Gao-Zi-Yao melhora a função de aprendizagem e memória em velhos ratos hipertensos espontâneos, parte 2

Animais experimentais

Ratos hipertensos espontâneos (SHR) machos com doze meses de idade e oito semanas de idade foram adquiridos no Nanjing Animal Model Center.

Há uma forte relação entre homens de 8-semanas de idade e memória. Durante esse período, o cérebro da criatura masculina se desenvolve rapidamente e as conexões entre seus neurônios aumentam gradativamente, o que por sua vez afeta o desenvolvimento de sua memória.

A pesquisa mostra que a memória das criaturas masculinas continua a melhorar com a idade. Isto não só tem um impacto significativo na sua sobrevivência e reprodução, mas também os ajuda a adaptar-se melhor ao ambiente e a enfrentar novos desafios.

Portanto, devemos encorajar activamente os jovens do sexo masculino a participarem numa variedade de actividades benéficas, tais como resolver puzzles, aprender novas competências e explorar novas áreas. Essas atividades estimulam seus cérebros, permitindo-lhes desenvolver-se mais rapidamente e melhorar suas habilidades de memória.

Ao mesmo tempo, devemos também proporcionar um ambiente e uma atmosfera adequados para os jovens machos. Fazer com que se sintam seguros e próximos pode promover o desenvolvimento do cérebro e melhorar a memória.

Em suma, devemos fazer tudo o que pudermos para ajudar os jovens do sexo masculino a melhorar a sua memória, para que se tornem criaturas mais inteligentes, mais confiantes e capazes. Isto não só contribui para o seu desenvolvimento pessoal, mas também para a prosperidade e sobrevivência de toda a espécie. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, pois a Cistanche deserticola tem efeitos antioxidantes, antiinflamatórios e antienvelhecimento, que podem ajudar a reduzir as reações oxidativas e inflamatórias no cérebro, protegendo assim o saúde do sistema nervoso. Além disso, a Cistanche deserticola também pode promover o crescimento e a reparação das células nervosas, melhorando assim a conectividade e a função das redes neurais. Esses efeitos podem ajudar a melhorar a memória, o aprendizado e a velocidade de pensamento, e também podem prevenir o desenvolvimento de disfunções cognitivas e doenças neurodegenerativas.

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Neste modelo, a hipertensão começa a se desenvolver aos 4 meses de idade, com o aparecimento de alterações relacionadas à hipertensão na microvasculatura cerebral aos 6 meses de idade [37].

Os ratos foram alojados em condições ideais com higiene padrão, mantidos a uma temperatura de 25 graus com um ciclo claro/escuro de 12/12 e alimentados com ração padrão para ratos e água ad libitum.

Todos os procedimentos foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais estabelecidas pela Soochow University, o que é consistente com nosso relatório anterior [35].

Os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes do Instituto Nacional de Saúde para o Uso de Animais de Laboratório (NIH, publicação número 85–23, revisada em 1996). O presente estudo é relatado pelas diretrizes ARRIVE.

Para controle do envelhecimento foi aplicado SHR com oito semanas de idade (SHR-Young, n=10). Ratos de doze meses de idade foram tratados com ou sem Gao-Zi-Yao para água destilada (Antigo SHR-C, n=10), dose baixa (Antigo SHR-L, n=10), dose média (Antigo SHR-M, n=10), dose alta (Antigo SHR-H, n=10) por alimentação gástrica.

Dosagens de Gao-Zi-Yao baixo, médio e alto iguais a 1/2-, 1-, dosagens triplas para aplicação em pacientes clínicos calculadas de acordo com a área de superfície corporal. Gao-Zi-Yao foi dissolvido em 5 mL de água destilada antes da aplicação e foi administrado um único produto lácteo por 4 semanas.

A pressão arterial e a frequência cardíaca foram monitoradas todas as semanas pelo método do manguito de cauda, ​​e o peso corporal também foi monitorado todas as semanas, conforme nossa observação anterior [35].

Após 4 semanas, o experimento do labirinto aquático de Morris foi realizado e os ratos foram sacrificados sob anestesia com pentobarbital sódico (50 mg/kg ip), tecido do hipocampo foi coletado para análise posterior. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de licenciamento de ética da Universidade Soochow.

