Padrão de expressão de -tubulina, inversina e seu alvo desgrenhado-1 e morfologia de cílios primários em doenças e desenvolvimento renal humano normal

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrato:A expressão espaço-temporal de proteínas -tubulina, inversão e desgrenhadas-1 (DVL-1) associadas à via de sinalização Wnt e a morfologia dos cílios primários foram analisadas no desenvolvimentorins(14ª a 38ª semanas de desenvolvimento), pós-natal saudável (1.5- e 7-anos) e humano patologicamente alteradorins,incluindo displásico multicísticorins(MCDK), glomeruloesclerose segmentar focal (GESF) e síndrome nefrótica do tipo finlandês (CNF). A análise foi realizada por dupla imunofluorescência, microscopia eletrônica, métodos semiquantitativos e estatísticos. A co-expressão citoplasmática de -tubulina, inversão e DVL-1 foi observada nos túbulos contorcidos proximais (pct), túbulos contorcidos distais (dct) e glomérulos (g) dos tecidos analisados. Duranterimdesenvolvimento, a expressão global de -tubulina, inversão e DVL-1diminuiu, enquanto no período pós-natal aumentou ligeiramente. As expressões mais altas de -tubulina e inversão caracterizaram dct eg, enquanto DVL-1 alta caracterizou pct. -tubulina, inversão e padrões de expressão DVL-1 em MCDK, FSGS e CNFrinsdiferiu significativamente do controle saudável. Comparado ao saudávelrins, patologicamente alteradorinsapresentaram cílios primários dismórficos. Dinâmica de expressão diferente de -tubulina, inversão e DVL-1 duranterimdesenvolvimento pode indicar que alternar entre a sinalização Wnt canônica e não canônica é essencial pararimmorfogênese. Em contraste, sua expressão perturbada emrinspode estar associada a cílios primários anormais, levando adoenças renais.

Palavras-chave:desenvolvimento do rim humano; -tubulina; inversina; DV-1; MCDK; GESF; CNF; rim, rim

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Introdução 

O desenvolvimento do definitivo ou metanéfricorinscomeça durante a quinta semana gestacional (PG), que então se diferencia continuamente para formar os rins permanentes [1,2]. As interações de sinalização entre o mesênquima metanéfrico e o broto ureteral garantemrimdesenvolvimento durante a nefrogênese. Resumidamente, o broto ureteral induz a transição mesenquimal para epitelial (MET) no mesênquima metanéfrico, que se condensa e formarenalvesículas, seguido por corpos em forma de vírgula e em forma de S, e finalmente levando à formação de glomérulos [3]. Em troca, o mesênquima induz a ramificação adicional do broto ureteral. Os rins metanéfricos tornam-se unidades excretoras funcionais na 11ª semana de desenvolvimento humano. No entanto, a nefrogênese é concluída dentro da 34ª a 36ª semana de desenvolvimento fetal, quando vários eventos de ramificação terminam, mas o processo de diferenciação dos rins continua no período pós-natal [4,5]. Interrupções dessas interações complexas resultam em várias anormalidades congênitas do rim e do trato urinário (CAKUT), incluindo displasia, doença renal policística, displasia multicísticadoenca renal(MCDK), consequentemente levando adoenca renal(DRC) [6].

Neste estudo, nos concentramos na aparência dos cílios primários e na via de sinalização Wnt, que desempenha um papel importante durante a nefrogênese normal e narimprocesso de reparação, após aguda ou crônicadoenca renal[7]. A existência de cílios primários durante a nefrogênese e o grande número derimdefeitos que ocorrem em pacientes com doença ciliar apontam que a função genuína dos cílios primários é necessária para o normalrimorganogênese [8,9]. O cílio primário é uma organela baseada em microtúbulos importante para a homeostase do tecido, onde a -tubulina é o componente básico [10]. A perda de acetilação de -tubulina em células imortalizadas desencadeia a transição epitelial-mesenquimal (EMT), o que implica que a -tubulina acetilada é importante na estabilização dos microtúbulos [11]. Durante o desenvolvimento humano, a via primária Wnt mediada por cílios permite a proliferação celular, diferenciação e morfogênese tecidual [12]. Um número significativo de crianças com função ciliar primária prejudicada e via de sinalização Wnt interrompida desenvolve DRC, onderenalsão responsáveis ​​por quase metade dos casos [13]. A doença cística congênita mais comum em crianças é a displasia multicísticadoenca renal(MCDK) [14]. Múltiplos cistos que não se comunicam [15] e não apresentamrenalparênquima são achados microscópicos característicos para MCDK. A glomeruloesclerose segmentar focal (GESF) é uma das doenças glomerulares mais comuns que levam ao estágio finaldoenca renal[16]. No início, a GESF é característica de ser focal, envolvendo apenas uma minoria dos glomérulos e segmentar, envolvendo alterações em apenas um segmento do círculo glomerular [17]. A síndrome nefrótica congênita do tipo finlandês (CNF) é uma doença autossômica recessiva raradoenca renalrepresentado por um surto pré-natal de extensa perda proteica [18], associada à cistogênese dos túbulos proximais [19]. Muitas formas de doenças glomerulares primárias desenvolvem proteinúria como resultado da barreira de filtração glomerular danificada [20]. Uma quantidade considerável de estudos sugere que a lesão e disfunção dos podócitos têm papéis intrínsecos na patogênese da proteinúria da DRC [21]. O estudo de Vukojevic et al. mostra um número aumentado de podócitos ciliados e pouco diferenciados no CNF [22]. Estudos anteriores indicaram que a via de sinalização Wnt/-catenina tem um papel fundamental na moderação da disfunção podocitária com proteinúria [23]. Existem duas vias principais de sinalização Wnt, uma conhecida como dependente de -catenina canônica e outra independente de -catenina não canônica. Durante o mouserimNo desenvolvimento, a sinalização Wnt canônica é ativa nas pontas dos brotos ureterais e nos corpos em forma de S [24]. Além disso, Wnt via sinalização canônica tem relevância na manutenção de MET durante a nefrogênese [25]. Ou seja, a ligação do complexo proteico contendo Dvl ao receptor de membrana é obrigatória para a ativação da via Wnt, enquanto a desativação dos principais componentes desta via resulta em mortalidade perinatal precoce devido à ausência da zona nefrogênica norim[25]. 

