Efeitos hepatoprotetores da quitosana na toxicidade hepática induzida por tioacetamida em ratos albinos machos

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Abstrato: A quitosana, um produto natural derivado da quitina, tem atraído muita atenção como um composto polissacarídeo promissor, devido às suas atividades biológicas únicas. Este estudo foi desenhado para explorar o possível potencial de melhoria da quitosana, como um produto natural marinho, emregeneração do fígadona hepatotoxicidade induzida por tioacetamida em ratos albinos machos. Cinquenta animais foram divididos em 5 grupos, incluindo o grupo controle; um grupo que foi injetado intraperitonealmente com uma dose única de tioacetamida (300 mg/kg b.wt) para indução de toxicidade hepática; um grupo que recebeu uma dieta contendo 5% de quitosana por 14 dias; um grupo recebeu uma dieta contendo 5 por cento de quitosana por 14 dias, então eles foram injetados com tioacetamida (300 mg/kg peso corporal) uma vez, e o último grupo que foi injetado com tioacetamida (300 mg/kg peso corporal) uma vez recebeu uma dieta contendo 5 por cento de quitosana por 14 dias. Os resultados bioquímicos revelaram que a ingestão de quitosana antes ou após a intoxicação por tioacetamida melhorou marcadores hepáticos (ALAT, ASAT, GGT, ALP, albumina) e funções renais, e também TNF- plasmático. A análise de QRT-PCR revelou que a expressão gênica quantitativa de TNF-, survivina e c-Myc hepáticos de quitosana. Além disso, a quitosana melhorou o quadro histológico do fígado. Este estudo indicou a ação promissora da quitosana na regeneração hepática.

Palavras-chave: tioacetamida; quitosana; regeneração hepática; survivina; c-myc; fator de necrose tumoral- .

1. Introdução

Doenças do fígadosão as doenças que mais ameaçam a vida em todo o mundo, especialmente no Egito [1]. No Egito, as doenças hepáticas são a principal causa de mortes anuais [2, 3]. O fígado é muito suscetível à toxicidade devido ao seu papel no metabolismo da maioria dos xenobióticos, como drogas e compostos estranhos. Felizmente, a proliferação celular pode ajudar o fígado a se regenerar após grande perda celular [4,5]. Consequentemente, tratamentos alternativos são demandas essenciais para substituir ou serem usados ​​em paralelo com os esquemas atuais. A quitosana é um composto polissacarídeo natural promissor. Pode ser obtido a partir de resíduos de casca de caranguejo, camarão e lagosta e da parede celular do fungo.

A quitosana é uma boa fonte de fibra dietética [6,7]. Tem inúmeros benefícios para a saúde, como regulação da imunidade, atividade antitumoral, proteção hepática, antidiabética e antioxidante [8]. antibacteriano, hipolipemiante, anti-inflamatório [9], atividades de cicatrização de feridas [10,11] e efeito hepatoprotetor [12I. Ser não tóxico e ter grande biodegradabilidade fazem grandes vantagens para a quitosana ser usada no gerenciamento do estresse oxidativo [13].

Alimentos contaminados e exposição a substâncias químicas ou ambientais no trabalho são possíveis fontes de compostos tóxicos. Desses compostos tóxicos está a tioacetamida (TAA), um composto contendo enxofre amplamente utilizado encontrado no meio ambiente como compostos orgânicos de enxofre e utilizado em muitas aplicações técnicas [14]. Além disso, é usado para induzir fibrose hepática em ratos para estudar o efeito terapêutico de drogas antifibróticas [15]. Normalmente, o TAA tem como alvo o fígado e, portanto, induz lesão hepática pela produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) [16,17]. O grupo tiossulfato do TAA é submetido a metabolismo adicional através do sistema oxidase para formar acetamida e TAA-S-óxido [18]. Depois disso. O dióxido de TAA-S é formado, que se liga covalentemente às macromoléculas do fígado e inicia a lesão hepática. Essa lesão se dá na forma de necrose centrolobular [19] e de formação de EROs, que juntas causam morte celular por estresse oxidativo [10,20]. Como uma única dose de TAA causa degeneração dos hepatócitos, infiltração de células inflamatórias e eleva o nível de ALP, ALT e AST [21].

