Flavonóides como agentes antivirais promissores contra a infecção por SARS-CoV-2: uma revisão mecanística

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Abstrato: Um coronavírus recém-diagnosticado em 2019(COVID-19) afetou todas as atividades humanas desde sua descoberta.Flavonóidescomumente encontrados na dieta humana têm atraído muita atenção devido às suas notáveis ​​atividades biológicas. Este artigo fornece uma revisão abrangente dos benefícios dos flavonóides na doença de COVID-19. Os efeitos previamente relatados de flavonóides em cinco vírus de RNA com manifestações clínicas semelhantes e/ou tratamentos farmacológicos, incluindo influenza, vírus da imunodeficiência humana (HIV), síndrome respiratória aguda grave (SARS), síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS) e Ebola, foram considerado. Os flavonóides atuam viaantiviralpropriedades, onde inibem diferentes estágios do ciclo infeccioso do vírus e efeitos indiretos quando modulam as respostas do hospedeiro à infecção viral e complicações subsequentes. Os flavonóides mostraram atividade antiviral através da inibição da protease viral, RNA polimerase, mRNA, replicação do vírus e infecciosidade. Os compostos também foram eficazes para a regulação de interferons, citocinas pró-inflamatórias e vias inflamatórias subcelulares, como fator nuclear-kB e quinases Jun N-terminais. Baicalina,quercetina, e seus derivados, hesperidina e catequinas são os flavonóides mais estudados a este respeito. Em conclusão, os flavonóides dietéticos são opções de tratamento promissoras contra a infecção por COVID-19; no entanto, investigações futuras são recomendadas para avaliar as propriedades antivirais desses compostos nesta doença.

Palavras-chave: inflamação; pulmão; Dano oxidativo; antiviral; polifenol

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1. Introdução

No final de 2019, uma pneumonia incomum foi relatada na China, que foi diagnosticada como um novo coronavírus (CoV) causando síndrome respiratória aguda grave (SARS) e foi chamada de COVID-19[1,2]. Mais tarde, o vírus (SARS-CoV-2) se espalhou para outros países e foi declarado uma pandemia pela OMS em 11 de março de 2020 [3]. ovírusé transmitido principalmente por gotículas respiratórias, e a gravidade varia de sintomas letais leves a graves. Os casos assintomáticos no período de incubação são considerados uma importante fonte de contágio [4]. Na maioria dos casos, os sintomas leves levam 1-2 semanas para serem resolvidos, enquanto os casos graves podem levar à morte [5].

SARS-CoV-2 afeta o sistema respiratório, causando febre e tosse seca [4]; no entanto, o vírus pode causar falência de órgãos, principalmente no coração e nos rins, além de causar tempestades de citocinas, que aumentam ainda mais a mortalidade. O ciclo de vida viral do SARS-CoV-2 inclui

fixação, penetração, biossíntese, maturação e liberação. Após a ligação, o RNA viral entra no núcleo da célula para replicação e o mRNA viral começa a gerar proteínas estruturais virais, incluindo as proteínas spike (S), membrana (M), envelope (E) e nucleocapsídeo (N). O receptor da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2), que é altamente expresso nos pulmões, também demonstrou atuar como co-receptor para SARS-CoV [7].

SARS, MERS e SARS-CoV-2 são todos RNA CoVs. O genoma do SARS-CoV-2 é 88% idêntico aos CoVs semelhantes às síndromes respiratórias agudas graves derivadas do morcego (SARS), 79% semelhante ao SARS-CoV e 50% semelhante ao MERS-CoV [8,9]. As proteínas SARS-CoV-2 são 90% -100% homólogas ao SARS-CoV; no entanto, orf10 e orf8 são diferentes entre SARS-CoV-2 e SARS-CoV. Orf8 é uma proteína acessória para CoVs. Ele forma uma proteína de hélice alfa de seis fitas que aumenta a capacidade de propagação do vírus.SARS-CoV-2 orfla/b, spike, envelope, membrana e nucleoproteína também estão intimamente relacionados aos do SARS-CoV [10] .

Como não há agente antiviral específico contra SARS-CoV-2, os medicamentos antivirais atualmente disponíveis são considerados para o tratamento de COVID-19. O remdesivir é um novo medicamento antiviral introduzido especificamente para o vírus Ebola em 2015. Ele tem um efeito inibitório na RNA polimerase viral e foi usado recentemente em alguns ensaios para o tratamento da COVID-19 [11]. O favipiravir tem um efeito inibitório sobre a gripe e o vírus Ebola com o mesmo mecanismo e também é avaliado no SARS-CoV-2 [12-14]. O lopinavir é um inibidor da protease viral e foi desenvolvido inicialmente para o tratamento do HV. Estudos in vitro mostraram um efeito inibitório do lopinavir em células infectadas por CoV [15,16]; no entanto, as revisões sistemáticas não mostraram nenhum efeito benéfico contra o SARS-CoV-2 [17].