Uma proteína crucial como um interruptor molecular entre as vias de sinalização Wnt canônicas e não canônicas foi encontrada como inversão [26]. Embora tenham sido detectadas interações de várias proteínas com inversão, sua função exata ainda não foi completamente esclarecida. Norenalcélulas epiteliais, a inversão está localizada nos cílios primários, atuando como uma proteína ciliar [27]. Além disso, a inversão forma um complexo estável com tubulina em culturas derenalcélulas, e eles colocalize in vivo [27,28]. A inversão parece desempenhar um papel essencial na morfogênese inicial do sistema pronéfrico e na determinação da simetria esquerda-direita durante o desenvolvimento [29,30]. Um evento significativo para as vias de sinalização Wnt canônicas e não canônicas no recrutamento do Dvl citoplasmático para a membrana celular. Como achados anteriores mostraram que a inversão e Dvl co-localizam nas células epiteliais renais, pode-se especular que a inversão também pode ter um papel na sinalização não canônica. A desregulação da sinalização Wnt mediada pela inversão desencadeia uma proliferação aberrante nos túbulos [31]. Testes genéticos revelaram uma mutação DVL-1 em pacientes com síndrome de Robinow autossômica dominante, apresentando distúrbios heterogêneos em alguns pacientes associados a alterações urogenitais erenalanomalias [32].

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O padrão de expressão de desenvolvimento de -tubulina, inversão e DVL-1 foi investigado em diferentes modelos animais. Assim, sua expressão em propenophros de Xenopus laevis foi confirmada usando microscopia intravital [31], enquanto eles foram encontrados em linhagens celulares derivadas de células tubulares proximais murinas usando microscopia confocal e espectrometria de massa [33]. Além disso, microscopia de luz e dupla imunofluorescência revelaram sua presença em cortes de camundongosrins[34]. Estudos em camundongos knockout de inversão relataram cistos aumentados e difusos norenalmedula e córtex associados à inversão visceral situs [35]. Em humanos, a mutação de inversão foi apresentada com nefronoftise infantil que levou à interrupção da gravidez [36]. Apesar de inúmeros estudos sobrerenal-tubulina, inversão e padrão de expressão e função de DVL-1, até onde sabemos, um padrão de expressão dessas proteínas no tecido humano fetal e humano pós-natal ainda não foi investigado e correlacionado. Além disso, não há evidências relatadas considerando a expressão de inversão e DVL-1 no início do desenvolvimento humano. Portanto, este estudo teve como objetivo analisar o padrão de expressão espacial e temporal de -tubulina, inversão e DVL-1 durante as fases fetal e pós-natal de humanos saudáveisrins, bem como emrimtecidos de MCDK, FSGS e CNFrinsa fim de estabelecer um possível elo perdido entre essas entidades. Ou seja, propomos que padrões de expressão alterados de proteínas -tubulina, inversão e DVL-1 podem ser o processo de cistogênese subjacente e uma função anormal dos cílios primários levando adoenças renais. 

Resultados

A análise do desenvolvimento e pós-natalrimtecidos foi realizado em estruturas distintamente diferenciadas dorim:túbulos contorcidos proximais (pct), túbulos contorcidos distais (dct) e glomérulos (g). Durante as fases de desenvolvimento analisadas e no pós-natalrimtecidos, -tubulina, inversão e DVL-1 apresentaram padrões de expressão positivos, mas com diferenças de intensidade, distribuição e quantidade. A análise da patologiatecido renalde MCDK, FSGS e CNF foi realizada na contagem de imagem completa das células positivas em comparação com o controle de tecido renal saudável.

2.1. Microscopia de luz, microscopia eletrônica e imuno-histoquímica (-Tubulina) de tecido renal humano pós-natal saudável e patologicamente alterado

2.1.1. Luz renal pós-natal saudável

microscopia do pós-natalrimtecido demonstra bem definidorimestruturas, com uma diferença distinta entre a medula e o córtex e a formação do pct, dct eg na região cortical. A coloração imuno-histoquímica de -tubulina revela a presença de um cílio primário no centro da superfície celular apical de cada célula tubular e em 0.018 por cento ± 0,00014 por cento SD na superfície das células glomerulares. A microscopia eletrônica mostra a presença de apenas um cílio primário surgindo do corpo basal na superfície celular apical do túbulo (Figura 1a).

2.1.2. CNF

A maioria dos g analisados ​​são menores e lobulados (80 por cento ), enquanto a minoria é de tamanho normal ou hipertrófico (20 por cento , n=100). Encontra-se esclerose segmentar ou global de g, enquanto pct e dct estão parcialmente dilatados e revestidos por epitélio atrófico. Ultraestruturalmente, observa-se perda de microvilosidades e diminuição da altura celular com multifragmentação dos núcleos. Nos podócitos, os processos do pé são perdidos difusamente. Os cílios primários tubulares estão desorganizados, principalmente nos cistos dos túbulos proximais, apresentando alterações no comprimento e na posição citoplasmática (Figura 1b).

2.1.3. MCDK

No tecido renal, podem ser encontrados g imaturos e maduros esporádicos.Rimtecido é preenchido com numerosos cistos ovais. Células epiteliais colunares cobrem os cistos e são circundadas por tecido conjuntivo frouxo. A coloração imuno-histoquímica para -tubulina mostra vários cílios primários longos e desorganizados na superfície das células epiteliais (Figura 1c).

2.1.4. GESF

Em 90 por cento dos g, encontra-se esclerose segmentar extensa (n=100), associada a fibrose intersticial e sinais de lesão tubular. A diminuição da altura das células epiteliais com perda de microvilosidades é encontrada ao microscópio eletrônico, enquanto as células endoteliais e regiões mesangiais apresentam ultraestrutura regular. No microscópio eletrônico, observa-se o cílio extremamente longo e deslocado (descentralizado) na superfície da célula tubular distal (Figura 1e). Os podócitos mostram perda difusa dos processos do pé com extenso tecido de microvilosidades. A coloração imuno-histoquímica para a-tubulina mostra vários cílios primários longos e desorganizados na superfície das células epiteliais (Figura 1c).