A apoptose é um mecanismo de morte celular que ocorre normalmente e é usado para desenvolver e manter tecidos saudáveis. Muitas doenças podem ser desenvolvidas devido à apoptose desregulada, como câncer, distúrbios neurodegenerativos e doenças de imunodeficiência. Curiosamente, a própria apoptose pode estimular a proliferação celular e a regeneração tecidual em um mecanismo conhecido como proliferação induzida por apoptose. Além disso, o processo apoptótico pode ser bloqueado por um grupo de proteínas da família conhecido como um inibidor de proteínas de apoptose (IAPs) pela inibição da atividade da caspase. Existem oito membros identificados da família IAP no genoma dos mamíferos [23]. A proteína mais importante desta família é a survivina, o menor membro desta família. Ele é codificado pelo gene BIRC5 localizado no cromossomo 17 na banda 17q25.3.c-myc proteína foi encontrada altamente aumentada no processo de regeneração do fígado [24-26]. TNF- poderia funcionar por dois mecanismos opostos. Poderia atuar como um iniciador da morte celular; alternativamente, poderia aumentar a proliferação celular. Consequentemente, desempenha um papel importante na fisiopatologia das hepatites virais e das doenças hepáticas alcoólicas e não alcoólicas [27,28].

O presente estudo investigou a potência da quitosana no aumento da regeneração tecidual contra a toxicidade hepática induzida por TAA em ratos. O efeito da quitosana nas funções hepáticas e renais foi estudado. Além disso, foram feitas as dosagens da citocina pró-inflamatória TNF- no plasma e a análise quantitativa dos níveis de expressão gênica do tecido hepático da survivina, dos genes c-Myc e do TNF-. Além disso, a característica histológica do fígado foi examinada.

Cistanchepode ajustar a ultraestrutura das células do fígado, promover a síntese de proteínas e proteger o fígado.Glicosídeos totais de feniletanolpode aumentar a quantidade de glicogênio hepático,echinacosidepode melhorar a atividade da grama, e o verbascoside pode eliminar os radicais livres e reduzir a apoptose das células-tronco. Cistanche também pode regular o sistema circulatório e ter os seguintes efeitos: proteger o miocárdio isquêmico; reduzem os lipídios do sangue, resistem à aterosclerose e resistem à trombose; reduzir a resistência vascular periférica, dilatar os vasos sanguíneos periféricos e baixar a pressão arterial; proteger o fígado e resistir ao fígado gordo.

2. Materiais e métodos

2.1. Produtos Químicos.

O TAA foi adquirido da Aldrich Chem Co., Inglaterra, como cristais puros; foi dissolvido em solução salina e preparado de fresco antes de cada injecção.

A quitosana (CS) foi obtida da Sigma-Aldrich (peso molecular =100 KDa). A quitosana, um importante polissacarídeo de origem marinha, é preparada a partir de conchas de crustáceos e está sendo utilizada como uma nova fonte de fibra alimentar no desenvolvimento de medicamentos devido à sua segurança intrínseca quando ingerida por via oral [29].

2.2. Desenho experimental.

Cinquenta ratos albinos Wistar machos adultos pesando aproximadamente 120-150 g foram obtidos da Animal House Colony do National Research Centre, Cairo, Egito. Os animais foram mantidos em gaiolas de aço inoxidável em condições laboratoriais padrão com boa ventilação e ciclo claro-escuro de 12-horas, com umidade relativa de 60 ± 5 por cento, com livre acesso a ração comercial padrão de laboratório e água da torneira.

Antes do início do protocolo experimental, os ratos foram adaptados às condições experimentais por 2 semanas. O cuidado humano foi aplicado de acordo com os critérios da instituição padrão para o cuidado e uso de animais experimentais de acordo com o método confirmado pelo Comitê de Ética do Centro Nacional de Pesquisa (FWA 00014747), que segue as recomendações do National Institutes of Health Guide for Care and Use of Animals in Laboratory (publicação nº 85-23, revisada em 1985).

Os animais foram divididos em cinco grupos após o período de aclimatação (10 ratos cada) da seguinte forma:

Grupo (1): animais normais e saudáveis ​​serviram como grupo controle.

