Explorando o potencial dos extratos de algas islandesas produzidos por extração assistida por campos elétricos pulsados ​​aquosos para aplicações cosméticas Parte 2

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2.4. Capacidades antioxidantes de extratos de algas islandesas

A. esculenta teve a atividade de eliminação de DPPH mais forte entre os extratos brutos das três espécies de algas (p<0.05), with="" scavenging="" effects="" higher="" than="" 90%(table="" 3).="" compared="" with="" the="" different="" standard="" solutions,="" a.esculenta="" showed="" comparable="" scavenging="" activity="" as="" 100ug/ml="" of="" ascorbic="" acid="" (87.9%),="" gallic="" acid="" (91.0%),="" and="" α-tocopherol="" (87.9%).="" our="" results="" were="" in="" agreement="" with="" recent="" studies="" [50],="" which="" also="" reported="" a="" positive="" antioxidant="" activity="" of="" a.esculenta="" extracts.="" surprisingly,="" no="" significant="" differences="" in="" antioxidant="" activity="" were="" observed="" between="" the="" different="" extraction="" methods="" tested="" (p="">0.05). Esperava-se que os extratos de PEF apresentassem melhores valores antioxidantes do que os extratos produzidos com a extração tradicional a quente, uma vez que outros estudos mostraram que técnicas verdes (como extração assistida por micro-ondas ou extração enzimática) poderiam efetivamente evitar a decomposição de compostos bioativos, exibindo maior atividades antioxidantes [59,60].

A capacidade dos extratos de algas marinhas em reduzir o íon férrico (Fe8#) a ferroso (Fe2 mais) e a capacidade de seqüestrar o radical ABTS também foi estudada, pelo método FRAP e ABTS, respectivamente. Os resultados do FRAP mostraram tendências semelhantes ao DPPH, mostrando que A. esculenta teve a capacidade mais forte de reduzir íons férricos (Fe3 plus ) a ferrosos (Fe2 plus ) entre os extratos brutos das três espécies de algas (p<0.05). however,="" a="" different="" behavior="" was="" found="" for="" the="" abts.="" all="" seaweed="" extracts="" showed="" a="" similar="" ability="" to="" scavenge="" the="" radical="" abts="" (p="">0.05), indicando que essas espécies provavelmente contêm alguns compostos eficientes que são responsáveis ​​por sua atividade de eliminação.

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Em geral, as algas marrons são conhecidas por apresentarem maior potencial antioxidante em comparação com as famílias vermelhas e verdes. Nossos resultados também mostraram que extratos aquosos de A. esculenta exibiram atividades antioxidantes efetivas no que diz respeito à eliminação de radicais livres e poder redutor, sugerindo que A. esculenta poderia ser um recurso para antioxidantes naturais. A alta atividade antioxidante observada para os extratos de A. esculenta pode estar ligada ao alto teor de compostos fenólicos determinados nos extratos de algas marrons. Em muitos estudos, a atividade antioxidante dos extratos de algas tem sido atribuída aos compostos fenólicos, mostrando correlações positivas entre o conteúdo fenólico e a capacidade de eliminação principalmente com DPPH [62,63]. Resultados de correlação semelhantes foram encontrados no estudo atual para extratos de A. esculenta (veja uma discussão melhor na Seção 2.6. Correlações entre compostos químicos e propriedades bioativas).

2.5. Atividades Inibitórias Enzumáticas de Extratos de Algas Marinhas da Islândia

Extratos de algas islandesas exibiram efeitos inibitórios positivos para todas as enzimas testadas (Tabela 4), abrindo novos caminhos para a exploração de inibidores enzimáticos naturais de recursos de algas. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que as atividades inibitórias enzimáticas de extratos de algas islandesas produzidas por PEF foram testadas.