2.2. Coloração imuno-histoquímica para 心Tubulina, inversão e DVL-1- e análise estatística de rins humanos pós-natais em desenvolvimento e saudáveis

Na 14ª, 15ª e 16ª semanas de gestação, arimtecido é apresentado com diferentes estágios de desenvolvimento de formação de néfrons: de copos metanéfricos,renalvesículas para comandar néfrons em forma de S, formando assim a zona nefrogênica no córtex externo (Figura 2). A diferenciação de pct, dct e g pode ser observada em regiões corticais mais próximas darimmedula. Durante o 22º GW, partes da medula e do córtex tornaram-se claramente distintas, enquanto no 38º GW,rimestruturas aparecem como altamente diferenciadas, contendo formas maduras de pct, dct e g

2.2.1. a-tubulina

Durante o desenvolvimento, a a-tubulina é fortemente expressa em todos osrimestruturas, visualizando principalmente a forma de cílios primários nas superfícies das células epiteliais parietais da cápsula de Bowman, g, pct e dct. Dentro derimtecido, 82-97 por cento das células pct expressam a-tubulina, enquanto em dct a expressão cai de 99 por cento para 72 por cento no 38º GW (ver Figura 3, Tabela 1). Entre os diferentes estágios de desenvolvimento, a expressão mais forte de a-tubulina é encontrada no g do 16º GWrins, contendo 93 por cento de células positivas. leves 14º, 15º e 22º GW (ver Figura 3a,b, Tabela 1), cerca de 70 por cento das células g expressam a-tubulina, enquanto a menor expressão é observada no 38º GW (p < 0,01)="" com="" 34="" por="" cento="" das="" células="" positivas="" (figura="" 3c).="" no="">rimtecido (1.5-anos e 7-anos de idaderins), a imunorreatividade mais forte à a-tubulina é observada na superfície celular apical do pct e dct (Figura 3d-f). A expressão de a-tubulina também está presente no citoplasma perinuclear da dct e nas células epiteliais parietais da cápsula de Bowman. a-tubulina cora todosrenalestruturas com uma média de 50 por cento de células positivas em pct, 94 por cento em dct e 85 por cento em g (Figura 3f). Dct colore significativamente diferente de pct (p < 0,0001).="" todas="" as="" estruturas="" investigadas="" são="" positivas="" para="" a-tubulina,="" com="" 77%="" de="" células="" positivas="" em="" pct,="" 72%="" em="" dct="" e="" 58%="" em="" g="">

Figura 3. Coloração por imunofluorescência de -tubulina e DAPI nos tecidos renais humanos em desenvolvimento e pós-natal (a–e). Rins de 14º, 15º/16º, 38º GW (a–c);rinsde 1.5- e 7-crianças de idade (d,e). A coloração positiva de -tubulina (setas) é mostrada em cada estrutura no córtex através das fases de desenvolvimento e pós-natal (a–e), túbulos contorcidos proximais (pct), túbulos contorcidos distais (dct) e glomérulos (g). Os detalhes dos cílios primários em pct (d) e dct (a–c,e) são mostrados como inserções de maior ampliação (caixa branca). Ampliação ×40, barra de escala 100 µm. A distribuição de células positivas para -Tubulina por estrutura ao longo dos diferentes estágios de desenvolvimento e no período pós-natal é mostrada no gráfico (f). O gráfico (g) (número geral de células positivas para proteínas nas estruturas observadas) mostra a expressão da proteína relacionada ao tempo de desenvolvimento (regressão linear) e a inter-relação de -Tubulina com DVL-1 através do desenvolvimento e maturação (ANOVA de duas vias seguida por teste posthoc do SIDAK). Os dados são apresentados como média ± SD.

A distribuição de células positivas para -tubulina por estrutura ao longo dos diferentes estágios de desenvolvimento e no período pós-natal é mostrada no gráfico (f). O gráfico (g) (número geral de células positivas para proteínas nas estruturas observadas) mostra a expressão da proteína relacionada ao tempo de desenvolvimento (regressão linear) e a inter-relação de -tubulina com DVL-1 através do desenvolvimento e maturação (ANOVA de duas vias seguida por teste post hoc de Sidak). Os dados são apresentados como média ± SD.

2.2.2. Coloração por Imunofluorescência Dupla para Inversão e DVL-1 e Coloração Nuclear DAPI em Rins Pós-Natais em Desenvolvimento e Inversão Expressão em Tecido Renal em Desenvolvimento e Pós-Natal

No 14º, 15º e 16º GW, a inversão mostra forte expressão granular em g, e leve expressão granular no citoplasma de pct e dct (Figura 4a,b), enquanto no 22º e 38º GW (ver Figura 4c), o expressão positiva é observada em g (Tabela 1). Entre os dias 14 e 22 GW, cerca de 50 por cento das células expressam a versão. No 16º GW, as células pct expressam inversão em 73% das células, enquanto diminuem para 29% das células (p < 0,05)="" no="" 38º="" gw="" (ver="" figura="" 4f).="" a="" expressão="" positiva="" de="" inversão="" é="" encontrada="" em="" aproximadamente="" 80-90="" por="" cento="" das="" células="" dct="" e="" g="" em="">rimtecidos do 14º e 16º GW, com a menor expressão em dct do 38º GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001,="" respectivamente)="" onde="" 66="" por="" cento="" das="" células="" foram="" positivas.="" no="">rins, pct cora fortemente na membrana celular apical, enquanto dct cora principalmente na membrana celular basal e no citoplasma perinuclear (Figura 4d,e). Nessa fase, encontramos expressão de inversão em todos osrenalestruturas, incluindo pct, dct eg, com uma expressão média de células positivas de 92 por cento para pct, 88 por cento para dct e 90 por cento para g (Figura 4f). Não observamos diferença significativa na força do sinal de expressão de inversão entre as estruturas. A maior expressão de inversão é encontrada em g, com média de 94 por cento de células positivas (Figura 4f). Uma diferença significativa é encontrada comparando a coloração de g (onde 94 por cento das células coram positivamente) para pct, onde 58 por cento das células coram positivamente (p <{11}}.01) e="" para="" dct,="" onde="" 49="" por="" cento="" das="" células="" são="" positivo="" (p="">< 0,0001,="" figura="">