As plantas medicinais têm sido uma fonte confiável de medicamentos naturais, incluindo agentes antivirais, desde os tempos antigos. A medicina tradicional e os estudos etnofarmacológicos de diferentes países do mundo sempre abriram novos caminhos para a descoberta de medicamentos [18-22]. O oseltamivir, que é um agente antiviral convencional, é um derivado do ácido chiquímico, um metabólito secundário do anis estrelado (Illicium verum Hook.f.). No caso do SARS-CoV-2, estudos in silico revelaram as possíveis propriedades antivirais dos ingredientes fitoterápicos [23-25]. Os flavonóides são uma grande classe de fitoquímicos comumente encontrados em vários alimentos e vegetais na dieta humana com inúmeras atividades farmacológicas valiosas, incluindo propriedades antivirais. Está demonstrado que esses compostos podem inibir a patogênese viral, visando estágios essenciais do ciclo de vida viral [26]. Quercetina, catequinas, kaempferol e baicaleína são exemplos dos flavonóides mais importantes que exibem propriedades antivirais [18,27,28]. Este estudo visa discutir as evidências antivirais disponíveis de flavonóides como um possível tratamento contra SARS-CoV-2 considerando os efeitos previamente relatados desses compostos em cinco vírus de RNA com manifestações clínicas e/ou tratamentos farmacológicos semelhantes, incluindo influenza, vírus da imunodeficiência humana (HIV), síndrome respiratória aguda grave (SARS), síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS) e Ebola.

2. Resultados

Atividade antiviraldos flavonóides podem ser categorizados em efeitos antivirais diretos onde o vírus é diretamente afetado pelo flavonóide e efeitos indiretos onde o flavonóide melhora os mecanismos de defesa do hospedeiro contra a infecção viral. Aqui, os mecanismos antivirais subjacentes dos flavonóides são discutidos com referência aos flavonóides mais importantes que demonstram esses mecanismos.

2.1. Mecanismos Antivirais Diretos

2.1.1. Inibição da Protease Viral

As proteases virais são usadas para clivar os precursores de poliproteínas virais em determinados locais para liberar proteínas funcionais. Proteases virais específicas também mostraram clivar proteínas da célula hospedeira, incluindo fatores de iniciação da tradução (eF4 e elF3d) no HIV, para evitar a tradução da proteína hospedeira [29,30]. Os coronavírus geram três tipos de proteases virais, incluindo 3-cisteína semelhante à quimotripsina (3CLpro), protease semelhante à papaína (PLpro) e protease principal (M pro)[31].3CLpro é importante para a vida do SARS-CoV ciclo, PLpro desempenha um papel na replicação de SARS-CoV-2, e Mopar é responsável pela maturação de proteínas funcionais em SARS-CoV-2 [32,33]. Como resultado, essas moléculas são alvos de medicamentos adequados na pesquisa antiviral e na descoberta de medicamentos [34].

Kaempferol, que é um flavonóide abundante em vários alimentos, diminuiu o CPE em células Vero E6 infectadas com isolados clínicos de SARS-CoV-2 com cerca de 88% de inibição na concentração de 125 μM. Uma investigação acoplada in silico sugere que a inibição da enzima SARS-CoV-2 3CLpro seja o principal mecanismo de ação [35]. A adição de kaempferol a 3CLpro e PLpro de SARS-CoV e MERS-CoV expressos em E.coli causou efeitos antivirais por meio da inibição dessas enzimas [36]. Park e colaboradores (2017) mostraram que a presença do grupo hidroxila no kaempferol causa uma atividade antiviral mais potente através da inibição de 3CLpro e PLpro [37]. Epigalocatequina galato (EGCG) é um flavonóide encontrado no chá (Camellia sinensis L.) com propriedades antifúngicas, antibacterianas e antivirais [38,39]. Estudos indicaram que EGCG inibe a atividade de transcriptase reversa (RT), atividade de protease, p24, entrada viral e produção viral em células THP-1 e H9 infectadas com HIV-1, e a modificação de lipossomas de EGCG amplificou seu efeito inibitório efeitos. Os estudos sem células também mostraram uma regulação negativa significativa na cinética da protease após o tratamento com EGCG. O grupo galloil no EGCG é considerado responsável por suas atividades antibacterianas e antivirais [40]. A isoliquiritigenina, uma chalcona, pode ser usada como agente terapêutico em infecções bacterianas e virais [41]. Este composto mostrou um efeito inibitório sobre SARS-CoV, e MERS-CoV 3CLpro e PLpro expressos em E.coli. A presença de um grupo funcional prenil no anel resorcinol permite a formação de interações hidrofóbicas com proteases [37]. As teaflavinas são polifenóis encontrados em vários tipos de chá [42]. Experimentos com a protease recombinante SARS-CoV mostraram uma redução significativa na atividade de 3CLpro após o tratamento com teaflavina-3,3'-digalato com um valor de IC50 de 9,5 uM. O grupo galato ligado à posição 3' em algumas teaflavinas pode ser essencial para a interação com o sítio proativo 3CL [43]. Prenilisoflavonóides extraídos de Erythrina senegalensis DC. foram usados ​​para avaliar a atividade anti-protease contra a protease recombinante do HIV-1. Os resultados mostraram que os compostos podem inibir a protease recombinante do HIV-1 in vitro com valores de 0,5 a 30 μMIC50. Grupos hidroxi e prenil podem ser responsáveis ​​pela inibição da protease do HIV [44]. A quercetina e a quercetina- -galactosídeos reduziram a atividade de PLpro, 3CLpro, deubiquitinação e DelSGylation em SARS-CoV, MERS-CoV e HIV-1. A posição dos grupos hidroxila pode ser efetiva na atividade anti-protease. A quercetina com cinco grupos hidroxila nas posições 3,5,7,3' e 4' exibiu um forte efeito inibitório nas proteases virais; enquanto a presença do grupo glicosil nas posições 3,7A'reduziu o efeito inibitório [37,45].