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2.5.1. Atividade de Inibição da Colagenase

Os extratos de A.esculenta mostraram inibição positiva da colagenase variando de 68 a 91 por cento, enquanto os extratos de P. palmaria e U. Lactuca exibiram atividades de inibição insignificantes contra a colagenase (Tabela 4). O extrato de água quente de A.esculenta exibiu 71,1 por cento de atividade de inibição da colagenase, superior à solução padrão de epigalocatequina-3-galato(EGCG)(63,2%) e comparável ao padrão positivo fornecido pelo kit enzimático comercial (74,9%). Um achado importante foi que os extratos de A. esculenta produzidos pelo PEF apresentaram inibição da colagenase de 91 por cento , apresentando atividade ainda maior do que o inibidor fornecido pelo kit comercial. Deve-se destacar que esta atividade foi observada apenas nos extratos aquosos produzidos pelo PEF e não pela combinação de PEF mais HW. Esse comportamento pode ser explicado pela possibilidade do processo de água quente ter um efeito negativo sobre os compostos responsáveis ​​pela inibição da atividade da colagenase. No entanto, estudos adicionais são necessários para explicar esses resultados devido à complexidade dos extratos brutos de algas. O referido grupo de pesquisa está atualmente trabalhando na identificação das moléculas de inibição em extratos de A. esculenta para melhor compreender esses efeitos positivos produzidos pelo PEF.

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Os resultados referentes à inibição da colagenase pelos extratos de A.esculenta estão de acordo com dados anteriores, nos quais A.esculenta está sendo utilizada em extratos comerciais devido ao seu efeito antienvelhecimento. A degradação do colágeno ocorre com o envelhecimento devido à atividade da colagenase, resultando em rugas na pele. A inibição da colagenase por compostos naturais é uma oportunidade interessante para produtos antienvelhecimento. Por exemplo, a SEPPIC, fornecedora de ingredientes para a indústria de cosméticos, está oferecendo um extrato lipofílico de A.esculenta(Kalpariane AD) [64].

2.5.2. Atividade de Inibição da Elastase

Only the crude extracts of A.esculenta inhibited elastase, exhibiting activities higher than 70% of inhibition (Table 4). However, the anti-elastase activities of A.esculenta extracts did not statistically differ among extraction methods (p>{{0}}.05). Comparado com soluções de quercetina, um conhecido inibidor de elastase que apresentou 100 por cento de inibição a 1 mM e 58,7 por cento a 0,5 mM, o desempenho dos extratos de A. esculenta foi alto.

A elastase é uma enzima proteinase que pode reduzir a elastina quebrando ligações peptídicas específicas. Consequentemente, a inibição da atividade da elastase na camada da derme pode ser usada para manter a elasticidade da pele [65]. Muitos extratos de plantas foram identificados como inibidores da elastase [17]; no entanto, poucas investigações foram realizadas sobre a inibição da elastase de recursos de algas. De acordo com dados da literatura, polifenóis extraídos de plantas são conhecidos por serem fortes inibidores de elastase e hialuronidase [66]. Um estudo recente relatou que os florotaninos, o tipo de tanino em algas marrons, extratos de algas marinhas Eisenia bicicletas e alga marrom Ecklonia cava, beneficiam a pele reduzindo significativamente a atividade da elastase [67]. Os extratos de A.esculenta produzidos neste estudo apresentaram os maiores valores de TPC e TFC em comparação com as demais espécies estudadas (Tabela 4), podendo ser por isso que os extratos aquosos de P. palmaria e U. Lactuca não apresentaram anti- atividades de elastase. Para confirmar esta hipótese, uma análise de correlação de Pearson foi conduzida, sugerindo que as atividades antienzimáticas se correlacionam positivamente com o conteúdo de substâncias fenólicas (veja uma discussão adicional na Seção 2.6. Correlações entre compostos químicos e propriedades bioativas).