Experimento do labirinto aquático de Morris

O experimento do labirinto aquático de Morris (BW-MWM101, Shanghai Bio-will Co., Ltd., Xangai, China) foi realizado conforme descrito anteriormente com algumas modificações [38]. O teste foi planejado para 6 dias, os dias 1 a 5 foram para o período de treinamento e o dia 6 foi para os resultados dos testes.

Os ratos receberam treinamento por 2 min de laticínios, registrando o tempo de embarque na plataforma como o tempo de latência. No dia 6 a plataforma foi removida. Os ratos foram colocados no quadrante mais distante e a trajetória de natação foi registrada por 2 min.

Parâmetros para aprendizagem e função de memória foram calculados pelo software.

Mensuração dos níveis séricos de NO e fatores inflamatórios por ELISA

Níveis séricos de NO (Número de catálogo: S0023), IL-1 (Número de catálogo: A301BH80153), IL-2 (Número de catálogo:A31038348), IL-6 (Número de catálogo: A30681042), e TNF- (número de catálogo: A38280855) foram medidos usando kits ELISA disponíveis comercialmente (BiotechnologyCo., Ltd. Shanghai enzima research. Shanghai, China). Todas as etapas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

Coloração de Nissl

O tecido do hipocampo de rato foi isolado, fixado, embebido em parafina e depois incubado em solução de coloração com azul de toluidina a 1% durante 5 a 10 min à temperatura ambiente. Dez cortes foram enxaguados em água destilada, embebidos em etanol 95% por 5 a 30 min e desidratados em etanol 100%.

Após a desidratação, a fatia foi colocada em xilol e lamínula com meio resinoso. O número de neurônios nas regiões CA1, CA2 e giro denteado (DG) do hipocampo foi observado e analisado usando o programa de análise ImageJ.

Western blot para aprendizagem e proteínas relacionadas à memória

Western blot para proteínas relacionadas ao aprendizado e à memória foi realizado conforme descrito em nosso relatório anterior com algumas modificações (39).

Os tecidos do hipocampo foram homogeneizados com tampão RIPA (50 mmTris, 150 mM NaCl, 1% Triton-X-100, pH 7,0) contendo fluoreto de fenilmentanossulfonil (R&D Systems Inc., Minneapolis, EUA). Os homogenatos foram centrifugados a 12, 000 × g por 10 min a 4 graus.

As proteínas celulares foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF (Hybond TM-ECL; AmershamPharmacia Biotech, Inc.). As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% em PBS e 00,1% de Tween-20em temperatura ambiente.

Os blots foram então incubados com anticorpo primário: receptor anti-glutamato 1 (1:1000, Abcam, Inc., Nº de Catálogo: ab183797), anticorpo AntiNMDAR2B (1:1000, Abcam, Inc., Nº de Catálogo: ab28373), Anti-fosfo -Anticorpo CaMKII (1:1000, Abcam, Inc., Nº de Catálogo: ab171095), Anticorpo Antifosfo-CREB (1:1000, Abcam, Inc., Nº de Catálogo: 32096) ou anti-GAPDH (Santa Cruz Biotech, Inc., Nº de catálogo: sc-47724).

Em seguida, as membranas foram incubadas durante 1 h com um anticorpo secundário (Ig-G anti-coelho conjugado com HRP, 1:2000, Abcam, Inc. No. de Catálogo: ab205718). As membranas foram então lavadas três vezes durante 15 min usando TBS-T para remover o excesso de anticorpos antes da incubação por 1 min com reagentes quimioluminescentes (ECL, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, EUA).

Além disso, bandas imunorreativas foram detectadas por um sistema de análise em gel de eletroforese (GL2200 Pro, Crestream Inc. EUA). A intensidade das bandas foi analisada pelo software Image J. A quantidade de proteínas alvo foi normalizada pela expressão de GAPDH [39].