2.1.2. Inibição da RNA polimerase viral e mRNA viral

A RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) é uma importante enzima que catalisa a replicação do RNA a partir de uma sequência de RNA [46]. Esta enzima é codificada em todos os vírus de RNA, bem como em alguns eucariotos [47]. Os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios, ou seja, eles não podem sobreviver independentemente fora das células. Eles devem usar equipamentos de tradução celular para traduzir mRNAs para produção de proteínas, o que é necessário para a replicação. Assim, qualquer interferência na tradução do mRNA inibiria a replicação, disseminação e evolução viral [48].

Uma investigação recente de Zandi et al. revelaram o efeito antiviral in vitro da baicalina e da baicaleína contra a infecção por SARS-CoV-2 na linhagem celular Vero CCL-81 através da inibição de RdRp, com maior potência pela baicaleína. Outras avaliações in silico mostraram que esses dois compostos têm uma afinidade maior para RdRp em comparação com a reentrega: O local de ligação da baicalina e da baicaleína também parece ser diferente do remdesivir; assim, esses flavonóides podem ser usados ​​como tratamento adjuvante junto com o remdesivir [49]. Os efeitos da quercetina-7-O-glicosídeo(Q7G) foram avaliados em um estudo in vitro em células MDCK infectadas com os vírus influenza A e B em comparação com o agente antiviral padrão oseltamivir. O oseltamivir foi usado como medicamento controlado e apresentou atividade antiviral moderada com valores de IC50 de 25,4 a 42,2 ug/mL; enquanto Q7G inibiu os vírus influenza A e B com valores de IC50 de 3,10 ug/mL a 8,19 ug/mL. O oseltamivir também mostrou uma atividade mais fraca contra influenza B do que influenza A; enquanto o Q7G demonstrou forte atividade contra todos os vírus influenza. Além disso, ensaios de PCR quantitativos relataram uma maior diminuição na síntese de RNA viral após o tratamento com Q7G em comparação com oseltamivir, indicando o efeito inibitório de Q7G na RNA polimerase viral. A análise de docking molecular revelou que essa interação se deve à ligação de Q7G à subunidade PB2 da RNA polimerase viral [50].

Oroxylin A(OA) é um flavonóide encontrado em Oroxylum Indicum(L.)Kurz. Foi demonstrado que a OA pode inibir várias cepas de influenza A em células MDCK de maneira dose-dependente. O tratamento oral de camundongos infectados com o vírus influenza H1N1 com OA também diminuiu a morte induzida pelo vírus, perda de peso corporal e lesão pulmonar, com uma taxa de sobrevivência de 60,0 por cento na dose diária de 100 mg/kg. Os efeitos antivirais da OA foram relatados como sendo devidos à regulação negativa da transcrição de H1N1 matrix1(M1)mRNA e síntese de proteínas (em et al. 2018). A proteína M1 é uma proteína dentro do envelope viral que se liga ao RNA viral e pode mediar a encapsidação de núcleos de nucleoproteínas de RNA no envelope da membrana [51]. Embora a OA possa inibir a síntese de proteínas, ela não pode bloquear a entrada viral na célula hospedeira ou a entrada da nucleoproteína (NP) no núcleo da célula hospedeira [52]. A baicalina e a biochanina A podem inibir a infecção por influenza H5N1 em células A549 com valores de IC50 de 18,79 e 8,92 μM, respectivamente. Este efeito foi mediado pela supressão da exportação de ribonucleoproteína viral nuclear (RNP) [53]. Outros estudos também mostraram que a baicalina pode regular negativamente a expressão da proteína M1 da influenza [54,55].