Grupo (2): (TAA) grupo em que os ratos foram injetados intraperitonealmente com TAA (dissolvido em 0,9 por cento de solução salina normal) em dose única (300 mg/kg pc) de acordo com Mustafa et al. [30] para indução de toxicidade hepática.

Grupo (3): grupo quitosana no qual os animais foram alimentados com dieta basal mista de quitosana na proporção de 5 por cento (50g mais 950g de dieta basal) de acordo com AboZaid et al. [9] por 14 dias.

Grupo (4): quitosana e depois grupo TAA em que os animais receberam uma dieta contendo 5 por cento de quitosana 9] por 14 dias e então injetado intraperitonealmente com uma dose única de TAA (300 mg/kg pc) como mencionado acima.

Grupo(5): TAA e depois quitosana grupo no qual os animais foram injetados intraperitonealmente com dose única de TAA (300 mg/kgb.w) como mencionado acima, então alimentados com uma dieta contendo 5 por cento de quitosana por 14 dias.

O peso corporal de cada animal foi registrado a cada semana e no final do experimento para monitorar a mudança de peso corporal. Ao final do período experimental, os animais permaneceram em jejum de 12 horas. Em seguida, foram anestesiados por inalação de éter dietílico; amostras de sangue foram retiradas do plexo venoso retro-orbital em tubos de centrifugação utilizando capilares de vidro estéreis heparinizados.

Para a separação do plasma, uma parte de todas as amostras de sangue foi montada em EDTA, a outra parte foi montada em um tubo isento de anticoagulantes para a separação do soro. Ambas as amostras de soro e plasma foram separadas usando centrifugação a frio a 3000 rpm por 15 minutos a 4 graus. Alíquotas de plasma e soro foram preservadas em -20 grau para análise bioquímica.

Assim que o sangue é coletado, os animais foram sacrificados por decapitação cervical

O fígado de cada rato foi removido e cuidadosamente lavado com solução salina isotônica, seco e dividido em duas seções; a primeira seção foi congelada diretamente em nitrogênio líquido e preservada em -80 grau antes do isolamento de RNA para análise de expressão gênica. Em contrapartida, a segunda porção foi fixada em solução salina (10 por cento ) para ser utilizada no exame histopatológico.

2.3.Análise bioquímica.

Atividades séricas de aspartato aminotransferase (ASAT), alanina aminotransferase (ALAT), fosfatase alcalina (ALP) e gama-glutamil transferase (GGT), bem como albumina

os níveis de ureia e creatinina foram estimados espectrofotometricamente usando kits de reagentes adquiridos da bio-diagnostic Co., Egito. A concentração do fator de necrose tumoral do plasma alfa (TNF-a) foi estimada através da técnica de ELISA usando um kit TNF-ELISA de rato adquirido da Glory Science Co., Ltd., EUA.

2.4. Análise de expressão gênica.

Utilizando uma análise quantitativa (PCR em tempo real), a expressão dos genes survivina, c-Myc e TNF- foi determinada em amostras de tecido hepático.

2.4.1. Isolamento de RNA, limpeza e RT-PCR quantitativo em tempo real.

O RNA foi isolado de uma amostra de tecido hepático de 100 mg por tampão Qiazol (Qiagen, EUA); O RNA foi posteriormente limpo com o kit RNAeasy Mini (Qiagen, EUA); O RNA foi transcrito reverso e o cDNA resultante foi então amplificado. -actina, survivina, c-myc e os números de cópias dos genes TNF-alfa foram quantificados usando o kit QuantiFast Sybergreen RT-PCR (Qiagen, EUA). Todas as amostras foram executadas em triplicado, e os números de cópias foram normalizados para 100,000 cópias do gene housekeeping beta-actina. As sequências de primers estão listadas na Tabela 1. A RT e as condições de ciclagem de PCR subsequentes foram as seguintes, 50 graus por 10 min, 95 graus por 5 min, 95 graus por 15s, depois 60 graus por 30 s, o número de ciclos foi de 40 ciclos . O termociclador em tempo real MiniOpticonTM Bio-Rad foi usado para a quantização da expressão gênica.

