A regulação1-mediada por HDAC da sinalização GABA no septo lateral facilita a extinção duradoura do medo social em ratos machos

O transtorno de ansiedade social (TAS) é causado por experiências sociais traumáticas. É caracterizada por medo intenso e evitação de contextos sociais, que podem ser fortemente imitados pelo paradigma do condicionamento do medo social (SFC). A fase de extinção do paradigma SFC é semelhante à terapia de exposição para o TAS e requer aprender a dissociar o trauma do contexto social. A acetilação de histonas induzida pela aprendizagem é crítica para a formação da memória de extinção e sua resistência. Embora as histonas desacetilases de classe I (HDACs) regulem o processo de aprendizagem acima mencionado, há uma falta de clareza nas isoformas e na especificidade espacial na função do HDAC na aprendizagem social. Utilizando o paradigma SFC, caracterizamos funcionalmente o papel do HDAC1, especificamente no septo lateral (LS), na regulação da formação da memória de extinção do medo social de longo prazo.

A indução é muito importante na aprendizagem. A indução apropriada pode fazer com que os alunos aceitem o conhecimento de forma mais consciente e compreendam e lembrem-se do conteúdo de aprendizagem mais profundamente. Isso ocorre porque a memória das pessoas é uma espécie de atividade mental e uma manifestação de inteligência. A indução é uma atividade cognitiva positiva e criativa, que pode estimular e orientar o pensamento e a imaginação das pessoas durante o processo cognitivo, melhorando assim a memória.

A indução pode ser alcançada de várias maneiras. Por exemplo, os professores podem definir problemas durante as aulas e deixar os alunos pensarem em soluções por si próprios, o que pode ajudar os alunos a melhorar a sua capacidade de analisar problemas e memória de forma abrangente. Além disso, os professores também podem utilizar recursos didáticos ricos, como imagens, áudio, vídeo e outras formas de promover a absorção e memória do conhecimento pelos alunos.

Por isso, existe uma estreita relação entre indução e memória. Através da indução apropriada, os alunos podem compreender o conhecimento mais profundamente e dominar melhor o conteúdo de aprendizagem. Esta compreensão profunda ajudará os alunos a reter o conhecimento por um período mais longo e facilitará a aplicação flexível do que aprenderam na aprendizagem e na prática posteriores.

Em suma, indução e memória são inseparáveis. Precisamos encontrar um método de aprendizagem e um método de indução adequados através da exploração e prática contínuas, e melhorar continuamente a nossa memória e nível de aprendizagem. Só assim poderemos dar pleno uso aos nossos talentos na vida futura. Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória. Cistanche pode melhorar a memória porque Cistanche é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da carne picada vem de uma variedade de ingredientes ativos que ela contém, incluindo ácido carboxílico, polissacarídeos, flavonóides, etc. Esses ingredientes podem promover a saúde do cérebro por meio de vários canais.

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Medimos um aumento local na fosforilação de HDAC1 indutora de atividade em resíduos de serina de camundongos com condição de medo social e d (SFC +) em resposta à extinção do medo social. Descobrimos também que a função LS-HDAC1 se correlaciona negativamente com a aprendizagem aguda da extinção do medo social usando abordagens farmacológicas e virais. Além disso, a inibição de LS-HDAC1 aumentou a expressão da subunidade 1 do receptor GABA-A (Gabrb1) em camundongos SFC +, e a ativação dos receptores GABA-A facilitou o aprendizado da extinção aguda. Finalmente, a facilitação da aprendizagem da extinção pela inibição do HDAC1 ou pela ativação do receptor GABA-A no LS levou à formação de uma memória de extinção de longa duração, que persistiu até 30 dias após a extinção. Nossos resultados mostram que a regulação mediada por HDAC da sinalização GABA no LS é crucial para a formação da memória de extinção do medo social.

INTRODUÇÃO

O transtorno de ansiedade social (TAS) causado por experiência social aversiva é caracterizado por medo intenso e evitação de situações sociais [1, 2]. O tratamento para o TAS consiste em terapia cognitivo-comportamental (TCC) baseada na exposição, que cria uma memória de "segurança" que coexiste com a memória aversiva original [3, 4]. Uma vez que a mesma sugestão pode ativar memórias aversivas e de segurança, elas competem quando recordadas por estímulos relevantes, e o traço de memória dominante determina o resultado comportamental. Sabe-se que a memória de segurança criada pela TCC baseada na exposição diminui com o tempo, levando a uma recaída de respostas de medo previamente extintas em pacientes com TAS [5–7]. Assim, é imperativo compreender os mecanismos subjacentes à memória de extinção duradoura para desenvolver estratégias terapêuticas que levem a uma remissão mais completa e robusta do TAS.