Análise estatística

O software SPSS 18.0 foi utilizado para análise estatística. Os dados são apresentados como a média±SEM. Os dados agrupados foram analisados ​​usando uma análise de variância unidirecional seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls. Um valor P <{3}} 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em nosso relatório anterior [35].

Resultados

Pressão arterial sistólica (PAS), frequência cardíaca e peso corporal entre SHR jovens e SHR idosos

Yong SHR apresentou PAS mais baixa nas primeiras duas semanas em comparação com SHR antigos, depois aumentou sem diferença entre os dois grupos nas últimas três semanas (fig. 2A).

Pelo contrário, a frequência cardíaca não apresentou diferença entre os dois grupos nas primeiras duas semanas, depois os SHR jovens aumentaram acentuadamente em comparação com os SHR idosos nas últimas três semanas (Fig. 2B). SHR jovens apresentaram menor peso corporal em comparação com SHR idosos durante todo o período de observação (Fig. 2C).

Parâmetros do labirinto aquático de Morris entre SHR jovens e SHR velhos

Para determinar a aprendizagem e a memória dependentes do hipocampo, foi realizado o experimento do labirinto aquático de Morris. SHR idosos apresentaram maior latência de escape nos primeiros quatro dias em comparação com SHR jovens (Fig. 3A).

Os tempos de cruzamento do quadrante alvo foram menores nos SHR velhos do que nos SHR jovens (Fig. 3B).

A porcentagem de tempo no quadrante da plataforma alvo foi menor em SHR idosos em comparação com SHR jovens (Fig. 3C). A porcentagem do comprimento do caminho no quadrante também foi menor nos SHR antigos em comparação com os SHR antigos (Fig. 3D). Esses resultados sugerem que SHR idosos apresentam comprometimento da função cognitiva.

Número de neurônios no hipocampo entre SHR jovens e SHR velhos

O número de neurônios em diferentes áreas do hipocampo foi contado pela coloração de Nissl. Os resultados mostraram que há um número menor de neurônios nas regiões CA1, CA2 e DG de SHR idosos em comparação com SHR jovens (Fig. 4).

Expressões de proteínas relacionadas à aprendizagem e à memória no hipocampo entre SHR jovens e SHR velhos

Os resultados do Western blot mostraram que a expressão de proteínas relacionadas ao aprendizado e à memória (GluR1, NMDAR 2B, CaMK II fosforilada e CREB fosforilada) no hipocampo SHR antigo foi menor do que no hipocampo SHR jovem (Fig. 5).

Efeito de Gao‑Zi‑Yao na PAS, frequência cardíaca e peso corporal em SHR idosos

O efeito de Gao-Zi-Yao na PAS foi analisado. O tratamento com uma dosagem baixa de Gao-Zi-Yao diminuiu acentuadamente a PAS em SHR idosos da segunda para a quarta semana em comparação com o grupo controle de SHR idosos, as dosagens médias e altas de Gao-Zi-Yao diminuíram acentuadamente a PAS em SHR idosos da primeira semana até a quarta semana em comparação com SHR antigos de controle (Fig. 6A). Estes resultados indicam que Gao-Zi-Yao exerce efeito anti-hipertensivo em SHR idosos.

Também comparamos os dados sobre os efeitos da frequência cardíaca e do peso corporal de Gao-Zi-Yaoon. Nossos dados demonstraram que não houve diferença significativa na frequência cardíaca e no peso corporal entre todos os grupos durante todo o período de observação (Fig. 6B, C).

Efeito de Gao‑Zi‑Yao nos níveis séricos de NO, IL‑1, IL‑2 e TNF‑ em SHR idosos

O tratamento com dosagens médias e altas de GAO-ZIYAO aumentou os níveis séricos de NO em comparação com os níveis do grupo controle SHR (Fig. 7A). O tratamento com todas as dosagens testadas de GAO-ZI-YAO reduziu os níveis séricos de IL-1, IL-2 em comparação com os níveis no grupo controle SHR (Fig. 7B, C); entretanto, apenas a dosagem elevada de GAO-ZI-YAO suprimiu os níveis séricos de TNF- (Fig. 7D).

Estes resultados demonstram que GAO-ZI-YAO pode regular o estresse oxidativo e a inflamação.

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