2.5. Exame histopatológico.

Após a fixação dos tecidos hepáticos em solução salina a 10% por vinte e quatro horas, as amostras de tecido foram lavadas em água corrente; em seguida, submetido a desidratação usando etil (diluições em série para cima para etil absoluto). As amostras foram clarificadas em xileno e incluídas em parafina a 56 graus num forno de ar quente durante 24 horas. Os blocos de cera-tecido foram preparados para seccionamento em 4 mícrons de espessura por micrótomo de lodo. Os cortes foram desparafinizados, corados por hematoxilina e eosina e, finalmente, investigados em microscópio de luz elétrica [31].

2.6. Análise estatística.

Os dados foram analisados ​​usando a versão 13 do pacote estatístico computadorizado para ciências sociais. Os resultados são expressos como média ± SD de três experimentos independentes. A significância estatística da diferença foi determinada usando análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida de teste de comparações post hoc de LSD em p menor ou igual a 0.05, que foi definido como estatisticamente significativo.

3. Resultados e Discussões

3.1.Resultados.

Os dados apresentados na Figura 1 mostraram que o ganho de peso corporal do grupo de animais intoxicados com TAA foi significativamente diminuído (-308,5 por cento), enquanto o do grupo apenas de quitosana mostrou mudança significativa (50 por cento) quando ambos os grupos foram comparado ao grupo controle. Curiosamente, o grupo de animais com quitosana e TAA mostrou um aumento significativo (289,7%) no ganho de peso corporal; da mesma forma, o grupo de animais TAA e quitosana apresentou um aumento significativo (239,56 por cento) no ganho de peso corporal quando ambos os grupos foram comparados com o grupo de animais intoxicados por TAA.

Em relação aos testes de função hepática, alimentar ratos normais com uma dieta de 5% de quitosana-basal por 14 dias não alterou os testes de função hepática ou renal refletindo seu efeito seguro naquela concentração na dieta; ao contrário, a toxicidade hepática induzida por TAA em ratos aumentou significativamente (94,47 por cento) a atividade da aspartato aminotransferase sérica (ASAT) em comparação com o grupo controle. No entanto, uma diminuição significativa (-32 por cento e-15,4 por cento) na atividade sérica de ASAT foi registrada em ambos os regimes alimentados com quitosana (grupos quitosana-TAA e TAA-quitosana, respectivamente) em comparação com o Grupo intoxicado com TAA. Um aumento significativo (91,89 por cento) na atividade da alanina aminotransferase (ALAT) sérica foi registrado no grupo TAA em comparação com o grupo controle. Em um efeito promissor, os grupos quitosana, em seguida, TAA e TAA, em seguida, quitosana levaram a uma diminuição significativa (-40,8 por cento e 32,3 por cento, respectivamente) na atividade sérica (ALAT) em comparação com o grupo TAA. Da mesma forma, um aumento significativo (232,9 por cento) na atividade da fosfatase alcalina sérica (ALP) foi detectado no grupo de animais intoxicados com TAA em comparação com o grupo controle. Favoravelmente, alimentar ratos com uma dieta mista de quitosana por 14 dias antes da intoxicação com TAA resultou em uma diminuição significativa (-54,06 por cento) na atividade sérica de ALP; também, uma redução significativa (-50,6 por cento) na atividade sérica de ALP foi registrada no grupo de animais que receberam dieta mista de quitosana pós-intoxicação com TAA quando ambos os grupos de animais foram comparados com o grupo tratado apenas com TAA.

Com relação à atividade da gama sérica Glutamiltransferase (GGT), a toxicidade hepática induzida por TAA aumentou significativamente (223,5 por cento) a atividade da GGT sérica, enquanto o grupo de animais tratados apenas com quitosana não deteriorou sua atividade quando ambos os grupos foram comparados com aquele. do grupo controle. Curiosamente, alimentar animais com uma dieta mista de quitosana antes

A intoxicação por TAA mostrou uma redução significativa (-50,28 por cento) na atividade sérica de GGT; da mesma forma, uma diminuição significativa (-41.0 por cento o) na atividade da GGT foi observada no grupo de animais que se intoxicaram com TAA antes de serem alimentados com uma dieta mista de quitosana quando ambos foram comparados com o TAA- grupo intoxicado. O nível de albumina sérica foi significativamente diminuído (-36,58 por cento) após a injeção de TAA (grupo TAA), enquanto o grupo de quitosana revelou alteração insignificante (2,4 por cento o) no nível de albumina sérica quando ambos os grupos foram comparados com o grupo controle . No entanto, a alimentação dos animais com quitosana em diferentes regimes, antes ou após a intoxicação com TAA, revelou uma elevação significativa (50 por cento e 38,4 por cento, respectivamente) nos níveis de albumina sérica quando ambos foram comparados com o grupo TAA (Tabela 2).