Para tanto, estabelecemos o paradigma do condicionamento do medo social operante (SFC), que gera medo robusto e evitação de membros da mesma espécie em camundongos [8]. Neste paradigma, a extinção do medo social e a formação da memória de extinção são induzidas por apresentações consecutivas de diferentes estímulos sociais (coespecíficos desconhecidos), resultando em uma perda gradual do medo e no aumento da investigação social [9]. Estudos anteriores de nosso laboratório mostraram o envolvimento do septo lateral (LS) na extinção do medo social induzido por SFC em camundongos [10, 11]. O LS também é conhecido por regular vários comportamentos sociais [12], que são sustentados por mecanismos epigenéticos complexos [13]. No entanto, os mecanismos epigenéticos dentro do LS que regulam a extinção do medo social e a formação da memória de extinção a longo prazo permanecem desconhecidos.

Evidências concordantes sugerem a importância da acetilação pós-tradução das caudas N-terminais dos resíduos de histonas na consolidação e manutenção da memória do medo [14]. As histonas desacetilases de classe I (HDACs), que catalisam a remoção de grupos acetil dessas caudas N-terminais das histonas, são reguladores essenciais da expressão gênica subjacente ao aprendizado e à memória [15]. Esses HDACs classe I, incluindo HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC8, mostram notável dependência espacial e contextual em sua função.

Por exemplo, descobriu-se que o HDAC1 do hipocampo melhora a memória associativa em um paradigma contextual de condicionamento do medo [16], enquanto o HDAC2 do hipocampo foi funcionalmente ligado ao comprometimento na formação de objetos e memória espacial de longo prazo [17, 18]. Da mesma forma, a atividade de HDAC1 foi regulada positivamente, enquanto a atividade de HDAC2 foi regulada negativamente na amígdala e no córtex pré-frontal, respectivamente, após o condicionamento do medo [19]. Estudos também implicaram a contribuição diferencial do HDAC3 na formação de memórias de medo contextuais e aversivas robustas no hipocampo e na amígdala basal, respectivamente [20].

Considerando as funções variadas e complicadas das HDACs de classe I na regulação da aprendizagem e da memória, os inibidores de HDAC são frequentemente utilizados como melhoradores cognitivos em vários estudos pré-clínicos [21]. No entanto, a contribuição de HDACs específicos na regulação da resistência da memória de extinção do medo social permanece indefinida.

Assim, neste estudo, examinamos a regulação de HDACs de classe I no contexto do paradigma SFC. Com base no aumento pós-extinção na fosforilação de serina indutora de atividade de HDAC1, manipulamos a função de LS-HDAC1 usando inibição farmacológica e superexpressão viral. Além disso, acompanhando o aumento na expressão do gene que codifica a subunidade 1 do receptor A do ácido gama-aminobutírico (GABA) (Gabrb1) em resposta à combinação de bloqueio de HDAC1 e treinamento de extinção, ativamos o receptor GABA-A sinalização dentro do LS. Finalmente, testamos o efeito da inibição de LS-HDAC1 e da ativação do receptor LSGABA-A na formação de memória de extinção a longo prazo. Nossos resultados indicam que o LS-HDAC1 regula negativamente a aprendizagem da extinção do medo social e a aprendizagem da extinção do medo social a longo prazo através da sinalização GABA-A.

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais

Camundongos CD1 machos (Charles River Alemanha, 8-11 semanas de idade no início dos experimentos) foram mantidos em grupo sob condições laboratoriais padrão (ciclo claro/escuro de 12/12 horas, luzes acesas às 06:00, 22 graus, 60% de umidade, comida e água ad libitum) em gaiolas de policarbonato (16 × 22 × 14 cm) até a cirurgia ou 3 dias antes de cada experimento comportamental. Camundongos CD1 machos com idade e peso correspondentes foram usados ​​como estímulos sociais no paradigma SFC. Todos os procedimentos experimentais foram realizados entre 08:{17}} e 12:00 h pelo Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Governo de Unterfranken, diretrizes ARRIVE [22], e as diretrizes do NIH.

Paradigma SFC

O SFC foi realizado conforme descrito anteriormente [8] com pequenas modificações para analisar a extinção a longo prazo:

Aquisição do medo social (dia 1). Os ratos foram colocados na câmara de condicionamento do medo e autorizados a habituar-se por 30 s antes de serem expostos a uma gaiola de malha de arame vazia por 3 min, durante os quais puderam investigar livremente o objeto. Em seguida, a gaiola vazia foi substituída por uma gaiola idêntica contendo coespecíficos de mesma idade e peso (estímulo condicionado: CS). Camundongos condicionados (SFC+) receberam um leve choque nas patas (estímulo não condicionado: US; 0,7 mA, 1 s) cada vez que investigavam o co-específico. Camundongos não condicionados (SFC-) foram autorizados a interagir livremente com o co-específico por 3 min. Normalmente, os camundongos SFC + evitaram aproximar-se ou interagir com o co-específico após 1-3 pares CS-US, momento em que foram considerados como tendo adquirido medo social e retornado à sua gaiola.

