Extração de glicosídeos feniletanóides de Cistanche Tubulosa por extração de homogeneização por cisalhamento de alta velocidade

Fundo:

Cistanche tubulosa é uma conhecida medicina tradicional chinesa originária de Xinjiang. É amplamente distribuído no norte da África, Índia, etc. Objetivo: O principal componente bioativo de C. tubulosa églicosídeos feniletanóides (PhGs). Equinacosídeo e acteosídeo são os componentes indicativos para a determinação de PhGs e são utilizados principalmente para proteção do fígado, proteção imunológica, etc. Portanto, é muito importante extrair os PhGs de C. tubulosa. Métodos: Neste estudo, foram comparados os métodos de extração assistida por ultrassom (EAU), extração assistida por micro-ondas (MAE) e extração por homogeneização por cisalhamento em alta velocidade (HSHE). Além disso, as condições de extração do método HSHE foram otimizadas. Resultados: Os resultados mostraram que o método HSHE foi melhor que os métodos UAE e MAE, e os parâmetros de extração ideais do HSHE foram uma concentração de etanol de 50%, uma temperatura de extração de 70 graus, uma velocidade de rotação de 16.000 rpm, uma extração tempo de 2 min, proporção sólido-líquido de 1:9 e um ciclo de extração. Os rendimentos deequinacosídeo e acteosídeoforam 1,366 e 0,519%, respectivamente, e as taxas de transferência de equinacosídeo e acteosídeo atingiram 87 e 94%, respectivamente. Conclusões: Pode-se concluir que o método HSHE é uma técnica simples, rápida e eficiente para extração de PhGs de C. tubulosa. Destaques: Um método HSHE eficiente e ecológico foi investigado para a extração de PhGs de C. tubulosa. Foram obtidas as condições ótimas do método HSHE para extração de PhGs de C. tubulosa. Esta pesquisa fornece um novo método para a extração industrial de PhGs de C. tubulosa.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA MELHORAR A FUNÇÃO SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cistanche tubulosaé uma medicina tradicional chinesa comum que se origina em Xinjiang. Está amplamente distribuído no norte da África,Península Arábica, Paquistão e Índia e foi oficialmente registrado na Farmacopeia Chinesa em 2010. O principal componente bioativo do C. tubulosasão os glicosídeos feniletanóides (PhGs), uma classe de produtos naturais solúveis em água, incluindoequinacosídeo, acteosídeo, isoacteosídeoe 2-acetilacteosídeo (1, 2). A estrutura dos PhGs consiste em porções de ácido cinâmico e hidroxifeniletil, ambas ligadas a um -glucopiranose através de éstere ligações glicosídicas, respectivamente (3). Estudos farmacológicos demonstraram que os PhGs deC. tubulosatêm muitas funções medicinais, como efeitos antifadiga (4), neuroprotetores (5–7), protetores hepáticos (8–10) e imunoprotetores (11). Portanto, a extração eficaz de PhGs deC. tubulosaé de grande importância para o desenvolvimento e utilização de produtos naturais.

Os atuais métodos tradicionais de extração de PhGs são extração por refluxo quente, extração assistida por ultrassom (EAU) e extração assistida por micro-ondas (MAE; 12–16). Esses métodos apresentam diferentes desvantagens, como baixa eficiência, longos tempos de extração e altos custos. Comparado com os métodos tradicionais, o método de extração por homogeneização por cisalhamento de alta velocidade (HSHE) é um método de extração novo e emergente e tem as vantagens de tempos de extração mais rápidos, menos desperdício de solvente, rendimentos mais elevados, dispositivos mais simples e operação mais fácil (17). O princípio de trabalho do método HSHE é baseado em um cortador interno giratório acionado por um motor de alta velocidade. Uma poderosa força de cisalhamento é produzida pelos cortadores internos e externos para romper e misturar as amostras. Enquanto isso, o cortador com rotação em alta velocidade causa diferenças de pressão entre as cavidades interna e externa do cortador, resultando em uma transferência de massa entre as amostras e os solventes. Com a combinação de alta força de cisalhamento, força de colisão, pressão e outras forças, um equilíbrio solúvel entre amostras sólidas e solventes pode ser rapidamente alcançado (18). Assim, o processo de extração de HSHE pode ser concluído em poucos minutos, e até mesmo em dezenas de segundos (19–22).