O hospedeiro cdc2-como a quinase 1(CLK1) tem um papel fundamental no splicing do gene M2 do vírus influenza H1N1 e é um importante alvo anti-influenza. M2 é um canal de prótons no envelope viral do vírus influenza A [56,57]. Foi demonstrado que galocatequina-7-galato isolado de Pithecellobium clypearia é um inibidor da cdc2-como quinase 1 (CLK1), um alvo anti-influenza devido ao seu papel no splicing alternativo de mRNA de M2 ​​viral. Investigações sobre o efeito da galocatequina-7-galato na dose diária de 30 mg/kg em camundongos ICR infectados com o vírus H1N1 mostraram uma sobrevida significativamente maior até 8 dias. Também inibiu lesão pulmonar aguda induzida por vírus e perda de peso. Além disso, as avaliações em células A549 infectadas com H1N1-demonstraram uma regulação negativa significativa de NP viral e mRNAs M2. Além disso, a fosforilação dos fatores de splicing SF2/ASF e SC35, fatores-chave para o splicing alternativo do gene M2 do vírus, foi significativamente diminuída após o tratamento com galocatequina -7-galato [58]. Cirsimaritina (CST), um flavonóide de Artemisia scoparia Waldst. e Kitam foi avaliado quanto aos seus efeitos antivirais in vitro em células MDCK e THP{31}} infectadas com três cepas de vírus influenza que apresentaram valores de IC50 variando de 5,8 a 11,1 ug/mL, comparado com 3,4 a 8,9 ug/mL para ribavirina. Os dados demonstraram que a CST pode reduzir efetivamente a expressão de influenza M2 e de proteínas de maneira dose-dependente, de modo que a potência da CST a 20 ug/mL foi superior a 10 uM da ribavirina antiviral padrão [59]. A luteolina é outro flavonóide com efeito inibitório na expressão de M2mRNA. Em células MDCK infectadas com diferentes cepas de influenza, 15 μM de luteolina foi mais eficaz do que 10 μM de oseltamivir em células infectadas com H1N1 e H2N3. A luteolina também diminuiu a expressão da proteína de revestimento do vírus influenza (COPI), mediando a entrada do vírus e a via endocítica, em células infectadas [60]. Santin é um flavonóide extraído de Artemisia rupestris L., que também foi sugerido por ter efeitos anti-vírus da gripe através da supressão da expressão de mRNA de M2 ​​de maneira dose-dependente [61].

Foi indicado que a quercetina poderia ser um provável agente terapêutico contra a infecção por influenza nos estágios iniciais da infecção para que possa ser usada na profilaxia do vírus influenza. Investigações sobre os efeitos da quercetina em células MDCK e A549 infectadas com cepas do vírus influenza A revelaram que ela poderia inibir o mRNA de NP viral de maneira dose-dependente, com a maior atividade na concentração de 50 μM 【62】.

A pesquisa mostrou que a tricina(4'5,7-triidroxi-3',5'-dimetoxiflavona) exibe atividades antivirais contra as cepas de influenza A e B. Testes de RT-PCR indicaram que a tricina pode suprimir a síntese de mRNA da proteína M em células MDCK infectadas com vírus influenza; sem efeitos significativos na biossíntese de neuraminidase e hemaglutinina. A concentração efetiva de 50 por cento de tricina, que pode inibir a síntese de mRNA viral, foi de 3.4-10 uM

para as cepas do vírus influenza A e 4,9 μM para o vírus influenza B. Em camundongos infectados com o vírus da gripe, a tricina com uma dose de 20 ug/kg melhorou a perda de peso corporal e o tempo de sobrevivência [63].

2.1.3. Entrada viral, replicação e infecciosidade

Os vírus de RNA codificam proteínas utilizando a maquinaria celular do hospedeiro para o seu ciclo de vida. Compreender essas necessidades das células hospedeiras não apenas nos informa sobre as vias moleculares usadas pelo vírus, mas também apresenta alvos adicionais para o desenvolvimento de medicamentos [64].

Um estudo in vitro avaliou o efeito da quercetina e isorhamnetina em SARS-CoV-2entrada em células ACE2h. O ACE2 expresso nas células pulmonares é um co-receptor da proteína de pico viral e, portanto, é o principal alvo dos agentes antivirais contra o SARS-CoV-2. Observou-se que esses dois flavonóides têm uma alta afinidade de ligação ao ACE2 e, posteriormente, diminuem a entrada viral através da inibição da ligação da proteína spike a esse receptor [65]. Outro estudo avaliou o efeito da baicaleína na infecção por SARS-CoV-2 em células Vero E6 e camundongos transgênicos hACE2. Uma redução significativa foi observada na replicação viral in vitro e in vivo, bem como perda de peso corporal e lesão pulmonar em animais [66]. Dihidroxi-6'-metoxi-3',5'-dimetilchalcona e miricetina-3'5'-dimetil éter 3-O- -D-galactopiranosídeo são flavonóides derivado de Cleistocalyx operculate(Roxb.) Merry. e LM Perry. O ensaio de redução do efeito citopático (CPE) mostrou que esses flavonóides inibem a replicação viral do vírus influenza H1N1 em células MDCK. Estudos de relação estrutura-atividade (SAR) indicaram que grupos OH em C-7 e C-4, uma ligação dupla entre C-2 e C-3, e especialmente um grupo carbonila na posição C-4, são grupos funcionais críticos que melhoram significativamente as propriedades antivirais dos flavonóides [67].3-desoxisappanchalcone (3DSC) isolado de Caesalpinia sappan L. poderia inibir a replicação do vírus influenza em altas concentrações via inibição da expressão de NP viral em células MDCK infectadas com o vírus H1N1. Em uma concentração igual (30 uM), tanto a ribavirina quanto o 3DSC mostraram inibição significativa da expressão de NP, embora a ribavirina tenha um efeito mais forte [68]. Estudos demonstraram que a biochanina A e a baicaleína inibiram a ativação da caspase-3, uma enzima envolvida na replicação viral [53,69]. Esses compostos também podem inibir a exportação nuclear de complexos RNP virais, o que é crítico na replicação viral [53]. A biochanina A mostrou um efeito inibitório contra p38 ativado por mitógeno e NF-kB, que mostraram estar envolvidos na replicação viral. NF kB e p38 são ativados devido ao estresse oxidativo e são conhecidos por afetar a replicação e patologia do vírus influenza A [53,70]. Investigações em culturas celulares de células MDCK e células A549 infectadas com o vírus influenza mostraram que a baicaleína pode inibir a replicação viral em concentrações de 20-80 ug/mL. Curiosamente, a baicalina mostrou atividade antiviral semelhante à ribavirina e oseltamivir nas concentrações de 40 ug/mL e 60 ug/mL, respectivamente. A baicalina também inibiu a replicação viral nos pulmões de camundongos in vivo[71]. CST mostrou regular negativamente a proteína NF-kB e a fosforilação de NF-KB no núcleo [59]. Já se sabe que o NF-KB tem um papel importante nainflamação, estresse oxidativo, e supressão da imunidade do hospedeiro [72]. A regulação negativa do NF-kB também inibe a replicação em vários tipos de vírus, incluindo o vírus influenza [73].

