Determinação de cinco componentes em Rehmannia Glutinosa e estabelecimento de impressão digital por HPLC

Resumo:O método de determinação do conteúdo de cinco componentes emRehmannia glutinosa, a saber,remanosídeo D, leonurina,equinacósido,cistanchesida Aeverbascosídeo, foi estabelecida, e a impressão digital de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de Rehmannia glutinosa foi estabelecida para fornecer uma base científica para o controle de qualidade de Rehmannia glutinosa. Foi utilizada a coluna Shiseido CAPCELL PAK C18, com solução de acetonitrila-00,1% de ácido fórmico como fase móvel, eluição gradiente, temperatura da coluna de 30 graus, determinação de comprimento de onda variável e vazão de 1,0. mL/min. A impressão digital HPLC de Rehmannia glutinosa foi analisada pelo "Sistema de avaliação de similaridade de impressões digitais cromatográficas da medicina chinesa (2012 Edition)" software to evaluate its quality consistency. The results showed that according to the established content determination method, the five components had a good linear relationship within their respective concentration ranges (R2>{{0}}.999 0), o RSD do teste de precisão, teste de repetibilidade e teste de estabilidade foi de 0,12%~1,58%, e a taxa média de recuperação de amostra foi de 96,5% ~98,6%; a impressão digital de HPLC de Rehmannia glutinosa estabelecida identificou 23 picos comuns, e a semelhança entre a amostra de Rehmannia glutinosa e a impressão digital de controle foi de 0,904~0,950. Os resultados sugerem que o método de determinação de conteúdo estabelecido e a impressão digital por HPLC são adequados para a avaliação da qualidade de Rehmannia glutinosa e a identificação de Rehmannia glutinosa crua e Rehmannia glutinosa cozida, com alta precisão e boa reprodutibilidade, podendo fornecer suporte técnico para o controle de qualidade de Materiais medicinais de Rehmannia glutinosa.

Palavras-chave:Rehmannia glutinosa; determinação de conteúdo; impressão digital; avaliação de qualidade

NOVA ERVA CISTANCHE COMEQUINACOSÍDEO,CISTANCHESIDE AEVERBASCÓSIDO

Rehmannia glutinosaé o tubérculo de raiz fresco ou seco da planta Scrophulariaceae Rehmannia glutinosa Libosch. Devido aos diferentes métodos de processamento, é dividido principalmente em rehmannia fresca, rehmannia crua e rehmannia cozida [1-2]. As principais áreas de produção são terras de Henan, Shanxi, Shaanxi, etc. Entre eles, a rehmannia glutinosa crua tem os efeitos de eliminar o calor e resfriar o sangue, nutrir o yin e promover a produção de fluidos, e é usada principalmente para tratar o calor no sangue, aquecer toxinas e manchas, etc.; rehmannia glutinosa cozida tem os efeitos de nutrir o sangue e o yin, reabastecer a essência e reabastecer a medula, e é usada principalmente para tratar deficiência de sangue, clorose, etc. Palpitações, inquietação, etc.[1-2]. Os dois têm propriedades e sabores diferentes, mas ambos pertencem aos meridianos do fígado e dos rins. Rehmannia glutinosa contém componentes químicos complexos, incluindo principalmente iridóides, iononas, glicosídeos feniletanol, flavonóides, etc.

Após Rehmannia glutinosa ser processada por diferentes métodos de processamento, os tipos, conteúdos e proporções de componentes químicos em cada produto processado variam muito, resultando em diferenças significativas em sua atividade farmacológica [6-10]. de acordo com

Estudos relacionados[11-12] mostram que no processo de mudança de Rehmannia glutinosa de "cru" para "cozido", o conteúdo de componentes químicos como catalpol, erva-mãe, estaquiose e aminoácidos diminuiu significativamente, e o conteúdo de frutose, 5- hidroximetilfurfural, etc. O conteúdo de isorebascosídeo, etc. Atualmente, o controle de qualidade da rehmannia glutinosa crua e cozida utiliza principalmente o conteúdo de catalpol e rehmanniasida D como indicadores de avaliação. Os indicadores do sistema de avaliação são relativamente únicos, dificultando o controle abrangente da qualidade da rehmannia glutinosa. Além disso, estudos demonstraram que o conteúdo de rehmannia glutinosa D muda antes e depois do processamento. É pequeno e tem baixa especificidade na caracterização das mudanças na composição após o processamento e no grau de processamento [12-13].