Com relação aos testes de função renal (Tabela 2), um aumento significativo (82,67 por cento e 232,77 por cento) foi observado nos níveis séricos de uréia e creatinina, respectivamente, no grupo intoxicado com TAA; enquanto isso, o grupo tratado apenas com quitosana apresentou alteração insignificante (19,3 por cento e-15 por cento, respectivamente) quando ambos os grupos foram comparados com o grupo controle. De forma promissora, o grupo de animais quitosana e depois TAA apresentou uma diminuição significativa (-36,04 por cento e -45,2 por cento ) nos níveis séricos de uréia e creatinina, respectivamente, quando comparado com o grupo TAA . Além disso, a alimentação dos ratos em uma dieta mista de quitosana por 14 dias após a intoxicação por TAA ilustrou uma diminuição significativa (-30,6 por cento e-35,10 por cento) nos níveis séricos de uréia e creatinina, respectivamente quando ambos os grupos foram comparados com o grupo de animais tratados com TAA.

Conforme ilustrado na figura (2), uma elevação significativa (98,26 por cento) foi registrada no nível do fator de necrose tumoral alfa(TNF-) do grupo de animais intoxicados com TAA; enquanto o grupo quitosana apresentou alteração insignificante (-2,6 por cento) no nível plasmático de TNF- quando ambos os grupos de animais foram comparados com o grupo controle. De uma forma favorita, alimentar os animais com uma dieta mista de quitosana em diferentes regimes, antes ou após a intoxicação por TAA, revelou uma diminuição significativa (-36,6 por cento e -31,57 por cento, respectivamente) no nível plasmático de TNF- quando ambos foram comparados com o grupo TAA.

3.1.1. Expressão genetica.

Conforme ilustrado na Figura 3, o grupo de animais intoxicados com TAA mostrou uma redução significativa (-81 por cento) na expressão do gene do fígado de survivina, enquanto o grupo de quitosana sozinho realizou alterações insignificantes na expressão do gene do fígado de survivina quando ambos os grupos foram comparados com o grupo controle. Infelizmente, tanto quitosana, então TAA, e TAA, então grupos de animais tratados com quitosana não mostraram nenhuma mudança marcante (1,27 por cento e -3,2. por cento, respectivamente) na expressão desse gene em comparação com os animais intoxicados com TAA grupo de animais.

Em relação à expressão do gene c-myc, o grupo somente quitosana apresentou uma elevação significativa (400 por cento). No entanto, o grupo de animais intoxicados com TAA não afetou (0,0 por cento) a expressão desse gene quando ambos os grupos foram comparados ao grupo controle. Além disso, ambos os grupos quitosana, depois TAA e TAA, depois quitosana mostraram um aumento significativo (300 por cento e 700 por cento, respectivamente) nos níveis de expressão do gene c-myc em comparação com o grupo TAA (Figura 4).

Os dados revelaram que o grupo de animais tratados com quitosana registrou apenas uma elevação acentuada (73,33 por cento) no nível de expressão do gene TNF hepático; além disso, o grupo de animais intoxicados com TAA apresentou uma elevação significativa (368,3 por cento) quando comparados os dois grupos com o grupo controle. Essa elevação foi reduzida significativamente (-66,5 por cento e-57,3 por cento, respectivamente) com o tratamento com quitosana, antes ou após a intoxicação com TAA, em comparação com o grupo de animais TAA (Figura 5).

