (c) aumento transitório do peso corporal e (d) alterações histomorfológicas típicas indicativas de esclerose glomerular segmentar focal no dia 10 (coloração ácido periódico-Schiff; barra ¼ 10 mm). (e–h) Além disso, esses camundongos desenvolveramanemiarefletido por (e) um nível de hemoglobina diminuído, (f) números mais baixos de glóbulos vermelhos (RBC), (g) níveis de hematócrito diminuídos e (h) volume corpuscular médio diminuído. (a–d) Camundongos C57BL/6 injetados com doxorrubicina não mostraram nenhum sinal de lesão renal, e (e–g)anemiano dia 10 foi normalizado nos dias 20 e 30. Aritmética significa SEM são mostrados. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="">< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

A anemia na doença renal proteinúrica experimental não é causada pelo comprometimento da eritropoiese

Ambos os modelos de camundongos anêmicos apresentaram um aumento significativo na porcentagem de reticulócitos circulantes (Figura 2a e Figura Suplementar S3C). As concentrações plasmáticas de EPO foram dramaticamente aumentadas no dia 10 em 129S1/SvImJ com DIN e camundongos C57BL/6 saudáveis, mas foram normalizadas novamente nos dias 20 e 30 (Figura 2b). Em camundongos deficientes em podocina, as concentrações plasmáticas de EPO aumentaram no dia 10 e permaneceram aumentadas nos dias 20 e 30 (Figura Suplementar S2H). Em análises histológicas da medula óssea e do baço, o número de células precursoras eritroides em comparação com precursores mieloides foi aumentado no dia 30 (Figura 2d-g), apontando para eritropoiese estimulada em camundongos 129S1/SvImJ anêmicos com DIN.

Figura 2|A eritropoiese é estimulada em camundongos 129S1/SvImJ injetados com doxorrubicina com anemia. (a) Anemiaem camundongos 129S1/SvImJ injetados com doxorrubicina ocorreu apesar do aumento do número de reticulócitos nos dias 2{{30}} e 30. (b) A concentração plasmática de eritropoietina foi altamente aumentada no dia 10 em camundongos 129S1/SvImJ e C57BL/6 injetados com doxorrubicina, mas foi normalizada novamente nos dias 20 e 30. (c–e) Quantificação dos números absolutos de (c) células mielóides e (d) células eritróides na medula óssea. A (e) proporção de células mieloides para células eritroides em camundongos 129S1/SvImJ saudáveis ​​e injetados com doxorrubicina na medula óssea mostrou um número maior de células precursoras eritroides em camundongos 129S1/SvImJ injetados com doxorrubicina no dia 3{{5{{52 }}}}. (f,g) A histologia (f) do baço e (g) da medula óssea mostrou um aumento nas células precursoras eritróides, observado mesmo em ampliações menores, em camundongos 129S1/SvImJ injetados com doxorrubicina (painéis da direita) em comparação com camundongos saudáveis ​​(painéis da esquerda ) no dia 30. (f,g) A imuno-histoquímica Ter119 (painéis inferiores) apoiou os achados de hematoxilina e eosina (H&E). Ter119 é positivo nos precursores eritróides (células nucleadas) e nos glóbulos vermelhos (células não nucleadas). Barra ¼ 100 mm; inserções ¼ 25 mm. Aritmética significa SEM são mostrados. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" e="" ***p="">< 0,001="" indicam="" diferença="" significativa="" entre="" camundongos="" 129s1/svimj="" saudáveis="" ​​e="" 129s1/svimj="" injetados="" com="" doxorrubicina;="" ##p="">< 0,01="" e="" ####="" p="">< 0,0001="" indicam="" diferença="" significativa="" em="" relação="" à="" linha="" de="" base="" de="" camundongos="" 129s1/svimj="" injetados="" com="" doxorrubicina;="" e="" §p="">< 0,05,="" §§p="">< 0,01="" e="" §§§§p="">< 0,0001="" indicam="" diferença="" significativa="" entre="" camundongos="" 129s1/svimj="" injetados="" com="" doxorrubicina="" e="" c57bl/6="" injetados="" com="">

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A redução da expectativa de vida dos eritrócitos é a principal causa de anemia na doença renal proteinúrica experimental