Expressão de DVL-1 no tecido renal em desenvolvimento e pós-natal

A expressão leve a forte de DVL{{0}} é observada no citoplasma de pct, dct eg no período fetal (ver Figura 4a–c, Tabela 1). Em pct, 76–86 por cento das células expressam DVL-1 no 14º–22º GW, enquanto no 38º GW, há 57% de células positivas (Figura 4g). No dct de 14º e 15º GW, 68–70 por cento das células expressam DVL-1, no 16º e 22º GW, o número de células positivas cai para 42–5{{41} } por cento , enquanto no 38º GW a expressão (p < 0,001),="" é="" observada="" em="" 19="" por="" cento="" das="" células="" dct.="" a="" expressão="" de="" dvl-1="" aumenta="" em="" g="" ao="" longo="" dos="" estágios="" fetais:="" no="" 14º="" gw,="" é="" de="" 6%,="" enquanto="" no="" 15º,="" 16º="" e="" 22º="" gw,="" aumenta="" para="" 10%="" (p="">< 0,01).="" nos="" 38="" gw,="" 14="" por="" cento="" das="" células="" g="" expressam="" dvl-1="" (figura="" 4="" g).="" no="" período="" pós-natal,="" a="" imunorreatividade="" dvl-1="" é="" dispersa="" no="" citoplasma="" (tabela="" 1)="" tanto="" de="" pct="" quanto="" de="" dct="" (figura="" 4d,e).="" o="" sinal="" é="" encontrado="" em="" todas="" as="" estruturas="" investigadas,="" mas="" principalmente="" no="" citoplasma="" perinuclear.="" a="" intensidade="" da="" expressão="" de="" dvl-1="" é="" significativamente="" maior="" em="" pct="" em="" comparação="" com="" dct="" eg="" (p="">< 0,01).="" 39-45="" por="" cento="" das="" células="" no="" pct="" e="" dct="" expressam="" dvl-1,="" enquanto="" em="" g,="" 21="" por="" cento="" das="" células="" são="" positivas="" (figura="" 4="" g).="" não="" encontramos="" diferença="" significativa="" entre="" a="" porcentagem="" de="" células="" imunorreativas="" em="">renalestruturas. A porcentagem de células imunorreativas DVL-1 é de 34% em pct, 36% em dct e 27% em g, respectivamente (Figura 4g).

Figura 4. Coloração de imunofluorescência dupla de inversão (verde), DVL-1 (vermelho) e DAPI (azul) nos tecidos renais em desenvolvimento e pós-natal (14º–38º GW, 1.5- e {{6 }} tecidos renais de anos). A coloração positiva (setas) é mostrada em cada estrutura em todas as fases de desenvolvimento (a–c) e no período pós-natal (d,e). Microfones mesclados com estruturas de interesse no córtex: túbulos contorcidos proximais (pct), túbulos contorcidos distais (dct) e glomérulos (g). A colocação de inversão/DVL-1 (ponta de seta) é mostrada em microfotografias mescladas. As colorações de controle negativo são mostradas como inserções na inversão e DVL-1 (a). Os eritrócitos podem ser vistos como células fortemente coradas perto de dct. Os detalhes são mostrados como inserções de maior ampliação. Ampliação ×40, barra de escala 100 µm. A distribuição celular positiva dinâmica de inversão e DVL-1 nas estruturas renais (pct, dct, g) ao longo dos estágios de desenvolvimento e pós-natal são mostradas nos gráficos (f,g). O gráfico (h) mostra a expressão da proteína (número geral de células positivas nas estruturas) relacionada ao tempo de desenvolvimento (regressão linear) e a inter-relação da inversão para DVL-1 através do desenvolvimento e maturação (ANOVA de duas vias seguida do teste post hoc de Sidak ). Os dados são apresentados como média ± SD.

A co-expressão de inversão e DVL-1 é observada no citoplasma do rim g, dct e pct durante o desenvolvimento (ver Figura 4a–c, fusão). No período pós-natal, a co-expressão de inversão e DVL-1 caracteriza diferentes compartimentos celulares de células tubulares em pct e dct, enquanto a co-expressão em g é caracterizada pela forte prevalência de expressão de inversão (ver Figura 4d, mesclar ). Nos 7-rins pós-natais ano, a co-expressão de inversão e DVL-1 é vista em células tubulares de dct e pct, e em g onde a expressão de inversão prevalece ligeiramente em comparação com DVL-1 (Figura 4e, mesclar).

2.2.3. Diferenças na expressão de -tubulina, inversão e DVL-1 entre diferentes estágios de desenvolvimento do rim e rins pós-natais

O número de células -tubulina-positivas em pct de tecido renal fetal foi estatisticamente significativamente maior em comparação com o tecido renal de crianças de 7-anos (13º (p < 0.0{="" {11}}1),="" 15º="" (p="">< 0.0001)="" e="" 16º="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" de="" estágios="" fetais="" iniciais="" (13º,="" 15º,="" 16º="" e="" 22º="" gw)="" apresentaram="" mais="" células="" positivas="" em="" comparação="" ao="" 38º="" gw="" e="" tecido="" renal="" de="" crianças="" de="" 1,{19}}ano="" (p="">< 0,0001,="" respectivamente,="" figura="" 3f).="" quando="" diferentes="" estágios="" de="" desenvolvimento="" foram="" comparados,="" encontramos="" níveis="" mais="" baixos="" de="" expressão="" de="" inversão="" no="" pct="" do="" 13º="" (p="">< 0,0001),="" 15º="" (p="">< 0,00001),="" 22º="" (p="">< 0,001)="" e="" 38º="" (p="">< 0,0001)="" gw="" em="" comparação="" com="">renaltecido da criança de 1.5-anos. Em dct, foi encontrada uma expressão estatisticamente significativa menor de inversão comparando o tecido renal do 16º GW ao 38º GW (p < 0.0001).="" além="" disso,="" menor="" expressão="" de="" inversão="" em="" dct="" foi="" observada="" em="" tecido="" renal="" de="" criança="" de="" 7-anos;="" comparando="" 13º,="" 15º="" (p="">< 0,001,="" ambos),="" 16º="" e="" 1.5-tecido="" renal="" com="" dct="" de="" tecido="" renal="" 7-ano="" (p="">< 0,00001,="" respectivamente,="" figura="" 4f).="" o="" sinal="" observado="" de="" expressão="" de="" dvl-1="" através="" dos="" diferentes="" estágios="" revelou="" que="" pct="" do="" 13º="" (p="">< 0,01),="" 15º,="" 16º="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Relação entre Expressões de -Tubulina e Inversão para DVL-1 no Tecido Renal em Desenvolvimento e Pós-Natal