Extinção do medo social (dia 2). A extinção do medo social foi realizada de forma idêntica na gaiola dos camundongos SFC + e SFC-. Cada camundongo alojado individualmente foi exposto três vezes a uma gaiola de malha de arame vazia e, em seguida, a seis co-específicos de idade e peso diferentes por 3 min cada, com um intervalo interestímulo de 3-min. O tempo gasto na investigação do estímulo social foi medido como um indicador de medo social.

Recordação do medo social (dia 3, dia 32). Para a recordação de extinção do medo social de curto prazo, os ratos foram expostos a seis estímulos sociais diferentes em sua gaiola por 3 min com um intervalo interestímulo de 3-min,al. Para a recordação de extinção do medo social de longo prazo, os ratos foram testados em sua gaiola 30 dias após a extinção do medo social. A idade com correspondência de peso foi exposta duas vezes a diferentes estímulos sociais por 3 minutos cada, com um intervalo interestímulo de 3-min.

Implantações estereotáxicas

Guia canulbygth; Injecta GmbH) para infusão bilateral de drogas no LS foram implantados estereotaxicamente com a ponta apoiada 2 mm acima da região alvo do LS (de bregma: anterior-posterior: −0,3 mm, mediolateral: ±0 0,5 mm, dorsoventral: −1,6 mm [23]), sob anestesia com isoflurano (Forene, Abbott GmbH) [10, 24]. Todos os ratos receberam uma injeção subcutânea de antibióticos (10 mg/kg Baytril, Bayer GmbH) e analgésicos (0,05 mg/kg Buprenorfina, Bayer) para evitar infecções e dor pós-cirúrgica. A fim de reduzir o estresse pós-cirúrgico, todos os ratos foram manuseados uma vez por dia durante pelo menos 5 dias antes dos experimentos em que as cânulas falsas que fecham as cânulas guia foram desinfetadas.

Infusões intraseptais de medicamentos

Os ratos receberam infusões bilaterais de MS275 (um inibidor de moléculas pequenas orto-aminoconespecífico com alta afinidade para HDAC1; 375 ng / 0 0,2 µl / hemisfério) [16, 25], muscimol (Muc; um GABA-A seletivo agonista do receptor; 0,2 µg/0,2 µl/hemisfério) [26, 27] ou Veículo (Veh; 0,2 µl/hemisfério; 0. DMSO a 5% em Ringer estéril) no LS através de uma cânula de infusão de 27 G inserida nas cânulas guia conectadas a uma seringa Hamilton de 10- µl. A infusão de MS275 e Muc foi realizada 120 minutos ou 10 minutos antes do treinamento de extinção do SFC, respectivamente. Apenas animais com locais de infusão corretos e verificados histologicamente foram incluídos nas análises estatísticas.

Infusões virais intraseptais

O vírus Adeno-associado (AAV; Vector Biolabs) para superexpressão de HDAC1, ou seja, AAV-hSyn-HDAC1-GFP-WPRE (HDAC1-OE; 2,5 × 1013 GC /ml;), ou o vetor de controle, ou seja, AAV-hSyn-GFP-WPRE (GFP; 2,5 × 1013 GC/ml), foram infundidos bilateralmente no LS (ântero-posterior do bregma +0,3 mm , lateral ±0,5 mm; dorsoventral −3,8 mm, −3,4 mm, −3,1 mm, −2,8 mm) com quatro 70-infusões nl/hemisfério. As infusões foram realizadas 3 semanas e foram expostas ao início de experimentos comportamentais conforme descrito anteriormente [11].

Análise de expressão gênica

Os ratos foram submetidos à extinção do medo social e deixados em suas gaiolas por 90 minutos após o treinamento comportamental. Os ratos foram então sacrificados sob anestesia com CO2, seus cérebros foram rapidamente removidos e ântero-posterior ou posterior do bregma ({4}} 0,1 mm a -0,10 mm) foi dissecado.