Portanto, a fim de avaliar a qualidade da Rehmannia glutinosa de forma mais abrangente, este estudo estabeleceu a relação entre a rehmanniasida D e o Yimu em Rehmannia glutinosa.

Métodos de determinação do conteúdo de cinco componentes comuns, incluindo glicosídeo, equinaceasídeo, cistanqueosídeo A e verbascosídeo, e estabeleceram uma impressão digital de HPLC de Rehmannia glutinosa para analisar o conteúdo dos principais componentes em Rehmannia glutinosa de diferentes áreas de produção e antes e depois do processamento, com o objetivo de fornecer informações para o controle de qualidade de Rehmannia glutinosa. Suporte técnico.

Instrumentos, reagentes e medicamentos de teste

Cromatógrafo líquido de alto desempenho Agilent 1260 (o detector é um conjunto de diodos); balança analítica eletrônica de faixa variável (METTLER TOLEDO); limpador ultrassônico digital (Shanghai Ultrasonic Instrument Factory, KH-500DE). O metanol (Grupo Sinopharm) é de grau analítico; acetonitrila (Merck) é de qualidade cromatográfica; água é água engarrafada Watsons. Substância de referência Rehmannia glutinosa D (número de lote RFSD8401909016, pureza 98,0%), substância de referência glicosídeo leonurus (número de lote RFS-Y22002208010, pureza 98,0%) e substância de referência cistancheside A (lote número RFS-R05002009014, pureza 96,0%) foram todos adquiridos da Chengdu Ruifensidedan Biotechnology Co., Ltd.; a substância de referência equinacosídeo (número de lote 111670-201907, pureza 91,8%) e a substância de referência verbascosídeo (número de lote 11530-201914, pureza 95,2%) foram todas adquiridas do China Food and Drug Inspection Institutes. Amostras de Rehmannia (SX1 ~ SX4, HN1 e HN2) foram coletadas de diferentes áreas produtoras (ver Tabela 1), das quais SX4 e HN2 foram vaporizadas por SX1 e HN1 respectivamente, e SX2 e SX3 foram coletadas da mesma área produtora. Todas as amostras foram identificadas como autênticas por Song Pingshun, médico-chefe de medicina chinesa do Instituto Provincial de Controle de Drogas de Gansu.

Tabela 1 Informações das amostras de Sêmen Rehmanniae

2.1 Condições cromatográficas

Foi utilizada a coluna Shiseido CAPCELL PAK C18 (250.0 mm×4,6 mm, 5 μm), acetonitrila foi usada como fase móvel A e solução de ácido fórmico a 0,1% foi usada como fase móvel B As condições de eluição do gradiente foram: 0-3 min, 1%A; 3-9 min, 1%A→5%A; 9-24 min, 5%A→35%A; 24-35 min, 35%A→65%A; 35-40 min, 65%A→90%A. Detecção de comprimento de onda variável (0-24 min, 203 nm; 24-40 min, 330 nm). O volume de injeção foi de 15 μL da solução de referência e 20 μL da solução amostra.

2.2 Preparação da solução

2.2.1 Preparação da solução de referência

Pegue quantidades apropriadas das cinco substâncias de referência acima, adicione 70% de metanol para preparar uma solução de referência mista com uma concentração de massa de 0,4 mg/mL.

2.2.2 Preparação da solução de teste

Pesar cerca de 1,0 g de pó de Rehmannia (passado pela peneira nº 2), pesar com precisão, colocar em um frasco cônico tampado, adicionar com precisão 25 mL de metanol a 70%, selar, pesar, tratar ultrassonicamente (potência 300 W, frequência 50 kHz) por 30 min, deixar esfriar até a temperatura ambiente, pesar novamente, completar a massa perdida com metanol 70%, filtrar e retirar o filtrado para obter.