-As expressões de tubulina e inversão foram comparadas à expressão de DVL-1 ao longo dos estágios de desenvolvimento e no tecido renal pós-natal. -tubulina teve expressão estatisticamente maior em todos os estágios observados, em comparação com a expressão de DVL-1 (p < 0.001,="" figura="" 3g).="" em="" todos="" os="" estágios="" observados,="" a="" inversão="" teve="" maior="" expressão="" quando="" comparada="" ao="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" figura="" 4="">

2.2.5. Comparação da Coloração Imuno-histoquímica com -Tubulina, versão e DVL-1- e Análise Estatística do Tecido Renal Patologicamente Alterado (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulina A diferença da coloração com -tubulina em MCDK, FSGS e CNF foi estatisticamente significativa na comparação ao tecido renal pós-natal saudável como grupo controle (p < 0="" 0,0001,="" respectivamente).="" tecidos="" renais="" displásicos="" apresentaram="" expressão="" significativamente="" maior="" em="" comparação="" ao="" grupo="" controle,="" enquanto="" fsgs="" e="" cnf="" apresentaram="" expressão="" significativamente="" menor="" de="" -tubulina="" quando="" comparados="" ao="" controle="" saudável="" (figura="">

Inversão

A inversão é expressa no citoplasma de células epiteliais desorganizadas e túbulos de MCDK (Figura 5a). Em CNF, a expressão de inversão caracteriza g e dct, enquanto se mostra menos intensa em cistos pct (Figura 5b). Na GESF, a inversão é fortemente expressa em g e dct, mas menos intensamente em cistos pct (Figura 5c). A expressão espacial da inversão mostrou uma taxa de coloração estatisticamente significativa mais alta em tecidos renais saudáveis ​​(Figura 5g) quando comparado a MCDK, FSGS e CNF (p < 0="" 0,0001,="">

Figura 5. Coloração de imunofluorescência dupla de inversão (verde), DVL-1 (vermelho) e DAPI (azul) em tecidos renais patológicos em MCDK (a), CNF (b) e FSGS (c): túbulos (t) , glomérulos (g), cisto pct (c), a altura das células epiteliais pct (*). A co-localização de estrutura e célula de inversão e DVL-1 (pontas de seta) são mostradas nas seções mescladas com detalhes em inserções de maior ampliação. As colorações de controle negativo são mostradas como inserções na inversão e DVL-1 (a). Ampliação ×40, barra de escala 10{{20}} µm. Relação de -tubulina (d) e inversão (e) para expressão de DVL-1 em MCDK, FSGS e CNF (ANOVA de duas vias seguida de teste post hoc de SIDAK). A diferença na altura das células epiteliais (f) de FSGS, CNF e MCDK pct em comparação com o controle saudável (ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey, n=50). A diferença na porcentagem geral de células positivas de -tubulina, inversão e DVL-1 em MCDK, CNF e FSGS quando comparado ao controle saudável (g–i), ANOVA unidirecional seguido pelo teste post hoc de Tukey). Os dados são apresentados como média ± SD. Diferenças significativas são indicadas pelo valor p (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" é="" muito="" discretamente="" expresso="" apenas="" em="" túbulos="" desorganizados="" de="" mcdk,="" enquanto="" em="" cnf,="" sua="" expressão="" caracteriza="" dct="" eg="" (figura="" 5a,b).="" em="" fsgs,="" dvl-1="" é="" observado="" como="" reatividade="" leve="" em="" g,="" dct="" e="" pct="" (figura="" 5c).="" tecidos="" renais="" saudáveis="" ​​corados="" para="" dvl-1="" mostraram="" uma="" taxa="" significativamente="" maior="" de="" coloração="" (figura="" 5="" h)="" em="" contraste="" com="" mcdk="" e="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" ambos),="" enquanto="" nenhuma="" diferença="" significativa="" foi="" encontrada="" para="">

2.2.6. Relação entre Expressões de -Tubulina e Inversão para DVL-1 em Tecido Renal Patologicamente Alterado (MCDK, CNF, FSGS)Em MCDK, FSGS e CNF, -tubulina é significativamente maior que DVL-1 (p < 0.0001,="" respectivamente,="" figura="" 5d).="" a="" inversão="" corou="" significativamente="" maior="" quando="" comparada="" ao="" dvl-1="" em="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" e="" em="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" figura="">

2.2.7. Diferenças na altura das células epiteliais dos túbulos contorcidos proximais entre o controle saudável e o tecido renal patologicamente alterado (MCDK, CNF, FSGS)A altura das células epiteliais pct (n {0}} por grupo) foi comparada entre células tubulares em tecidos renais saudáveis ​​e tecidos renais patologicamente alterados (Figura 5b,c,f). A altura média das células epiteliais em HC foi de 12,91 µm ± 1,847 µm e foi significativamente maior quando comparada a CNF e FSGS (p < 0,0001,="" respectivamente).="" a="" altura="" média="" das="" células="" em="" cnf="" pct="" foi="" de="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" enquanto="" em="" fsgs="" foi="" de="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" as="" células="" epiteliais="" pct="" de="" mcdk="" não="" apresentaram="" alterações="" significativas="" na="" altura="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" quando="" comparadas="" ao="">