Isolamento de RNA e matriz de PCR

Extração e análise de proteínas

As proteínas nucleares foram extraídas utilizando o Kit de Extração Nuclear EpiQuick (Epigentek) de acordo com o protocolo do fabricante. A análise de Western blot foi usada para detectar níveis de expressão de torilação de HDAC1. 15 µg de proteína foram resolvidos em géis TGX Stain-Free a 12% (Bio-Rad) e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com leite a 5%, Tween a 1%-20 em solução salina tamponada com Tris seguida de incubação durante a noite com o seguinte anti-HDAC1 à base de antibanilida (Thermo Fisher; PA1-860; 1:2000) , fosforilação de HDAC1 no resíduo de serina 421 (coelho-anti-pHDAC1 (S421); Thermo Fisher; PA5-36810; 1:2000), bem como fosforilação na serina 421 e 423 (coelho-anti-pHDAC1 (S421, S423), Thermo Fisher; PA5-36911; 1:2000). As bandas imunomarcadas foram detectadas utilizando o anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com HRP (Cell Signaling; #7074; 1:1000) seguindo um sistema de quimioforencia melhorado (SuperSignal West Dura, Thermo Fisher). A proteína total foi utilizada como controle de carga interna.

Pontuação de comportamento e análise estatística

Os tempos de investigação social como um indicador de medo social foram pontuados manualmente por um observador cego ao tratamento usando JWatcher (1.0, Universidade Macquarie e UCLA). GraphPad Prism versão 9.0 para Windows (GraphPad Software) foi usado para análise estatística. Um relatório detalhado da análise anterior-posterior está disponível na Tabela Suplementar S2. Todas as figuras foram produzidas usando o design Affinity.

RESULTADOS

A extinção do medo social regula positivamente a indução da atividade antes das fosforilações no septo de camundongos SFC+ Primeiro, analisamos os níveis de proteína HDAC1 em msujeitos de tecido septal obtidos de camundongos SFC+ e SFC− 90 min após a exposição a apenas um estímulo social, ou seja, com extinção abreviada (SFC+/1ss e SFC−/1ss), ou seis estímulos sociais, ou seja, com extinção completa (posterior-posterior6ss) (fig. 1A). O número de pares CS-US durante a aquisição do medo social no dia 1 (Fig. 1B) foi semelhante entre ambos os grupos de camundongos SFC+. Como esperado, os ratos SFC + gastaram significativamente menos tempo investigando os primeiros (ou seguintes) estímulos sociais em comparação com os ratos SFC- (P <0,05; Fig. 1C), indicando níveis mais elevados de medo social. No entanto, ao final do protocolo de extinção completo, o tempo de investigação do 6º estímulo social pelos camundongos SFC +/6ss foi semelhante ao de seus homólogos SFC-/6ss (Fig. 1C), sugerindo uma extinção bem-sucedida do medo social.

A análise de Western blot não revelou diferenças nos níveis septais de HDAC1 entre os quatro grupos testados, ou seja, entre SFC+/1ss, SFC+/6ss, SFC−/1ss e SFC−/6ss, durante a extinção do medo social (Fig. 1D). Sabe-se que a fosforilação pós-tradução de HDAC1 em ser421 (pHDAC1) e a dupla fosforilação em ser421 e ser423 (ppHDAC1) aumentam a atividade de desacetilase de HDAC1 [28]. Assim, quantificamos os níveis de pHDAC1 e ppHDAC1 dentro do septo para avaliar a ativação de HDAC1 durante a extinção do medo social. Ambos os níveis de pHDAC1 e ppHDAC1 foram aumentados em ratos SFC+/6ss em comparação com camundongos SFC+/1ss (Fig. 1E; P < 0.05 para pHDAC1 e Fig. 1F; P < 0,05 para ppHDAC1), sugerindo um aumento na atividade de HDAC1 durante a extinção do medo social.

A modulação bidirecional do LS-HDAC1 regula a aprendizagem da extinção do medo social

Em seguida, pretendemos estabelecer uma relação causal entre a função LSHDAC1 e a extinção do medo social por modulação bidirecional da função LS-HDAC1 usando bloqueio farmacológico (perda de função) ou uma superexpressão mediada por AAV (ganho de função) em duas coortes separadas de camundongos .

Para bloqueio farmacológico de micropunções, S275 ou Veh foi infundido bilateralmente no LS antes do treinamento de extinção levando aos seguintes grupos: SFC+/Veh, SFC+/MS275, SFC−/Veh e SFC−/MS275 (Fig. 2A). O número de pares CS-US não diferiu entre os grupos SFC+ durante a aquisição do medo social (fig. 2B). Durante a extinção do medo social no dia 2, todos os camundongos SFC+ expressaram altos níveis de medo social durante a apresentação do primeiro estímulo social, independente do seu tratamento, conforme refletido pelos baixos tempos de investigação social. No entanto, a inibição de HDAC1 acelerou a extinção, pois o grupo SFC+/MS275 já apresentava investigação social elevada durante a exposição ao 2º e 3º estímulo social (P <{16}}0,05 vs. SFC+/Veh; Fig. 2C). O tratamento com MS275 não afetou os tempos de investigação social em camundongos SFC (Fig. 2C, D). Todos os grupos apresentaram níveis igualmente elevados de investigação social durante a recordação de curto prazo (Fig. 2D), indicando a extinção bem-sucedida do medo social.