2.3 Investigação metodológica

2.3.1 Investigação de especificidade

Pegue a solução de referência mista em "2.2.1" e a solução de teste (amostra SX1) em "2.2.2" e injete e meça de acordo com as condições cromatográficas em "2.1". Os resultados mostram que o cromatograma da amostra de Rehmannia apresenta um pico cromatográfico com o mesmo tempo de retenção dos padrões de referência de Rehmannia glutinosa D, Leonurin, Echinacoside, Cistanche deserticola A e Verbascoside (ver Figura 1), indicando que este método tem forte especificidade.

2.3.2 Investigação de relacionamento linear

Adicione 70% de metanol à solução de referência mista, dilua 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes e 250 vezes, respectivamente, e injete e meça de acordo com as condições cromatográficas em "2.1". As curvas padrão foram desenhadas com a concentração de massa de cada referência como eixo horizontal (x) e a área do pico cromatográfico correspondente como eixo vertical (y). Os resultados são mostrados na Tabela 2, indicando que cada componente possui uma boa relação linear dentro da faixa de concentração de massa correspondente.

1.remaniosídeo D; 2. leonurida; 3. equinacósido; 4. castanosídeo A;5. acteosídeo

Figura 1 Cromatogramas de investigação de especificidade

Tabela 2 Relação linear de 5 componentes no Sêmen Rehmanniae

2.3.3 Investigação de precisão

Pegue a solução de teste (amostra SX1) em "2.2.2" e realize o teste de injeção de acordo com as condições cromatográficas em "2.1". Injete a amostra 6 vezes continuamente, registre a área do pico de cada componente e calcule o RSD da área do pico de rehmannia glutinosa D, glicosídeo de erva-mãe, glicosídeo de equinácea, glicosídeo de cistanche A e verbascosídeo na amostra de teste como 0. 46%, 0,12%, 0,85%, 0,48% e 0,82%, respectivamente, indicando que o instrumento tem boa precisão.

2.3.4 Estudo de Repetibilidade

Seis amostras da mesma amostra de raiz de Rehmannia (SX1) foram preparadas em paralelo de acordo com o método em "2.2.2" e injetadas e determinadas de acordo com as condições cromatográficas em "2.1". Os RSDs do conteúdo de glicosídeo D de raiz de rehmannia, glicosídeo de erva-mãe, glicosídeo de equinácea, glicosídeo de cistanche A e verbascosídeo nas seis amostras foram 0,46%, 0,69%, 1,42%, {{ 12}},48% e 1,58%, respectivamente, indicando que o método possui boa repetibilidade.

2.3.5 Estudo de Estabilidade

Pegue a solução de teste (amostra SX1) em "2.2.2" e injete e meça de acordo com as condições cromatográficas em "2.1" em 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 1{{ 15}}h, 12h, 18h e 24h, respectivamente. O RSD das áreas de pico de rehmannia glutinosa D, glicosídeo motherwort, equinacosídeo, cistanche glicosídeo A e verbascosídeo foram 0,94%, 1,04%, 0,73%. , 0,83% e 0,71%, respectivamente, indicando que a solução teste apresenta boa estabilidade em 24 horas.

2.3.6 Taxa de recuperação de amostra

{{0}},5 g de amostra de raiz de Rehmannia (SX1) com conteúdo conhecido de 5 componentes foi pesada com precisão em um frasco cônico tampado, e 6 porções paralelas foram adicionadas, e 5 soluções de referência de certas concentrações foram adicionadas respectivamente. As amostras foram preparadas de acordo com o método em "2.2.2", e as amostras foram injetadas e medidas de acordo com as condições cromatográficas em "2.1". A taxa de recuperação foi calculada e os resultados são mostrados na Tabela 3. A taxa média de recuperação da amostra de cada componente foi de 96,5% ~ 98,6% e o RSD foi de 0,73% ~ 1,52%, indicando que o método tem boa precisão.