2.2.8. Diferenças no comprimento dos cílios primários entre controle saudável e tecido renal patologicamente alterado (MCDK, CNF, FSGS)

O comprimento do cílio primário (n= 50 por grupo) foi comparado entre HC e tecidos renais patologicamente alterados (Figura 6c). Tecidos renais saudáveis ​​e MCDK foram corados com -tubulina para assegurar a especificidade da coloração do cílio -tubulina (Figura 6a,b). Nos tecidos renais saudáveis, o cílio primário foi de 5,065 µm ± 1,229 µm de comprimento, enquanto no MCDK, CNF e FSGS foram significativamente mais longos (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Discussão

O objetivo do nosso estudo foi investigar uma expressão imuno-histoquímica de a-tubulina, inversão e DVL-1 em fetosrenaltecido e tecido renal pós-natal. Além disso, queríamos explorar se a expressão e o padrão de coloração de a-tubulina, inversão e DVL-1 são perturbados em diferentes doenças renais quando comparados ao controle saudável. Ou seja, apesar do amplo interesse de outros pesquisadores sobre o papel da a-tubulina, inversão e DVL-1 durante o desenvolvimento renal, a maioria dos estudos anteriores utilizou animais ou modelos experimentais in vitro. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo que mostrou expressão e localização de a-tubulina juntamente com inversão e DVL-1 em rins humanos fetais e pós-natais, e que explorou a expressão de proteínas mencionadas em rins doenças, como MCDK, FSGS e CNF. Também analisamos alterações no comprimento e aparência dos cílios por microscopia de luz e eletrônica, pois nosso estudo anterior já indicou que distúrbios ciliares podem estar associados à cistogênese em FSGF e CNF [19].

Na via canônica de sinalização Wnt, a ligação de ligantes Wnt aos receptores recruta Dvl [37]. Os processos do MET e da via de polaridade da célula planar durante os estágios iniciais da morfogênese renal são controlados pela sinalização Wnt. Mediando a via Wnt, os cílios primários controlam a proliferação celular, diferenciação e morfogênese tecidual [12] através da organização do citoesqueleto celular e da orientação celular, bem como do alongamento da estrutura tubular [2,38]. Em nosso estudo, -tubulina, inversão e DVL-1 estavam todos presentes nas estruturas renais e todos colocalizados não apenas durante o desenvolvimento do rim fetal, mas também no tecido renal do 1.5- e {{9 }} crianças de anos. Esses achados estão de acordo com a ativação da via de sinalização Wnt que já foi comprovada durante a tubulogênese [39]. Além disso, nossos resultados revelaram que a expressão de -tubulina e inversão estão reciprocamente relacionadas ao DVL-1 e que mostram uma diferença estatisticamente significativa entre seus padrões de expressão. Isso está em correlação com os modelos experimentais, pois a mutação da família completa de proteínas Dvl em camundongos resulta em falta de processo de gastrulação, enquanto as mutações que não incluem toda a família de proteínas mostram defeitos na colocação dos cílios nodais juntamente com defeitos nos órgãos [40] . Descobertas anteriores sugeriram que a inversão tem um papel na migração celular em Xenopus properphros. Uma vez que esse segmento se correlaciona com a alça de Henle de mamíferos e túbulos distais, isso pode indicar a importância da inversão durante o desenvolvimento do rim em humanos também [41]. De acordo com essa premissa, estudos anteriores revelaram que a mutação do gene de inversão poderia resultar em nefronoftise tipo 2, que é mediada pela expressão anormal de DVL-1 [42]. Apesar do papel do cílio primário ser controverso na regulação da via de sinalização Wnt, descobrimos que a -tubulina co-localizou com inversão e DVL-1 nas amostras de rim analisadas. Além disso, estudos anteriores apontaram que o cílio primário, juntamente com a inversão, regula a degradação de Dvl, influenciando a via de sinalização Wnt [43]. Em doenças renais humanas associadas ao desenvolvimento de cistos, foram observadas localização e função anormais dos cílios primários [19]. Da mesma forma, o presente estudo também confirmou alterações morfológicas da formação de cílios primários em condições patológicas como CNF, FSGS e MCDK. Descobertas anteriores reconheceram que a ativação excessiva da via Wnt canônica após lesão renal leva a alterações estruturais irreversíveis do tecido renal [44]. Pelo contrário, o cílio primário recebeu o papel de mudar da via Wnt canônica para não canônica na assistênciarenalreparar. Além disso, a superativação da via Wnt canônica no tecido renal transplantado mostrou ter um valor preditivo positivo para a fibrose renal [45]. Se a via canônica Wnt prevalece em detrimento da não canônica, ela apóia a teoria da fibrose renal como resultado. Nossos achados de -tubulina reduzida e expressão de inversão em CNF e FSGS implicam inatividade da via Wnt não canônica, especialmente porque ambas as condições tendem a levar ao estágio finaldoença renal.Nomeadamente, acredita-se que a localização e função normais do cílio primário podem ser um fator na manutenção de uma via Wnt regular e, portanto, um pré-requisito para o desenvolvimento normal. Em contraste, se a via Wnt for aumentada, pode resultar em proliferação e diferenciação celular desregulada, levando à carcinogênese [46]. Como descrito anteriormente, a via canônica Wnt é obrigatória para o início da MET e formação do néfron, enquanto sua perturbação pode levar arenalhipoplasia [47]. Nossos resultados apoiam essa ideia, revelando a expressão mais baixa de DVL-1 com a expressão mais alta de -tubulina no MCDK em comparação com o controle saudável. Esses resultados podem implicar na menor ativação da via canônica Wnt, o que pode ser uma causa subjacente para a ausência de formação de néfrons. Em contraste, a maior expressão de -tubulina com a menor expressão de DVL-1 pode explicar os achados de múltiplos cistos, pois não há alongamento organizado e polarização celular guiada pela via Wnt não canônica. Estudos anteriores também mostraram que a inversão inibe a via de sinalização canônica Wnt ao direcionar Dvl para degradação [26]. Este passo em sua interação foi considerado necessário para inibir a sinalização Wnt canônica na manutenção do alongamento e posicionamento tubular normal. A mutação de inversão resulta na regulação positiva da sinalização Wnt canônica, que subsequentemente provocou proliferação anormal nas células tubulares. Esta etapa provou ser crucial na cistogênese [42], enquanto o nocaute da inversão em camundongos leva à doença renal policística [48]. De acordo com a teoria darenalcistogênese, a inversão é considerada uma "micoproteína", devido à sua localização nos cílios primáriosrenalcélulas tubulares. Em nosso estudo, os cílios primários estavam presentes na superfície celular apical das células tubulares em todas as fases analisadas, enquanto durante as fases fetais, a expressão de -tubulina foi mais forte do que no período pós-natal.