Em segundo lugar, realizamos um experimento de ganho de função usando superexpressão de HDAC1 mediada por AAV (AAV-hSyn-HDAC1-GFPWPRE; HDAC1-OE) ou um vírus de controle (AAV-hSyn-GFP- WPRE; GFP) dentro do septo de camundongos SFC+ e SFC− levando aos seguintes grupos: SFC+/GFP, SFC+/HDAC-OE, SFC−/GFP e SFC−/HDAC-OE (Fig. 2E). Todos os grupos de camundongos SFC + receberam o mesmo número de pares de CSUS durante a aquisição, três semanas após a transfecção viral (Fig. 2F), sugerindo que a superexpressão de LS-HDAC1 não alterou a aprendizagem do medo social. Todos os camundongos SFC + independentes do tratamento exibiram altos níveis de medo social durante a apresentação do primeiro estímulo social, conforme refletido pela redução da investigação social em comparação com os respectivos grupos SFC- (Fig. 2G). No entanto, a extinção do medo social foi significativamente prejudicada pela superexpressão de LS-HDAC1, já que o grupo SFC+/HDAC1-OE apresentou menor investigação social durante a exposição do 2º ao 6º estímulo social, em oposição aos camundongos SFC+/GFP que exibiram o esperado extinção (P <{30}} 0,05 vs. SFC + / GFP; Fig. 2G). Antes dos ratos, a superexpressão de LS-HDAC1 não afetou os tempos de investigação social (Fig. 2G, H). Durante a recordação de curto prazo, todos os grupos de ratos apresentaram níveis semelhantes de investigação social (Fig. 2H). A superexpressão de HDAC1 foi confirmada por análise de western blot (Figura Suplementar S1).

A inibição pré-extinção de LS-HDAC1 leva a mudanças dinâmicas na expressão gênica

Para identificar os possíveis alvos a jusante de LS-HDAC1, camundongos SFC+ foram infundidos bilateralmente com Veh ou MS275 120 min antes da extinção do medo social e foram sacrificados 90 min após a exposição ao primeiro (Veh /1ss e MS275/1ss) ou o 6º estímulo social (Veh/6ss e MS275/6ss) (Fig. 3A). Micropunches de tecido septal foram obtidos e processados ​​usando um array de PCR para sinalização de GABA e glutamato (ver "Materiais e métodos"). Todos os grupos SFC+ receberam um número semelhante de pares CS-US durante a aquisição do medo social (Fig. 3B). Durante a extinção, todos os grupos de camundongos SFC+ apresentaram baixa investigação social durante a exposição ao primeiro estímulo social. No entanto, durante a extinção, os camundongos SFC + sacrificados após o 6º estímulo social mostraram contato social incremental com cada exposição, sugerindo a extinção adequada do medo social (Fig. 3C). 2C, a extinção do medo social foi acelerada em ratos MS275/6ss em comparação com camundongos Veh/6ss, como é evidente a partir de tempos de investigação social mais elevados durante a apresentação ao 2º e 3º estímulo social (P <{36}}. 05 vs. Veh/6ss; Fig. 3C). A análise do array de PCR para genes relacionados à sinalização de GABA e glutamato revelou mudanças dinâmicas em muitos genes, como mostrado no mapa de calor (Fig. 3D). O generalista completo do PCR Array, juntamente com a respectiva alteração de dobra e valores de P, é fornecido na Tabela Suplementar S3. No entanto, um gene que foi explicitamente regulado positivamente em camundongos tratados com MS275- após o treinamento de extinção completo foi o Gabrb1 (P < 0,05 vs. todos os outros grupos; Fig. 3E), enquanto seu gene Gabrb3, intimamente relacionado, permaneceu inalterado (Fig. 3F). ).

A ativação farmacológica dos receptores LS-GABA-A facilita a aprendizagem da extinção