Em células Vero E6 infectadas com SARS-CoV-2, a naringenina pode inibir o CPE de maneira dependente do tempo e da concentração. Este efeito foi mediado através da inibição de canais endolisossomais de dois poros (TPCs), uma via que envolve a infectividade do SARS-CoV-2, Ebola e MERS, facilitando a entrada viral [74]. EGCG mostrou um efeito inibitório dependente da dose （25,50 μM） na replicação do HIV em células T; no entanto, a inibição da replicação viral não foi diretamente afetada pela inibição da RT. Fassina et al. analisaram a enzima p24, que está envolvida no empacotamento de partículas virais. Os resultados mostraram uma regulação negativa da concentração de p24 e atividade de RT em linfoblastos T infectados pelo HIV. Com base nos seguintes resultados, notou-se que o EGCG inibiu a replicação viral através da regulação negativa da infecção viral. Ainda não há certeza sobre o efeito exato da infecção viral por EGCGon [75]. A sinalização gp120 é comumente associada ao aumento da replicação do HIV{19}} em células previamente infectadas[75]. Estudos mostram o efeito inibitório da genisteína na gp120 e, posteriormente, na replicação viral do HV-1. Não houve alteração na replicação viral após a administração

stração de genisteína com uma concentração de {{0}},5 ug/mL, mas em uma faixa de 5-10 ug/mL, genisteína poderia suprimir a replicação viral [76]. Herbacitrin é um flavonóide derivado de Drosera peltata Thunb. e era anteriormente conhecido como um agente antiviral. Foi demonstrado que a herbacitrina inibe tanto a RT quanto a integrase em culturas de células MT-4 e MT-2 infectadas com HIV, resultando no bloqueio da replicação viral em diferentes estágios. Em uma concentração de 21,5 ug/M, a herbacitrina poderia suprimir a atividade R, enquanto poderia inibir a integrase em uma concentração mais baixa, 2,15 uM [77]. A escutelarina purificada de Erigeron breviscapus é um flavonóide com atividade anti-HIV-1. Este flavonóide inibiu a atividade de RT do HIV-1 e a fusão celular como principais participantes da replicação viral [Z8]. Hesperidina e linarina são flavonóides com rutinose no anel A e substituição de metoxi (-OCH3) no anel B. A isoquercetina demonstrou inibir a replicação do vírus influenza A e B em células MDCK infectadas. A combinação de isoquercetina com amantadina também mostrou efeito sinérgico na replicação viral em células MDCK infectadas com vírus influenza A apenas em baixas doses (0,5 uM para isoquercetina e 1 uM para amantadina). Os valores dos títulos de vírus após a administração de isoquercetina e amantadina foram cerca de 7,5; o aumento das concentrações de isoquercetina e amantadina reduziu o efeito sinérgico nos títulos de vírus para o valor de 5 [79]. O Q3R derivado de Houttuynia cordata exerce efeitos anti-vírus da gripe. Os efeitos do Q3R nas células MDCK infectadas com o vírus influenza A foram comparados ao oseltamivir. Lesões pulmonares e edema foram inibidos pelo Q3R mais do que pelo oseltamivir. O Q3R também teve uma eficácia maior em comparação com o oseltamivir. O efeito inibitório do Q3R na replicação do vírus influenza foi indireto e por meio da interação com partículas virais. O oseltamivir demonstrou atividade antiviral moderada, cerca de 58% contra o vírus influenza A, e atividade antiviral fraca inferior a 49% com doses abaixo de 10 ug/mL; enquanto Q3R mostrou 86 por cento de inibição viral em 100 ug/mL e 66 por cento de inibição em concentrações de 10 ug/mL [80]. A quercetina 3- -OD-Glucoside(Q3G) mostrou prevenir a replicação do vírus Ebola in vitro. A administração profilática de Q3G 30 min antes da infecção mostrou prevenção significativa do vírus Ebola. O Q3G também pode inibir a entrada viral nos estágios iniciais. Portanto, o O3G pode ser um flavonóide eficaz para a profilaxia do vírus Ebola [81].