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Estudos anteriores mostraram que a função primária dos cílios pode ser afetada pela desregulação da -tubulina durante o desenvolvimento, o que pode levar à cistogênese, desenvolvimento renal anormal e possível doença renal crônica na infância [31,49]. Isso está de acordo com nossos achados de cílios primários encurtados e dismórficos observados no MCDK ou com cílios múltiplos e extremamente alongados ou deslocados encontrados em túbulos dilatados de CNF e GESF quando comparados ao controle saudável. Para apoiar o fato de que as vias de sinalização Wnt canônicas e não canônicas, reguladas pelos cílios primários, são consideradas obrigatórias para o desenvolvimento normal do rim, encontramos coloração significativamente menor de inversão e DVL-1 no MCDK quando comparado ao controle saudável [31,49]. Diferentes dinâmicas de padrões de expressão de -tubulina, inversão e DVL-1 ao longo de diferentes fases de desenvolvimento renal podem indicar a mudança entre a via de sinalização Wnt canônica e não canônica durante a morfogênese renal normal. Sugerimos que seu intercâmbio determina a transcrição na via canônica ou ordem de migração e polarização celular durante o desenvolvimento renal em uma via de sinalização não canônica. Seu equilíbrio e expressão em todas as estruturas renais investigadas implicam em seu importante papel no desenvolvimento normal do rim. Durante o desenvolvimento normal do rim (do 13º GW ao 38º GW), a expressão global de -tubulina, inversão e DVL-1 está diminuindo à medida que o tecido renal adquire morfologia madura. Em tecidos renais de 1.5- e 7-anos de idade, -tubulina e inversão mostraram um ligeiro aumento na expressão que suporta o fato de que a via Wnt não canônica permanece ativa após o nascimento. Ao contrário, DVL-1 persiste com padrão de expressão diminuído, o que pode levar à conclusão de que a via Wnt canônica é silenciada em tecido renal saudável. Como resultado de condições patológicas do rim, as células epiteliais do rim podem reagir com o reaparecimento de EMT e fibrose [50] associada à reativação da via Wnt canônica [44]. Portanto, distúrbios de -tubulina, inversão e DVL-1 encontrados em rins doentes podem ser o mecanismo patológico subjacente e resultado da mudança da via Wnt não canônica para canônica no rim em desenvolvimento, aludindo à mudança entre rim reversível para irreversível dano. Além disso, as mudanças no seu pré-natal e pós-natalrenalO padrão de expressão pode estar associado ao comprometimento da função renal na idade adulta, levando a doenças congênitas e insuficiência renal crônica.

4. Materiais e Métodos

4.1. Amostras humanas

Amostras de tecido renal fetal foram coletadas após a perda gestacional no 14º, 15º, 16º, 22º e 38º GW no Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Centro Hospitalar Universitário Split. Todo o material fetal adquirido foi examinado por um patologista, e apenas tecidos sem sinais de anormalidades, macerações ou morte intrauterina e com cariograma normal foram utilizados para o estudo. Os prontuários das mães foram examinados antes da coleta da amostra e, em caso de problemas de saúde que pudessem influenciar o resultado da gravidez, os tecidos renais foram excluídos do estudo. A maturidade foi determinada pela circunferência da cabeça, circunferência abdominal e comprimento do fêmur [51] em correlação com os calendários menstruais das pacientes. Amostras de tecido renal de 1.5- e 7-anos de idade foram coletadas após mortes acidentais. As amostras foram obtidas no Departamento de Patologia do Centro Hospitalar Universitário Split. As amostras de tecidos renais displásicos multicísticos (MCDK) foram obtidas após perda gestacional, glomeruloesclerose segmentar focal (GESF) e síndrome nefrótica do tipo finlandês (CNF) foram obtidas por nefrectomia. Todo o material adquirido foi examinado e avaliado por um patologista, que classificou os diagnósticos. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Split (20 de maio de 2016) de acordo com a Declaração de Helsinque e suas atualizações (nº de classificação: 003-08/16-03/0001, registro nº: 2181-198-03-04-16-0024, 20 de maio de 2016) [52].

4.2. Imuno-histoquímica

A fixação da amostra de tecido coletada foi processada com paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 24 h a 22 ◦C. Após a desidratação em etanol 100%, as amostras foram embebidas em parafina, conforme descrito anteriormente [53]. As amostras foram cortadas em seções de 5 µm de espessura usando um micrótomo e posteriormente montadas em lâminas de microscópio. Para verificar a preservação do tecido, cada 10 cortes foram corados com hematoxilina e eosina [54]. A departamenização e a imuno-histoquímica foram realizadas conforme descrito anteriormente [2,55,56]. Após a lavagem em PBS, as lâminas de microscópio foram incubadas durante a noite com anticorpos primários em uma câmara úmida a 22 ◦C (StainTray Slide Stain Stain Stain System; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Os anticorpos primários utilizados foram anticorpo monoclonal anti-alfa tubulina de coelho (diluição 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anticorpo policlonal anti-inversão de coelho (diluição 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, Reino Unido), DVL monoclonal de camundongo -1 anticorpo (diluição 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) e anticorpo policlonal anti-gama tubulina de coelho (para verificar a coloração primária específica dos cílios com alfa- tubulina, diluição 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Após a lavagem em PBS, os anticorpos secundários foram administrados por uma hora conforme listado: IgG H&L anti-coelho de burro, Alexa Fluor 488 (diluição 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, Reino Unido) e IgG H&L anti-camundongo de cabra, TRITC (diluição 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-dicloridrato de fenilindol (DAPI) foi usado para coloração dos núcleos e após 2-min de incubação, as lâminas foram lavados em PBS e cobertos com meio de montagem e lamínulas. A coloração não específica foi evitada usando o bloco de proteína (ab64226; Abcam, Cambridge, Reino Unido) antes da aplicação do anticorpo primário. Como controle negativo, foi realizado um teste de pré-adsorção, enquanto a especificidade dos anticorpos secundários foi verificada pela omissão dos anticorpos primários dos procedimentos de coloração.