3.1.2. Achado histológico.

O grupo controle normal apresentou arquitetura de tecido hepático normal com veia central normal, trato portal preservado com mínimainflamatórioe principalmente hepatócitos normais (Figura 6). Enquanto isso, as investigações do grupo TAA revelaram deteriorações hepáticas representadas por hepatócitos vacuolados, veia central dilatada congestionada, trato portal dilatado e congestionado e células inflamatórias dispersas moderadas (Figura 7). Os grupos de drogas quitosana demonstraram arquitetura de tecido hepático normal com um trato portal ligeiramente dilatado, central, normal com células inflamatórias mínimas e hepatócitos normais (Figura 8). O grupo quitosana e depois TAA revelou veia central dilatada distorcida, células inflamatórias dispersas e espaços sinusoidais dilatados e congestionados, degeneração acentuada dos hepatócitos com alterações gordurosas e aumento da espessura dos hepatócitos (mais de 2 células de espessura) (Figura 9). Além disso, o grupo TAA e quitosana demonstrou células inflamatórias dispersas na veia central dilatada e congestionada, trato portal congesto dilatado marcado e hepatócitos degenerados dispersos (Figura 10).

3.2.Discussão.

O fígado representa a maior glândula do corpo, onde controla muitos processos biológicos que requerem energia, como metabolismo, biossíntese, excreção, secreção e desintoxicação. Essas grandes demandas de energia tornam o fígado um tecido altamente dependente de oxigênio. Após uma perda celular maciça, a proliferação celular ajuda na regeneração do fígado. No entanto, a regeneração pode falhar se a perda exceder certos limites, resultando em insuficiência hepática e, finalmente, morte 32].

Muitos estudos foram realizados para testar os efeitos dos antioxidantes na melhora de doenças hepáticas e no suporte ao fígado normal. Os antioxidantes surgiram como uma opção terapêutica para o tratamento e prevenção de doenças relacionadas ao estilo de vida. No entanto, necessita de mais estudos para elucidar seu modo de ação 33,34]. A quitosana (CS) é um valioso polissacarídeo marinho obtido das conchas de alguns crustáceos. Tem muitos benefícios biológicos bem estabelecidos, como regulação da imunidade, antitumoral, proteção do fígado, antidiabético, antibacteriano, antioxidante, anti-obesidade, ações de cicatrização de feridas e efeito hipolipidêmico [5].

O presente estudo investigou a eficácia protetora e terapêutica da quitosana no aumento da regeneração tecidual na toxicidade hepática induzida por TAA em ratos. TAA é tradicionalmente usado para induzir lesão hepática em modelos animais experimentais [15,35]. O efeito tóxico do TAA é devido aos seus metabólitos como acetamida, sulfato e componentes derivados de sulfóxido. Este metabólito causa deformações estruturais das proteínas estruturais e enzimas, resultando em sua inativação. Por seu papel, o metabólito TAA altera a permeabilidade celular, aumenta o volume nuclear, concentra o cálcio intracelular e inibe a atividade mitocondrial, resultando em morte celular. Devido a esse metabólito, os leucotrienos, como potente mediador inflamatório secretado pelas células hepáticas, são prejudicados [36].

Neste estudo, o tratamento com quitosana influenciou positivamente as enzimas hepáticas. Em contraste e como efeitos esperados da intoxicação por TAA, as atividades séricas de ASAT, ALAT, ALP e GGT mostraram um aumento significativo no grupo tratado com TAA em comparação com o controle normal. Esses resultados estão de acordo com Baskaran et al. [37], Jain e Singhai [38,39]Osama et al. [40], que associaram a elevação das atividades das transaminases séricas com o estresse oxidativo e a peroxidação lipídica que é resultado do efeito tóxico do TAA onde lipídios, proteínas e DNA são danificados pela ação de radicais livres resultando em insulto hepatocelular e necrose. Normalmente, as células necróticas descarregam seu conteúdo na corrente sanguínea resultando no aumento da atividade das transaminases. Por outro lado, grupos protetores e curativos tratados com quitosana mostraram uma clara regulação negativa nas atividades de ALAT, ASAT, ALP e GGT que podem ser atribuídas a antioxidante, imunomodulação e/ou cicatrização de feridas e proteção hepática de quitosana [9]. Da mesma forma, o nível de albumina sérica foi reduzido em ratos intoxicados com TAA como resultado da disfunção hepática da síntese de proteínas devido ao retículo endoplasmático prejudicado e mitocôndrias dos hepatócitos. No entanto, este nível foi regulado e normalizado com tratamento com quitosana tanto em grupos protetores quanto curativos.