2.2. Efeitos Antivirais Indiretos

2.2.1. Efeito sobre os interferons

Os interferons (IFNs) compreendem um grupo de proteínas produzidas por várias células imunes em resposta a muitos patógenos, como vírus, parasitas, bactérias e células tumorais. Existem três classes principais de IFNs, incluindo o tipo I ou interferons estáveis ​​ao ácido (subtipos IFN-, IFN-, IFN-K, IFN-e, IFN-w e IFN-t), tipo II (IFN-y), e IFNs do tipo III que são conhecidos como IFN-λ 【82-84】. Eles mostram uma ampla gama de atividades biológicas como a ativação da resposta imune inata, aumentando a expressão de moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), suprimindo a angiogênese. Seu papel mais importante é interferir nas infecções virais [84,85].

Nas fases iniciais da infecção viral, os IFNs ativam asistema imunológico. Estudos recentes relataram uma diminuição na indução e sinalização de IFN tipo I e tipo I em pacientes com COVID-19 [86]. Esses tipos de IFN demonstraram efeitos antivirais por diminuir a imigração de neutrófilos para o local da inflamação, aumentar a apresentação de antígenos, suprimir a pró-inflamação mediada por macrófagos mononucleares e ativar a imunidade adquirida para a progressão das respostas de células B e T antígeno-específicas. 86-90]. Assim, o uso de IFNs na fase inicial da doença pode diminuir os sintomas de COVID-19 reduzindo a replicação viral. Os pesquisadores também relataram que os níveis de IFN- podem aumentar em pacientes com COVID-19 com SDRA. O rápido aumento nos níveis de IFNs pode atrair citocinas pró-inflamatórias para o tecido alveolar e resultar em inflamação pulmonar e lesão pulmonar [90,91]. Portanto, parece que tanto a regulação positiva quanto a desregulação de IFNs e outras respostas de citocinas pró-inflamatórias ou ambas podem exercer um papel significativo na progressão e nas características patológicas do SARS-CoV-2.

Deixe al. investigar os efeitos anti-influenza da baicalina, uma glicosiloxiflavona que é o 7-O-glicuronídeo da baicaleína, no modelo in vitro e in vivo de infecção pelo vírus influenza A. O fator 6 associado ao receptor de TNF (TRAF6) é um mediador eficaz na via de sinalização de produção de IFN. A superexpressão de TRAF6 leva ao aumento da produção de IFN tipo I [54]. MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas que controlam a regulação gênica pós-transcricional [92]. O miR-146a demonstrou ter um papel regulador na inflamação [93]. miR-146a poderia melhorar a replicação de H1N1 e H3N2 através da regulação negativa de TRAF6. A baicalina (20 ug/mL) indicou uma redução significativa na expressão de miR{20}}a, NP viral, níveis de proteína Ml, título viral e também aumentou a taxa de sobrevivência de camundongos [54]. Em outro estudo, Nayak e colegas representaram a atividade do vírus anti-influenza (H1N1-pdm09) da baicalina através da regulação da proteína viral NS1, resultando na regulação positiva do fator regulador do interferon 3（IRF-3）, IFN - e IFN-. Esta regulação positiva de IFN diminuiu a replicação viral que poderia reduzir os transcritos virais e a expressão de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-8 e TNF-x [55].

Ding et ai. projetaram um estudo para investigar os efeitos da hesperidina, um glicosídeo flavanona, na lesão pulmonar induzida pelo vírus influenza A (H1N1) em ratos machos. Os resultados mostraram que a hesperidina atenuou a lesão pulmonar por meio da diminuição da produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IFN-, TNF-x e IL-6, suprimindo as vias de sinalização MAPK. A hesperidina também diminuiu o IFN- nas células endoteliais microvasculares pulmonares infectadas com H1N1 [94]. Em outro estudo de Kim et al. A isoquercetina atenuou efetivamente a lesão pulmonar induzida pelo vírus H1N1 em camundongos por meio da redução de IFN-,iNOS, RANTES, títulos de vírus, bronquite viral e bronquiolite [79].

A oroxilina A (OA) de Oroxylum Indicum(L.)Kurz preveniu a lesão pulmonar induzida pelo vírus influenza A H1NI em camundongos através da regulação positiva de IFN- e IFN- 【52】. Wogonin, outro flavonóide isolado de Scutellaria baicalensis Georgi, exibiu uma atividade anti-influenza significativa pela regulação das vias AMPK. Wogonin também aumentou a regulação de moléculas a jusante de IFN-, IFN-λl e IFN, incluindo o gene de resistência a mixovírus A (MxA) e 2-5' oligoadenilato sintetase (OAS), em células infectadas com MDCK e A549 [95].