A externalização do PS no folheto externo da membrana plasmática das hemácias é um indicador de morte celular e um promotor da eritrofagocitose.¹⁴A morte celular de RBC foi quantificada usando análises de classificação de células ativadas por fluorescência de PS de superfície fluorescente ligada a anexina V.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}} vezes maior no dia 20 em camundongos com DIN (4,16 por cento e 0.86 por cento ) em comparação com camundongos saudáveis ​​(1.{{7 }} por cento & 0,11 por cento ) (Figura 3a). Da mesma forma, camundongos Nphs2Dipod mostraram um aumento aproximado de 2-vezes na exposição ao PS (1,27 por cento e 0,20 por cento) em comparação com camundongos saudáveis ​​(0,58 por cento e 0,05 por cento) no dia 30 (Figura complementar S3A). Sabe-se que as hemácias são eliminadas da circulação por macrófagos que residem no baço.17 Essa observação pode, portanto, explicar a maior razão baço/peso corporal de camundongos Nphs2Dipod (Figura complementar S2G), em que duas vezes mais hemácias são degradadas em comparação com as saudáveis camundongos C57BL/6. Como a proteinúria na faixa nefrótica leva à disproteinemia,29 investigamos ainda se a morte celular aumentada de eritrócitos pode ser estimulada por um componente no plasma de camundongos com DIN. Conforme ilustrado na Figura 3b, a exposição PS nos dias 10 e 20 foi duas vezes maior após a incubação (30 minutos a 37^OC) de hemácias saudáveis ​​no plasma de camundongos 129S1/SvImJ injetados com doxorrubicina em comparação com a incubação no plasma de camundongos saudáveis. Influxo de Ca2+ nos eritrócitos, mediado por canais de cátions não seletivos dependentes de voltagem e dependentes de voltagem,^30,31é um dos principais reguladores da morte celular de RBC. Nas hemácias coletadas nos dias 20 e 30 de camundongos 129S1/SvImJ com DIN, as concentrações intracelulares de Ca2+ foram aumentadas (Figura 3c); este fenômeno foi recapitulado em camundongos Nphs2Dipod no dia 20 (Figura complementar S3B). Em ambos os modelos de camundongos, houve uma correlação negativa significativa da porcentagem de hemácias positivas para PS, com a gravidade daanemiarefletido pelos níveis de hemoglobina (Figura 3d e Figura Suplementar S3D). Além disso, houve uma correlação significativa com o dano renal refletido pela concentração plasmática de uréia (Figura 3e e Figura Suplementar S3E) e em menor grau com proteinúria (Figura 3f e Figura Suplementar S3F). Para compensar a perda de RBC emanemia, a formação de novas hemácias foi estimulada em ambos os camundongos, conforme indicado pelo aumento da porcentagem de reticulócitos circulantes, e foi significativamente correlacionada com a magnitude de PS expondo hemácias (Figura 3g e Figura Suplementar S3G).

Figura 3|Camundongos com nefropatia induzida por doxorrubicina desenvolvem morte aumentada de glóbulos vermelhos (RBC) mediada por níveis aumentados de cálcio intracelular.(a) A externalização de fosfatidilserina (PS), refletindo a morte de RBC, foi aumentada nos dias 20 e 30 após a indução de nefropatia induzida por doxorrubicina. (b) A incubação de eritrócitos saudáveis ​​no plasma retirado nos dias 10 e 20 desses camundongos levou à externalização de PS. (c) A externalização de PS foi acompanhada por níveis aumentados de cálcio intracelular de eritrócitos obtidos nos dias 20 e 3{{30}} após a indução. (d–g) A (d) porcentagem de hemácias expostas a PS foi correlacionada com os níveis de hemoglobina, dano renal indicado por (e) concentração de uréia plasmática e (f) proteinúria, bem como com (g) formação de reticulócitos. (d–g) Os dados incluem cada ponto de tempo (0, 10, 20 e 30 dias) de cada camundongo 129S1/SvImJ e 129S1/SvImJ saudável com nefropatia induzida por doxorrubicina. Aritmética significa SEM são mostrados. **P < 0,01,="" ***p="">< 0,001="" e="" ****p="">< 0,0001="" indicam="" diferença="" significativa="" entre="" camundongos="" 129s1/svimj="" saudáveis="" ​​e="" injetados="" com="" doxorrubicina="" (pol.)="" 129s1/svimj;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" e="" ####p="">< 0,0001="" indicam="" diferença="" significativa="" em="" relação="" à="" linha="" de="" base="" de="" camundongos="" 129s1/svimj="" injetados="" com="" doxorrubicina;="" e="" §§§§p="">< 0,0001="" indicam="" diferença="" significativa="" entre="" camundongos="" 129s1/svimj="" injetados="" com="" doxorrubicina="" e="" c57bl/6="" injetados="" com="" doxorrubicina.="" crea,="" creatinina;="" mfi,="" intensidade="" de="" fluorescência="">

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