Recentemente, o HSHE tem sido explorado na extração de componentes bioativos de vários produtos naturais (23–25). Cheng et al. utilizou HSHE para extrair cinco lignanas do fruto de Schisandra chinensis (26). Os resultados mostraram que as condições ideais foram uma concentração de etanol de 75%, um tempo de extração de 1 min, uma relação sólido-líquido de 1:19, uma tensão de extração de 180 V e uma partícula de amostra tamanho de 120 malhas. O rendimento total das cinco lignanas foi de 13,89 ± 0,014 mg/g nas condições otimizadas. Tang et al. utilizou HSHE para obter óleo bioativo de sementes de perilla (27). As condições ideais foram um tempo de extração de 2 min, uma relação sólido-líquido de 1:10, uma tensão de extração de 150 V e dois ciclos de extração. O rendimento do óleo de semente de perilla atingiu 59,3%. Os resultados acima indicam que o HSHE tem as vantagens de tempos de extração curtos, baixos custos e altos rendimentos. No entanto, faltam pesquisas sobre a extração de PhGs por HSHE.

No presente estudo, o HSHE foi utilizado para explorar sua aplicação potencial na extração de PhGs de C. tubulosa. O rendimento de PhGs foi determinado por HPLC. Os três métodos de extração, HSHE, UAE e MAE, foram comparados nas mesmas condições. Os efeitos da concentração de etanol, temperatura de extração, velocidade de rotação, tempo de extração, relação sólido-líquido e número de ciclos de extração no rendimento foram investigados. As vantagens e desvantagens deste trabalho e das referências são comparadas e discutidas.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA MEDICINA TRADICIONAL CHINESAPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiais e métodos

Materiais e Reagentes Químicos

C. tubulosa foi adquirida da Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, China). Os padrões de equinacosídeo (purezas maiores ou iguais a 98%) e acteosídeo (purezas maiores ou iguais a 98%) foram adquiridos da Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Xangai, China). Acetonitrila, metanol e ácido acético eram de grau HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). O etanol de grau analítico foi adquirido da Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, China). Água deionizada foi usada durante todos os experimentos.

Análise HPLC

Uma análise de HPLC foi realizada em um cromatógrafo líquido Waters e2695 (Waters, Milford, MA) equipado com um detector UV/Visível 2489 e uma coluna Symmetry C18 (Waters), 250 × 4,6 mm, tamanho de partícula de 5 μm. As concentrações de equinacosídeo e acteosídeo foram analisadas pelo método HPLC. A fase móvel consistia em (1) acetonitrila e (2) uma solução aquosa de ácido acético glacial a 2%. O programa de eluição gradiente é apresentado na Tabela 1.

O comprimento de onda detectado foi de 330 nm, a vazão foi de 1 mL/min, o volume de injeção foi de 10 μL e a temperatura do forno foi ajustada em 30 graus. O pico cromatográfico do analito foi confirmado comparando seu tempo de retenção com o dos padrões. A quantificação foi realizada integrando o pico utilizando um método padrão externo.

O teste de precisão foi realizado injetando cinco vezes as mesmas amostras de extração. Para o teste de estabilidade, as mesmas amostras foram analisadas em incrementos de 0, 1, 2, 4, 12, 24 e 48 h.

Os testes de recuperação de equinacosídeo e acteosídeo foram realizados adicionando os padrões às amostras de extração. Todas as áreas de pico e tempos de retenção de equinacosídeo e acteosídeo foram registrados. Os resultados das curvas de calibração para equinacosídeo e acteosídeo estão listados na Tabela 2.

Cálculo do rendimento

Equinacosídeo e acteosídeo foram utilizados como componentes indicativos para a determinação de PhGs. O rendimento de equinacosídeo ou acteosídeo foi calculado usando a seguinte equação:

onde Y=rendimento de equinacosídeo ou acteosídeo (%); C=concentrações de equinacosídeo ou acteosídeo (mg/mL); V=volume da solução extratora (mL); e W=peso do pó de C. tubulosa (mg).

Métodos de extração de PhGs Os caules de C. tubulosa foram primeiramente moídos por um moedor elétrico (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, China) e filtrados por uma peneira de filtro (aproximadamente 380 μm ). Em seguida, o pó de C. tubulosa foi seco em estufa a 70 graus até o peso ficar constante. Cinco gramas de pó de C. tubulosa foram misturados com o solvente de extração e colocados em um frasco de extração. Depois, a mistura líquida foi pré-aquecida (30-80 graus) por 5 min em banho-maria a temperatura constante (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, China).

(a) Método HSHE.-HSHE ​​foi realizado por um sistema FA25 (FLUKO Co., Ltd, Xangai, China), que consistia no cortador rotativo, motor de alta velocidade e controlador. A velocidade de rotação do cortador interno foi regulada na faixa de 10.000 a 28.000 rpm e os tempos de extração foram ajustados na faixa de 2 a 15 min.