Com base nos resultados da elevação pós-extinção induzida pela inibição de HDAC {{0}} na expressão de Gabrb1, levantamos a hipótese de que a sinalização GABAérgica pode estar subjacente ao efeito de aceleração da extinção da inibição de LSHDAC. Para testar essa ideia, ativamos localmente a sinalização LSGABA-A infundindo Muc, um agonista GABA-A específico [25], ou Veh, levando aos seguintes grupos: SFC+/Veh e SFC+/Muc, SFC−/Veh, e SFC-/Muc (Fig. 4A). Camundongos SFC + infundidos com Muc ou Veh necessitaram do mesmo número de pares CS-US para adquirir medo social (Fig. 4B). Durante a extinção do medo, todos os camundongos SFC+ gastaram significativamente mais tempo investigando o estímulo social durante a exposição ao primeiro estímulo social do que seus equivalentes SFC− (P <{22}}.05 vs. SFC−/Veh e SFC−/Muc; Fig. 4C), que apontava para uma aquisição bem-sucedida do medo social. No entanto, os ratos SFC+/Muc apresentaram uma extinção mais rápida. Especificamente, eles mostraram níveis de investigação social semelhantes aos dos camundongos SFC−, que foram significativamente maiores do que os camundongos SFC+/Veh já expostos ao segundo estímulo social (P <0,05 vs. SFC+/Veh: Fig. 4C) . Durante a recordação de curto prazo, todos os grupos de ratos apresentaram investigação social semelhante (Fig. 4D), sugerindo uma extinção bem sucedida.

A inibição farmacológica do LS-HDAC1 ou a ativação da sinalização LS-GABA leva à extinção duradoura do medo social

Com base na aprendizagem melhorada da extinção que observamos tanto após a inibição do LS-HDAC1 quanto a ativação da sinalização do LS-GABA, estudamos em seguida a natureza duradoura dessas generalizações farmacológicas (Fig. 5A).

No primeiro experimento, testamos o efeito do bloqueio de HDAC1 na formação de memória de extinção duradoura em camundongos SFC+/Veh e SFC+/MS275. Os camundongos SFC + infundidos com Veh e MS275- receberam o mesmo número de pares CS-US durante a aquisição do medo social (Fig. 5B). Confirmando nossas observações anteriores (Figs. 2C e 3C), camundongos SFC+ infundidos com MS275 mostraram aumento da investigação social durante a exposição ao 2º e 3º estímulos sociais durante o treinamento de extinção do medo social (P <0.05 vs. SFC+/Veh; Figura 5C). Consequentemente, ambos os grupos apresentaram níveis semelhantes de tempos de investigação social durante a exposição ao 6º estímulo social, sugerindo uma extinção bem-sucedida. Apesar da extinção bem-sucedida, durante a recordação de longo prazo realizada 30 dias após o treinamento de extinção, os camundongos SFC+/MS275 mostraram níveis significativamente mais altos de investigação social (P <0,05 vs. SFC+/Veh; Fig. 5D), demonstrando melhora na memória de extinção de longa duração após Inibição de HDAC1.

A mesma experiência foi realizada num conjunto separado de ratinhos SFC+ infundidos localmente com Muc ou Veh (grupos SFC+/Veh e SFC+/Muc). Ambos os grupos receberam pares CS-US semelhantes indicando aquisição igual (Fig. 5E) e exibiram investigação social similarmente baixa durante a exposição ao primeiro estímulo social durante o treinamento de extinção (Fig. 5F). No entanto, como no experimento anterior (Fig. 4C), o grupo SFC+/Muc teve uma extinção acelerada do medo social (P <{9}}.05 vs. SFC+/Veh; Fig. 5F). Curiosamente, durante o recall de longo prazo no dia 32, os camundongos SFC+/Muc mostraram maior investigação social em comparação com o grupo SFC+/Veh (P <0,05 vs. SFC+/Veh; Fig. 5G), sugerindo que a ativação de LS-GABA-A também resulta em memória aprimorada de extinção de longa duração.

DISCUSSÃO

Os processos que regulam a transição da memória de curto prazo para a memória de longo prazo no contexto de comportamentos relacionados ao medo, especificamente do TAS, não são bem compreendidos. Neste estudo, utilizando o paradigma SFC combinado com abordagens farmacológicas e virais, descrevemos um novo mecanismo epigenético mediado por HDAC1 dentro do LS regulando a memória de extinção do medo social de longa duração em camundongos machos. Especificamente, observamos (i) aumento da fosforilação indutora de atividade de HDAC1 dentro do septo de camundongos SFC + durante a extinção do medo social, (ii) regulação negativa da expressão do medo social por HDAC1 dentro do LS, (iii) uma expressão aumentada de Gabrb1 no septo em resposta à combinação de inibição e extinção de HDAC1, (iv) facilitação da extinção do medo pela ativação do receptor GABA-A e (iv) consolidação duradoura da memória de extinção após inibição farmacológica de HDAC1 ou ativação de receptores GABA-A dentro do LS .