2.2.2. Efeito nas citocinas pró-inflamatórias (TNF, IL e MCP)

Os CoVs contêm alguns quadros de leitura abertos que codificam algumas proteínas acessórias. Essas proteínas acessórias demonstraram modular vias inflamatórias, como sinalização de IFN e citocinas pró-inflamatórias [96]. Foi elucidado que o prognóstico da COVID-19 pode ser agravado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucinas, IFNy e TNF- [97]. Blanco-Mello et al. indicaram que a resposta imune inadequada pode ajudar na replicação do vírus e complicações devido a tipos graves de COVID-19 [98]. Ruan et al. também mostraram que uma elevação em citocinas inflamatórias como IL-6 está associada a SDRA, insuficiência respiratória e desfechos clínicos adversos [99]. A insuficiência respiratória causada por lesão pulmonar é resultado da superprodução de citocinas pró-inflamatórias após a infiltração de células imunes no pulmão [100]. A tempestade de citocinas é uma resposta inflamatória sistêmica associada a uma ampla gama de fatores, como infecções e certos medicamentos. Vários estudos mostraram uma conexão significativa entre a tempestade de citocinas, inflamação grave e falência múltipla de órgãos em pacientes com COVID-19 [101-103]. O reconhecimento do vírus SARS-CoV-2 com sistemas imunológicos inatos e adaptativos pode resultar na ativação e produção de citocinas inflamatórias. De acordo com estudos recentes, os níveis plasmáticos de citocinas pró-inflamatórias são aumentados em pacientes com COVID{18}}. Essas citocinas inflamatórias como TNF- , IL6, IL 2, IL-1 , IL7, IL 10 e IL-18, bem como proteína quimioatrativa de monócitos-1(MCP-1 ), têm papéis fundamentais na progressão patológica e gravidade do COVID-19 por meio de um aumento na carga viral, pneumonia, danos pulmonares, distúrbios neurológicos e mortalidade [97,101].

Esses eventos podem levar à falência de múltiplos órgãos e lesão pulmonar como principal complicação do SARS-CoV-2; portanto, a modulação de citocinas pró-inflamatórias pode ser considerada uma meta razoável de tratamento na COVID-19. Além disso, efeitos anti-inflamatórios significativos dos flavonóides foram demonstrados em muitos estudos; assim, eles podem ser compostos promissores no combate às complicações relacionadas à inflamação do COVID-19 [97].

Yang et ai. comprovou o efeito protetor da 3-desoxisappanchalcone （30 μM） na inflamação induzida pelo vírus influenza H1N1 in vitro e apoptose, diminuindo os níveis de IL-1 e IL-6 [68]. Baicaleína, uma flavona, e biochanina A, uma isoflavona O-metilada, reduziram a expressão de citocinas pró-inflamatórias em células A549 e macrófagos derivados de monócitos humanos primários (MDM) infectados com cepas do vírus influenza H5N1, o que poderia prevenir a ativação da via inflamatória e danos nos tecidos [53]. Em células A549 e MDCK infectadas com influenza A, a baicalina, a forma glicosilada da baicaleína (baicaleína-7-glicuronídeo), pode aumentar os níveis de IFN, resultando em uma redução da produção de citocinas pró-inflamatórias. Assim, IL-8 e TNF- foram significativamente menores em células tratadas com baicalina em comparação com as células de controle não tratadas [55].

Um estudo in vitro mostrou que concentrações de 2,5, 5 e 10 ug/mL de CST, uma dimetoxiflavona, têm um efeito significativo na atenuação da via de transdução de sinal NF-kB em células THP-1 infectadas com influenza A (H1N1). Após a inibição de NF-kB, a produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo I-1 , IL-8, IL-10 e TNF- , bem como a proteína COX relacionada à inflamação{{ 15}}, foram suprimidos pela CST de maneira dose-dependente[59]. Em um estudo in vitro realizado por Yonekawa et al. sobre as propriedades antivirais da hesperidina e da linarina, esses glicosídeos flavonóides inibiram a replicação viral R5-HIV-1-NL(AD8) em células CD4 mais NKT, aumentando a produção de citocinas anti-inflamatórias, incluindo IL-2, IL-5 e IL-13. Observou-se que o efeito estimulador desses dois flavonóides é criticamente dependente da fração de açúcar, já que as agliconas (hesperetina e acacetina) não apresentaram tal atividade. Além disso, a substituição de metoxi(-OCH3) no anel B é essencial para a atividade estimuladora de hesperidina e linarina em células CD4 mais NKT. Eles também podem induzir a secreção de RANTES, MIP-1 e MIP-1 de V61 mais receptores de células T expressando que subsequentemente suprimiram a replicação viral em células CD4 mais NKT[104]. Kang et ai. relataram efeitos anti-influenza de flavonóides purificados de Pithecellobium clypearia Benth no modelo in vitro de infecção pelo vírus influenza A. Esses flavonóides purificados suprimiram a produção de IL-6 e MCP-1 em células pulmonares A549 humanas infectadas com H1N1-[105]. Mehrbod et ai. investigaram o efeito anti-inflamatório da quercetina-3-O- -L-ramnopiranosídeo(Q3R), uma flavona glicosilada, em células MDCK infectadas com o vírus influenza H1N1. Q3R na concentração de 150 ug/mL diminuiu significativamente o título do vírus e aumentou a produção de IL-27, o que poderia elevar ainda mais a secreção de IL-10 por células T CD4 mais e aumentar sua atividade antiviral. Por outro lado, o O3R suprimiu a produção de TNF como um dos importantes mediadores inflamatórios causadores de febre e desencadeando a via pró-inflamatória de NF-kB, piorando ainda mais a condição dos pacientes [106]. A trimetoxiflavona Santin demonstrou atividade anti-influenza em células THP-1 e MDCK em uma concentração de 60 μM. O vírus influenza A（H3N2） induz a produção de citocinas pró-inflamatórias em células THP-1 resultando em inflamação e lesão pulmonar [61]. As citocinas anti-inflamatórias também podem ser alteradas durante a infecção pelo vírus influenza. A IL-10 é uma citocina anti-inflamatória que pode ser induzida pelo vírus influenza. A IL-10 inibe as células T natural killer invariantes ao regular negativamente a produção de IL-12 por células dendríticas derivadas de monócitos pulmonares[107]. Os níveis de IL-6, IL-8, IL-10, IL-1 e TNF- foram significativamente diminuídos no grupo tratado com Santin através da regulação negativa de MAPKs e NF- kB vias de sinalização [61].