(b) Método dos Emirados Árabes Unidos.-Cinco gramas de amostra seca e 300 mL de metanol foram pesados ​​com precisão e adicionados em um frasco de extração. O frasco de extração foi imerso em banho ultrassônico e realizado na potência ultrassônica de 300 W por 10 min. A temperatura de extração foi fixada em 30 graus.

(c) Método MAE.-Cinco gramas de amostra seca e 300 mL de metanol foram pesados ​​com precisão e adicionados a um frasco de extração. A garrafa de extração foi colocada no reator de micro-ondas e realizada a 180 W por 10 min. A temperatura de extração foi fixada em 30 graus.

O método HSHE foi comparado com os métodos UAE e MAE com o mesmo solvente de extração, tempo de extração, temperatura de extração, proporção sólido-líquido e número de ciclo de extração. A solução de extração foi filtrada por uma membrana de 0 0,22 μm e analisada via HPLC para determinar as concentrações de equinacosídeo e acteosídeo. Todos os processos de extração foram repetidos três vezes.

CISTANCHE TUBULOSA NATURAL PARA MELHORAR A IMUNIDADE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Determinação das taxas de transferência

Com base no método padrão da 2015 Farmacopeia Chinesa, foram determinados os conteúdos de equinacosídeo e acteosídeo no pó de C. tubulosa (28). Um grama de pó de C. tubulosa e 50 mL de metanol a 50% foram pesados ​​com precisão e adicionados em um balão volumétrico marrom de 50 mL. A mistura líquida foi pesada e embebida durante 30 min. Em seguida, o balão volumétrico marrom foi imerso em banho ultrassônico e realizado na potência ultrassônica de 250 W e frequência de 35 kHz por 40 min. A mistura líquida foi pesada novamente e foi adicionado metanol a 50% para suprir a perda de solvente. A solução de extração foi filtrada por uma membrana de 0,22 μm e analisada por HPLC para determinar as concentrações de equinacosídeo e acteosídeo. Os processos de extração foram repetidos três vezes.

As taxas de transferência de equinacosídeo ou acteosídeo foram calculadas usando a seguinte equação:

onde X=taxa de transferência de equinacosídeo ou acteosídeo (%); M1=qualidade de equinacosídeo ou acteosídeo no extrato (mg); e qualidade M2=de equinacosídeo ou acteosídeo em pó de C. tubulosa (mg).

Resultados e discussão

Validação do Método HPLC

Os perfis de HPLC de equinacosídeo e acteosídeo de C. tubulosa usando HSHE são mostrados na Figura 1. O RSD das áreas de pico de equinacosídeo e acteosídeo foi de 1,89 e 1,40%, respectivamente. Os resultados mostraram que o método HPLC apresenta boa precisão na análise quantitativa do equinacosídeo e do acteosídeo. Em vários momentos (0–48 h), os RSDs das áreas de pico do equinacosídeo e do acteosídeo foram de 1,71 e 1,70%, respectivamente, indicando que a amostra estava estável em 48 h. A recuperação de equinacosídeo e acteosídeo foi de 99,3 e 99,1%, respectivamente, e seu RSD foi de 0,70 e 0,67%, respectivamente, o que confirmou a confiabilidade do método HPLC.

Comparação dos diferentes métodos de extração Uma comparação do método HSHE com os métodos MAE e UAE em relação aos rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo foi

conduzido, cujos resultados são mostrados na Figura 2. Observou-se que os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo obtidos pelo HSHE foram superiores aos obtidos pelo MAE e pelos Emirados Árabes Unidos. Em comparação com o MAE, os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo obtidos por HSHE foram maiores em 20,5 e 20,8%, respectivamente. E em comparação com os Emirados Árabes Unidos, os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo obtidos pela HSHE foram maiores em 6,6 e 7,4%, respectivamente. Estes resultados indicam que o HSHE pode aumentar significativamente os rendimentos de PhGs.

Otimização do Método HSHE

Os parâmetros de extração de PhGs por HSHE incluem concentração de etanol, temperatura de extração, velocidade de rotação, tempo de extração, proporção sólido-líquido e número de ciclos de extração (26, 29)

Efeito da concentração de etanol na extração de PhGs

A concentração de etanol é um fator importante que afeta os rendimentos de PhGs. Como mostrado na Figura 3, foram investigados os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo de C. tubulosa sob diferentes concentrações de etanol. Revelou que o rendimento do equinacosídeo aumentou de 0 para 30% e depois diminuiu de 30 para 90% com o aumento das concentrações de etanol. O rendimento do acteosídeo aumentou de 0 para 70% e depois diminuiu de 70 para 90% com o aumento das concentrações de etanol. Quando a concentração de etanol

foi de 50%, a soma dos rendimentos de equinacósido e acteosídeo atingiu o seu máximo. As diferentes concentrações de etanol têm polaridades diferentes, o que leva a diferentes solubilidades de equinacosídeo e acteosídeo. Assim, a concentração ótima de etanol foi de 50%.