HDACs de classe I foram previamente associados a déficits de comportamento social [29–31] e aprendizagem associativa [16, 17, 20, 32]. Considerando esta premissa, testamos a dinâmica da proteína HDAC1 septal durante a extinção do medo social e descobrimos que a extinção do medo social em camundongos SFC + melhorou pHDAC1 e ppHDAC1 (Fig. 1E, F), embora os níveis de proteína HDAC1 permanecessem inalterados (Fig. 1D). Sabe-se que as fosforilações pós-traducionais de HDAC1 mediadas por caseína quinase 2- em ser421 e ser423 aumentam sua atividade catalítica (isto é, desacetilase) e sua associação com grandes complexos repressores, como os complexos Sin3A e CoREST (33). O aumento da fosforilação nestes locais resultou da extinção do medo social, sugerindo que o treinamento de extinção aumenta a atividade de HDAC1 apenas em camundongos SFC+. Este aumento não foi observado em camundongos SFC- ou SFC + que passaram por uma extinção abreviada, sugerindo que o treinamento completo de extinção em camundongos socialmente medrosos é essencial para que a fosforilação de HDAC1 seja aumentada.

Revelamos ainda uma ligação causal entre a elevada atividade de HDAC1 dentro do LS e o medo social. (i) O bloqueio farmacológico do LS-HDAC1 120 min antes da extinção do medo facilitou a extinção do medo social (Fig. 2C). (ii) Por outro lado, a superexpressão de HDAC1 mediada por AAV dentro do LS prejudicou a extinção do medo social (Fig. 2G). Como mencionado anteriormente, o HDAC1 e outros HDACs de classe I foram descritos como reguladores críticos da memória do medo [16]. Por exemplo, a ocupação reduzida de HDAC3 no promotor cFos no hipocampo dorsal e na amígdala basolateral correlacionou-se com a formação de memória de medo contextual sem afetar o medo sugerido [20]. Em outro estudo, o RGFP963 – um inibidor de moléculas pequenas de HDACs de classe I – melhorou a consolidação do medo sinalizado [34]. Considerando que o LS é crucial para o processamento de sinais sociais durante a formação de memórias associativas [12], nossos resultados sugerem uma nova função para o LS-HDAC1 como um regulador negativo da aprendizagem da extinção do medo social.

Para revelar alvos a jusante para HDAC1, que podem mediar seu efeito na aprendizagem de extinção, realizamos um array de PCR para genes relacionados à sinalização de GABA e glutamato em camundongos SFC + com ou sem inibição de HDAC1. Descobrimos que a expressão de Gabrb1 está aumentada no tecido septal de camundongos que recebem [37], a ativação mediada por Muc da sinalização GABA-A com a região CA1 do hipocampo aumenta a extinção do medo contextual [38], enquanto manipulação semelhante dentro do córtex pré-frontal infralímbico ou a amígdala basolateral aumenta a extinção do medo sugerido [39]. Estudos demonstraram que a redução na função do receptor GABA-A resultante da regulação negativa que sugere a expressão de a1 devido à redução da acetilação do promotor H3 é mediada por HDAC2 e HDAC3 sob condições de exposição crônica ao etanol [40]. Um mecanismo semelhante poderia estar subjacente ao nosso resultado. Assim, a inibição de HDAC1 possivelmente resulta em maior acetilação de H3 e H4 e, consequentemente, em maior expressão de Gabrb1 e sinalização de GABA dentro do LS, levando a uma maior aprendizagem de extinção em um contexto social. Na confirmação desta hipótese, a ativação antes do receptor LS-GABA-A usando Muc facilitou o aprendizado de extinção semelhante ao efeito observado da inibição de LS-HDAC1 (Fig. 4C). O LS é principalmente GABAérgico e é conhecido por regular comportamentos motivados [12]. Além disso, o LS recebe informações glutamatérgicas das regiões CA2 do hipocampo, que codificam a memória social [41, 42]. No entanto, essas entradas glutamatérgicas têm uma organização espacial definida e ativam um conjunto específico de neurônios dentro do LS [12, 43], levando a efeitos comportamentais específicos a jusante. No contexto da extinção do medo social, tais entradas podem comunicar a valência negativa do estímulo social em ratos SFC+, causando assim a evitação social e o medo social. No entanto, uma inibição geral do LS causada pela sinalização GABAérgica local melhorada provavelmente desinibirá a abordagem social da aprendizagem social.