4.3. Microscópio eletrônico

Fixação derimtecidos foi realizado em paraformaldeído a 4 por cento por 24 h, seguido de pós-fixação em tetróxido de ósmio a 1 por cento por 1 h. O processo de desidratação foi realizado com etanol em série e finalizado com inclusão em resina LX 112 [22]. Cortes finos de um micrômetro foram corados com azul de toluidina e estudados para selecionar cortes ultrafinos. Cortes ultrafinos com espessura de 0,05 micrômetros foram examinados após coloração com acetato de uranila e citrato de chumbo. O microscópio JEOL 1200 EX foi usado para obter as microfotografias.

4.4. Análise genética

Conforme descrito anteriormente [19], usando leucócitos do sangue periférico, o DNA genômico foi extraído. Uma mutação homozigótica missense no gene NPHS1 foi encontrada (c.1096A > C; p.Ser366Arg) o que confirmou o diagnóstico de síndrome nefrótica congênita do tipo finlandês (CNF) [57].

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4.5. Análise de dados

A análise da seção foi realizada em um microscópio de fluorescência FL usando 3 canais de fluorescência FL (Olympus BX51, Tóquio, Japão). As imagens foram capturadas pela câmera digital DP71 (Olympus, Tóquio, Japão) com ampliação de alta potência (×40). Apenas orenalcórtex contendo túbulos contorcidos proximais (pct), túbulos contorcidos distais (dct) e glomérulos (g) foram de interesse. As imagens foram então processadas pelo software ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA, https://imagej.nih.gov/ij/ (acessado em 15 de outubro de 2018), 1997–2021. ) e Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Califórnia, EUA) para avaliação posterior. Antes da contagem de células, a ferramenta ImageJ de canais divididos foi usada. Depois, a foto microscópica de imunofluorescência original foi subtraída pelo canal vermelho ou verde (dependendo de qual era o canal original) usando a ferramenta ImageJ da calculadora de imagem para evitar vazamento de sinal. Valores abaixo do nível de limiar 50 foram considerados negativos. Contamos sinais imunorreativos em células de pelo menos 20 estruturas (pct, dct ou g) por estágio ou número positivo geral de células por microfoto de displásico multicísticorimtecido, FSGS e CNF. Classificamos as células como positivas se o sinal de imunofluorescência se acumular em qualquer nível da membrana, citoplasma ou núcleo acima do valor 50 medido no software ImageJ usando o comando threshold. As células negativas foram categorizadas como células com ausência de qualquer imunorreatividade. Dois investigadores independentes analisaram os dados.

4.6. Análise Semiquantitativa

A intensidade do sinal de coloração de -tubulina, inversão e DVL-1 foi avaliada por dois pesquisadores independentes usando o software ImageJ. A intensidade geral do sinal foi medida depois que a imagem foi definida no tipo 8-bit; posteriormente, a intensidade da coloração do marcador foi avaliada em 20 pct, dct eg medindo a área delineada da estrutura. Caso os resultados entre os avaliadores fossem diferentes, um terceiro pesquisador independente esclareceu a dúvida. A intensidade máxima do sinal para -tubulina foi de 84,125 ± 3,214 SD, para inversão foi de 71,50 ± 2,715 SD e para DVL -1 80,916 ± 1,875 SD. A maior saturação da cor do sinal nas fotografias do microscópio foi marcada como 3 (66,66-99,99 por cento da intensidade geral da imagem do sinal), seguida por 2 (33,33-66,66 por cento) para a intensidade intermediária do sinal e 1 (0,33 por cento -33,33 por cento) para baixa intensidade de sinal (Tabela 1.).

4.7. Análise estatística

Para a determinação das diferenças entre estágios e estruturas, foi feito o teste de Kruskal-Wallis, seguido do post hoc de Dunn usando o software GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego Califórnia, EUA, www.graphpad.com (acessado em 15 de outubro 2018.)). O número de células positivas foi expresso em porcentagem como valor médio ± desvio padrão (DP), enquanto a significância estatística foi reconhecida em p < 0,05.="" o="" número="" de="" estruturas="" analisadas="" foi="" de="" 4.200="" em="" 35="" amostras,="" com="" um="" número="" total="" de="" 135.256="" células="" contadas.="" usamos="" 2-way="" anova="" com="" teste="" post="" hoc="" de="" sidak="" para="" testar="" diferenças="" na="" expressão="" de="" -tubulina,="" inversão="" e="" dvl-1="" em="" diferentes="" estágios="" de="" desenvolvimento.="" para="" estudar="" a="" expressão="" de="" proteínas="" em="" relação="" ao="" tempo="" de="" desenvolvimento,="" usamos="" a="" regressão="" linear.="" a="" anova="" unidirecional="" seguida="" pelo="" teste="" post="" hoc="" de="" tukey="" foi="" usada="" para="" explorar="" as="" diferenças="" na="" expressão="" de="" -tubulina,="" inversão="" e="" dvl-1="">rimtecido em comparação com os tecidos de MCDK, FSGS e CNF. As diferenças na expressão de proteínas entre MCDK, FSGS e CNF foram investigadas com 2-way ANOVA seguido pelo teste post hoc de Sidak. A ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey foi usada para avaliar as diferenças no comprimento dos cílios e altura das células epiteliais de pct entre controle saudável e patológico.rimtecidos. Os dados foram apresentados como valor médio ± desvio padrão (DP) com diferença estatística reconhecida em p <>