Efeito da temperatura de extração na extração de PhGs

Para avaliar os efeitos da temperatura de extração no rendimento de PhGs, diferentes temperaturas de extração (30–80 graus) foram estudadas. Os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo sob diferentes temperaturas são mostrados na Figura 4. Pode-se observar que quando a temperatura de extração aumentou de 30 para 70 graus, os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo aumentaram. Quando a temperatura aumentou para 80 graus, os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo diminuíram. Isto é atribuído a uma temperatura mais alta que acelera a degradação dos PhGs. Portanto, a temperatura ideal de extração foi de 70 graus.

Efeito da velocidade de rotação na extração de PhGs

A Figura 5 mostra os efeitos de diferentes velocidades de rotação nos rendimentos de PhGs. Os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo aumentaram com o aumento das velocidades de rotação. O aumento na velocidade de rotação pode aumentar a força de cisalhamento do cortador interno e externo, aumentando assim o rendimento dos PhGs. A velocidade de rotação ideal foi de 16.000 rpm.

Efeito do tempo de extração na extração de PhGs

Os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo sob os diferentes tempos de extração são mostrados na Figura 6. Os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo foram estáveis ​​com o aumento dos tempos de extração. Pode-se, portanto, concluir que os PhGs podem ser completamente extraídos de C. tubulosa em 2 min, e o tempo ideal de extração foi de 2 min.

Efeito da relação sólido-líquido na extração de PhGs

Como mostrado na Figura 7, foram discutidos os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo sob as diferentes proporções sólido-líquido. Os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo aumentaram de 1:3 para 1:9 e tornaram-se estáveis ​​de 1:9 para 1:24. Como uma pequena quantidade de solvente de extração não pode dissolver completamente o equinacosídeo e o acteosídeo, as taxas de transferência de massa foram reduzidas. A extração excessiva de solventes causou desperdício desnecessário. Portanto, a proporção ideal de sólido para líquido foi de 1:9.

Efeito do número de ciclos de extração na extração de PhGs

A Figura 8 mostra os efeitos de vários ciclos de extração nos rendimentos de PhGs. Os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo aumentaram com o aumento do número de ciclos de extração. No entanto, os tempos de extração aumentaram notavelmente com o aumento dos ciclos de extração e mais energia foi consumida. O número ideal de ciclos de extração foi um.

Comparando o método HSHE com outros métodos de extração para extração de PhGs

Os resultados do método HSHE em comparação com outros métodos de extração paraextraindo PhGs de C. tubulosaestão listados na Tabela 3. O HSHE é mais simples e fácil do que os métodos de acoplamento, como a extração aquosa em duas fases assistida por ultrassom e os métodos de tecnologia de extração ultrassônica por micro-ondas. Além disso, a pressão de extração do HSHE é inferior ao método de extração com líquido pressurizado e as condições de operação do primeiro são mais seguras. Mais importante ainda, pode-se observar na Tabela 3 que o HSHE apresenta o menor tempo de extração e o menor consumo de solvente entre todos os métodos de extração. Pode-se concluir que o método HSHE apresenta inúmeras vantagens como alta eficiência, condições operacionais amenas, baixos níveis de consumo, equipamento simples e fácil operação para extração de produtos naturais.

Conclusões

Neste estudo, um método HSHE eficiente e ecológico foi investigado para a extração de PhGs de C. tubulosa. Comparado com os métodos dos Emirados Árabes Unidos e MAE, o novo método HSHE produz um rendimento mais elevado de PhGs nas mesmas condições. Comparado com o método MAE, os rendimentos deequinacosídeo e acteosídeoaumentaram 20,5 e 20,8%, respectivamente. E em comparação com os Emirados Árabes Unidos, os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo aumentaram 6,6 e 7,4%, respectivamente. Os parâmetros de extração de HSHE de PhGs de C. tubulosa foram otimizados. Sob os parâmetros otimizados, os rendimentos de equinacosídeo e acteosídeo atingiram 1,366 e 0,519%, respectivamente, e as taxas de transferência de equinacosídeo e acteosídeo atingiram 87 e 94%, respectivamente. O método HSHE apresenta as vantagens de alta eficiência, condições operacionais amenas, baixos níveis de consumo, equipamento simples, fácil operação e baixos custos. Esta pesquisa fornece um novo método para a extração industrial de PhGs de C. tubulosa.

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