A intoxicação por TAA levou à insuficiência da função renal à medida que os níveis séricos de uréia e creatinina estavam aumentados; esta deterioração tem sido agonizada por Begum et al. 41], que relataram lesão tubular na necrose tubular aguda é responsável principalmente pela redução da filtração glomerular. Também foi sugerido que as anormalidades tubulares envolvidas são o bloqueio dos túbulos, causando um refluxo do filtrado glomerular. Assim, a alteração renal em ratos tratados com TAA pode ser devido aos efeitos deletérios das EROs. No entanto, este aumento foi revertido após o tratamento com quitosana como um tratamento protetor ou curativo. Essa observação está de acordo com a de Mohamed [42], que relatou que a ingestão de quitosana reduziu significativamente os níveis de uréia e creatinina em pacientes com insuficiência renal e atribuiu esse efeito a um ou dois mecanismos possíveis: o primeiro é a ativação da função renal para depuração de metabólito de nitrogênio resultando em redução de ureia e creatinina, enquanto a segunda possibilidade é que a quitosana se combina com metabólito de nitrogênio no trato digestivo e então excretada resultando em redução de uréia e creatinina.

No estudo atual, a toxicidade aguda do TAA reduziu significativamente a expressão do gene survivina no tecido hepático em comparação com o grupo controle. No entanto, a alimentação dos animais com uma dieta basal mista de quitosana, como controle de drogas e como tratamento protetor antes da toxicidade do TAA, resultou em um aumento não significativo nos níveis de expressão do gene da survivina. A survivina tem uma função bem estabelecida na fase G2/M do ciclo celular; durante a divisão celular, a survivina compromete uma subunidade do complexo cromossômico passageiro [43,44]. A survivina é expressa em tecidos normais em proliferação e regeneração e foi relatado para suprimir a apoptose e ajudar na progressão do ciclo celular [45]. A expressão da survivina mostrou ter uma associação positiva com o número de hepatócitos no fígado em regeneração. Isso pode ser explicado pela descoberta de que a survivina está envolvida na separação das cromátides irmãs durante a mitose 46]; esses fatos podem interpretar a redução na expressão do gene survivina aqui na intoxicação pós-TAA. Hagemann et ai. [46] relataram que quando a expressão da survivina é reduzida, a localização dos membros do complexo de passageiros cromossômicos é interrompida e, portanto, com atividade reduzida de Auur B, os processos de fosforilação e citocinese de proteínas alvo centroméricas são prejudicados.

Em estudos anteriores em roedores, a expressão de survivina foi significativamente aumentada após hepatectomia parcial e pós-operatório. Além disso, verificou-se que a expressão de survivina estava aumentada no enxerto em transplante de fígado humano. Tanto em roedores quanto em humanos, a superexpressão de survivina está associada à proliferação e não à apoptose; consequentemente, a survivina é importante na proliferação e mitose de hepatócitos, não apenas na regeneração, mas também durante o desenvolvimento normal [46].

A toxicidade aguda induzida por TAA não afetou marcadamente o nível de expressão do gene c-myc no tecido hepático. De fato, o tratamento com quitosana como controle de drogas, tratamento protetor ou curativo aumentou significativamente e dramaticamente o nível de expressão do gene c-myc. Foi relatado que os sinais de desenvolvimento e mitogênicos em células normais não transformadas regulam a expressão de c-myc [47]. Os principais papéis do c-myc são aumentar a proliferação celular e impedir a diferenciação celular. Verificou-se que a progressão do ciclo celular é aumentada por c-myc através da regulação de muitas proteínas de controle do ciclo celular, como ciclinas (D, E, A e B1) e quinases dependentes de ciclina (CDK1.2. 4,6), além de Fatores de transcrição E2F. Por outro lado, descobriu-se que o c-myc suprime a atividade dos bloqueadores do ciclo celular, como p15, p21 e p27 de várias maneiras [48].

A diminuição do peso e do antígeno nuclear da célula em proliferação está associada à diminuição da expressão da proteína c-myc durante a regeneração hepática. Além disso, a proteína p53 reguladora do ciclo celular e o número de células na fase G2 do ciclo celular foram bastante reduzidos. Consequentemente, c-myc é considerado um forte regulador positivo da proliferação celular. Além disso, o c-myc antisense mostrou limitar a regeneração hepática em ratos [24,26].