Como mencionado anteriormente, a recidiva e a recorrência do TAS em pacientes que sofreram remissão completa são muito altas [44–46]. Assim, testamos a memória de extinção do medo a longo prazo após a inibição de LS-HDAC1 ou ativação de LS-GABA-A. Notavelmente, tanto a inibição de HDAC1 quanto a ativação do receptor GABA-A no LS aumentaram suficientemente a resistência à extinção do medo social e preveniram a recorrência de memórias sociais aversivas, conforme encontrado em controles tratados com veículo 30 dias após a extinção do medo social (Fig. 5D, G) . Estes dados demonstram que a inclinação acelerada observada de forma aguda pela inibição de HDAC1 e pela ativação do receptor GABA-A levou a uma consolidação mais substancial da memória de extinção, tornando-a altamente duradoura. Isso corrobora a ideia de que os inibidores de HDAC são intensificadores cognitivos eficazes [21, 47]. Sabe-se que o TAS tem maior prevalência em mulheres [48] e também estabelecemos o paradigma SFC em camundongos fêmeas [11]. Além disso, houve efeitos contrastantes da inibição de HDAC na cognição em camundongos fêmeas, dependendo do subtipo de HDAC e do contexto específico que está sendo examinado [49, 50]. Assim, pode-se considerar estudar o mecanismo acima mencionado em camundongos fêmeas. No entanto, este exame está fora do escopo e deve ser um estudo de acompanhamento interessante.

Em resumo, nosso estudo fornece insights críticos sobre os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da extinção do medo social e implica que a inibição1-mediada por HDAC da sinalização GABAérgica dentro do LS é um regulador negativo da extinção do medo social agudo e de longo prazo em ratos. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a vincular causalmente o HDAC1 à regulação de memórias sociais aversivas. Este estudo acrescenta ao crescente corpo de evidências que colocam os HDACs como potenciais reguladores da memória associativa e propõe especificamente o HDAC1 como um potencial alvo terapêutico para o TAS.

REFERÊNCIAS

dsDemyttenaere K, Bruffaerts R, Posada-Villa J, Gasquet I, Kovess V, Lepine JP, et al. Prevalência, gravidade e necessidade não atendida de tratamento de transtornos mentais nas Pesquisas Mundiais de Saúde Mental da Organização Mundial da Saúde. J Am Med Assoc. 2004;291:2581–90.

2. Blanco C, Bragdon LB, Schneier FR, Liebowitz MR. A farmacoterapia baseada em evidências do transtorno de ansiedade social. Int J Neuropsicofarmacol. 2013;16:235–49.

3. Scholten WD, Batelaan NM, van Balkom AJ, Wjh Penninx B, Smit JH, van Oppen P. Recorrência de transtornos de ansiedade e seus preditores. J Afeta Desordem. 2013;147:180–5.

4. Botão ME. Contexto, tempo e recuperação de memória nos paradigmas de interferência da aprendizagem pavloviana. Touro Psicológico. 1993;114:80–99.

5. Bruce SE, Yonkers KA, Otto MW, Eisen JL, Weisberg RB, Pagano M, et al. Influência da comorbidade psiquiátrica na recuperação e recorrência do transtorno de ansiedade generalizada, fobia social e transtorno do pânico: um estudo prospectivo de 12-ano. Sou J Psiquiatria. 2005;162:1179–87.

6. Boschen MJ, Neumann DL, Waters AM. Recaída de ansiedade e medo tratados com sucesso: questões teóricas e recomendações para a prática clínica. Psiquiatria Aust NZJ. 2009;43:89–100.

7. Leung HT, Westbrook RF. A recuperação espontânea de respostas de medo extintas aprofunda a sua extinção: um papel para os mecanismos de correção de erros. Processo J Exp Psychol Anim Behav. 2008;34:461–74.

8. Toth I, Neumann ID, Slattery DA. Condicionamento do medo social: um modelo animal novo e específico para estudar o transtorno de ansiedade social. Neuropsicofarmacologia. 2012;37:1433–43.

9. Toth I, Neumann ID, Slattery DA. Condicionamento do medo social como modelo animal de transtorno de ansiedade social. Curr Protoc Neurosci. 2013;63:9–42.

10. Zoicas I, Slattery DA, Neumann ID. Oxitocina cerebral no condicionamento do medo social e sua extinção: envolvimento do septo lateral. Neuropsicofarmacologia. 2014;39:3027–35.

11. Menon R, Grund T, Zoicas I, Althammer F, Fiedler D, Biermeier V, et al. A sinalização da oxitocina no septo lateral evita o medo social durante a lactação. Curr Biol. 2018;28:1066–78.e1066.

12. Menon R, Suss T, Oliveira VEM, Neumann ID, Bludau A. Neurobiologia do septo lateral: regulação do comportamento social. Tendências Neurosci. 2022;45:27–40. 13. Bludau A, Royer M, Meister G, Neumann ID, Menon R. Regulação epigenética do cérebro social. Tendências Neurosci. 2019;42:471–84.

14. Levenson JM, Sweatt JD. Mecanismos epigenéticos na formação da memória. Nat Rev Neurosci. 2005;6:108–18.

15. Mahgoub M, Monteggia LM. Um papel das histonas desacetilases nos mecanismos celulares e comportamentais subjacentes à aprendizagem e à memória. Aprenda Mem. 2014;21:564–8.

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