Além do acima, galocatequina-7-galato, genisteína e teaflavinas são outros flavonóides com efeitos moduladores na produção de citocinas pró-inflamatórias [58,76,108]; assim, essas moléculas parecem ter um efeito anti-inflamatório desejável, útil no controle da inflamação relacionada à infecção viral.

2.2.3. Efeito nas Vias Inflamatórias Subcelulares (NF-kB, PI3K/Akt e MAPK/JNK)

Quando um vírus entra em uma célula hospedeira, a célula hospedeira reconhece sua replicação por meio de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs)[109]. A estrutura do RNA do vírus está envolvida na oligomerização de PRRs e na ativação de fatores de transcrição a jusante, em particular, fatores reguladores de interferon (IRF) e NF-kB. A ativação de NF-kB e IRFs leva ao engajamento da defesa antiviral celular pela indução de interferons tipo I e I e secreção de quimiocinas [110].

Chiou et al. investigaram os efeitos do 8-prenylkaempferol(8-PK) em células A549 infectadas com o vírus influenza A (H1N1). Os resultados mostraram que interferir na via PI3K-Akt é o principal mecanismo de 8-PK levando a efeitos protetores contra o vírus influenza A.8-PK diminuiu a translocação nuclear de NF-kB e IRF-3 através da atenuação da fosforilação de Akt e atividade de PI3K. Finalmente, com produção reduzida de ativação regulada, células T normais expressas e secretadas (RANTES) através de células A549 infectadas por H1N1-[111]. Zhu et ai. representou que a autofagia induzida pelo vírus influenza A (H3N2) nas células infectadas A549 e Ana{20}} através da supressão da via de sinalização mTOR. A baicalina pode aumentar a fosforilação do mTOR e resgatar os efeitos do vírus H3N2 de maneira dose-dependente [112]. Em outro estudo, verificou-se que a baicalina exerce atividade anti-vírus da gripe (H1N1-pdm09) pela regulação negativa da via PI3k/Akt causada pela modulação da expressão da proteína viral NS1 55]. Além disso, a biochanina A, uma isoflavona O-metilada, indicou efeitos protetores em células infectadas pelo vírus H5N1 influenza A através da diminuição da fosforilação de AKT, ERK1/2, JNK e p38. Também pode modular as vias de sinalização celular, diminuir IL-6, IL-8, CXCL10(IP-10), TNF- e melhorar os níveis de IkB [53].

A CST representou efeitos inibitórios no modelo in vitro de infecção pelo vírus influenza A através da inibição da via de sinal NF-kB/p65, resultando na regulação negativa de citocinas pró-inflamatórias. CST também diminuiu os níveis de fosfo-p38 MAPK e fosfo-JNK [59]. Em outro estudo de Ding et al., a administração de hesperidina nas doses diárias de 200 e 500 mg/kg por cinco dias pode inibir a inflamação pulmonar na lesão pulmonar induzida pelo vírus influenza A (H1N1) em ratos. Esse efeito foi mediado pela atenuação da produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6 e TNF-. A hesperidina também diminuiu a expressão de IL-6 e TNF- em células endoteliais microvasculares pulmonares infectadas por H1N1 através da inibição das vias de sinalização MAPK [94]. Além disso, estudos sugeriram a via de sinalização ERK como o principal modulador da via de sinalização MAPK. Isorham-netin （50 μM）, uma monometoxiflavona, diminuiu a fosforilação de ERK em células MDCK após infecção pelo vírus influenza A (H1N1) [113]. Jeong e colegas investigaram os efeitos citotóxicos da piroxilina A e tectorigenina nas células CHME5 e macrófagos humanos primários infectados com HIV-1-D3. Esses flavonóides exercem seus efeitos através da redução da fosforilação de PI3K, Akt, mTOR, PDK1, GSK-3 e Bad nas células tratadas com lipopolissacarídeo/cicloheximida Santin suprimiu a replicação do vírus influenza A no MDCK e THP-1 células infectadas [114]. Na concentração de 60 uM, Santin atenuou a fosforilação de p38 MAPK, ERK, JNK/SAPK e NF-kB[61].