Da mesma forma, no tecido renal, o c-micgene foi ativado nas células dos túbulos renais durante a regeneração e após a lesão renal induzida pelo ácido fólico in vivo [49]. C-myc também foi encontrado para promover a biossíntese de proteínas, onde a síntese de proteínas foi três vezes maior em fibroblastos que superexpressam c-myc do que em suas linhagens celulares nativas. O C-myc exerce essa ação regulando a transcrição e a biogênese dos ribossomos; também, o c-myc trabalha em coordenação com as RNA polimerases nucleares (RNA pol I e ​​III) para regular a biogênese e a tradução do ribossomo.

Além disso, a transcrição do RNA ribossômico foi estimulada pelo c-myc, que ativa a síntese proteica [50].

Nas presentes investigações, a toxicidade aguda do TAA resultou em um aumento significativo dos níveis de expressão do gene TNF no tecido hepático, bem como níveis plasmáticos elevados, enquanto esse aumento foi significativamente diminuído após o tratamento com quitosana, tanto como tratamentos protetores quanto curativos, em comparação com o TAA- grupo intoxicado. Esse achado está de acordo com a observação anterior de Park et al. [51], que relataram um efeito de melhoria da quitosana no nível de TNF-. Zhang et ai. [52] relataram que a carboximetilquitosana reticulada aumentou as atividades das enzimas do fator inflamatório no início do tratamento; no entanto, restaura-os ao seu nível normal depois disso. Eles sugeriram efeitos de cicatrização de feridas de carboximetilquitosana reticulada através de seus efeitos reguladores negativos na atividade das enzimas hepáticas de ratos.

O TNF- é produzido a partir de células neuronais, fibroblastos, células linfóides, mastócitos, células endoteliais e macrófagos. O TNF- medeia seus efeitos pró-inflamatórios e pró-apoptóticos através da interação com seus receptores de membrana (TNF-R1 e TNF-R2). Ambos os receptores medeiam duas vias de sinalização diferentes, e a ativação de um é acompanhada pela inativação do outro [51].

Nossos resultados sugerem um papel positivo da quitosana na regeneração tecidual que está de acordo com Shilpa et al.[53], que descobriram que o tratamento de ratos parcialmente hepatectomizados com nanopartículas de quitosana e ácido gama-aminobutírico elevou a captação de timidina tritiada em comparação com grupos parcialmente hepatectomizados sem nanopartículas tratamento. O resultado geral do tratamento com nanopartículas de quitosana associado ao ácido gama-aminobutírico é o aumento da regeneração de hepatócitos e diminuição da morte celular em comparação com o fígado de ratos hepatectomizados. Os resultados atuais também estão de acordo com Chen et al. [54], que relataram que as nanopartículas de quitosana aumentaram a regeneração do fígado em ratos que sofrem de insuficiência hepática aguda. A capacidade de ligação da matriz de quitosana permite o crescimento e ativação de macrófagos que são necessários para a regeneração do tecido. Uma ferida realizada em um cão tratado com quitosana apresentou cura completa após três semanas. No entanto, no grupo controle tratado com soro fisiológico, apenas o processo de cura dura quatro semanas. No grupo tratado com quitosana, uma camada de queratina foi formada como evidência de regeneração do tecido conjuntivo. Além disso, uma rede de fibras de colágeno foi formada para proteger a neovasculatura da ferida [55].

No presente estudo, o achado histológico revelou um padrão de tecido hepático deteriorado no grupo TAA; no entanto, esse padrão melhorou muito no grupo protetor de quitosana e de alguma forma no grupo de quitosana curativa.

4. Conclusões

Conclui-se que a quitosana pode aumentar a regeneração hepática na toxicidade hepática induzida por TAA, seja como curativo ou proliferativo. Além disso, mostrou um efeito anti-inflamatório, pois reduziu o nível de TNF- , tanto em níveis gênicos quanto proteicos. Em contraste, a quitosana aumentou a expressão gênica de survivina e c-myc, que são potenciadores da proliferação celular. Outros estudos podem ser conduzidos para elucidar o mecanismo exato pelo qual a quitosana afeta a expressão dos genes c-myc, survivina e TNFC. Consequentemente, a quitosana é recomendada para ser usada em doenças hepáticas onde a regeneração do tecido é necessária.