2.5.3. Atividade de inibição da tirosinase

Os extratos de A.esculenta apresentaram inibição positiva da tirosinase superior a 90 por cento para todos os métodos de extração utilizados, enquanto os extratos de P.palmaria e U. Lactuca não exibiram efeitos inibitórios da tirosinase (Tabela 4). No entanto, as atividades anti-tirosinase dos extratos de A. esculenta não diferiram (p<0.05) with="" extraction="" methods.="" comparing="" the="" effect="" of="" a.esculenta="" extracts="" with="" the="" quercetin="" solutions="" tested,="" the="" crude="" extracts="" of="" the="" brown="" algae="" showed="" better="" inhibitory="" activities="" than="" these="" solutions(88="" and75%="" for="" the="" 0.5="" and="" 1="" mm="" quercetin="" solutions,="" respectively).="" based="" on="" the="" literature,anti-tyrosinase="" activities="" of="" plants,="" bacteria,="" and="" fungi="" have="" been="" reported="" by="" several="" researchers="" i68i.="" however,="" though="" different="" studies="" suggest="" that="" bioactive="" compounds="" derived="" from="" marine="" algae="" have="" a="" good="" potential="" to="" be="" utilized="" as="" skin="" whitening="" agents="" [13],="" this="" is="" still="" an="" unexplored="" domain="" and="" only="" a="" few="" studies="" have="" been="" carried="" out.="" most="" of="" the="" studies="" performed="" in="" this="" area="" have="" been="" focused="" on="" brown="" algae,="" agreeing="" with="" the="" results="" of="" the="" present="" study="" in="" which="" a.esculenta="" extracts="" exhibited="" the="" best="" anti-tyrosinase="" activities.="" for="" instance,="" phloroglucinol="" derivatives="" and="" phlorotannins,="" common="" secondary="" metabolites="" found="" in="" brown="" algae,="" have="" shown="" inhibitory="" activity="" against="" tyrosinase="" due="" to="" their="" ability="" to="" chelate="" copper="" [69].="" in="" a="" recent="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" lessonia="" trabeculate="" produced="" by="" microwave-assisted="" extraction="" inhibited="" a="" tyrosinase="" activity="" of="" 33.73%[60].in="" another="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" turbinaria="" conoides="" showed="" activity="" as="" an="" antioxidant="" and="" tyrosinase="" inhibitor,="" however,="" in="" this="" case,="" ethanol="" was="" used="" as="" solvent="" [70].="" a="" significant="" correlation="" between="" the="" inhibitory="" potency="" of="" polyphenols="" extracted="" from="" plants="" on="" mushroom="" tyrosinase="" has="" been="" reported="" in="" previous="" studies="" [68].="" likewise,="" the="" results="" of="" this="" study="" suggest="" that="" the="" inhibitory="" activity="" towards="" tyrosinase="" was="" positively="" correlated="" with="" flavonoid="" and="" phenolic="" content="" (see="" section="" 2.6.="" correlations="" between="" chemical="" compounds="" and="" bioactive="">

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A tirosinase desempenha um papel importante na biossíntese do pigmento melanina na pele. A melanina é responsável pela proteção contra a radiação ultravioleta nociva, que pode causar diversas condições patológicas [71]. Além disso, pode criar problemas estéticos quando a melanina se acumula como manchas hiperpigmentadas [72]. Assim, a incorporação de inibidores da tirosinase em produtos cosméticos pode ser atrativa devido aos efeitos clareadores e/ou clareadores.

2.5.4. Atividade de inibição da hialuronidase

Todos os extratos de algas marinhas exibiram atividade anti-hialuronidase significativamente alta (Tabela 4), apresentando resultados comparáveis ​​às soluções de ácido tânico (um conhecido inibidor de hialuronidase). Especificamente, os extratos de A.esculenta apresentaram 100 por cento de inibição para todos os métodos testados. Além disso, os extratos de U. Lactuca exibiram atividades superiores a 90 por cento de inibição, onde a inibição dos extratos produzidos por PEF (96,8 por cento o) e a combinação de PEF mais HW (97,3 por cento ) foi maior que a inibição produzida pelo tradicional método da água 93,4 por cento )(p<0.05). all="" p.palmaria="" extracts="" exhibited="" similar=""><0.05), the="" inhibition="" of="" the="" extracts="" produced="" by="" pef="" was="" (91.9="" %)and="" the="" combination="" of="" pef+hw="" (89.5%)="" and="" the="" traditional="" hot="" water="" method="">

Outros autores também descreveram a atividade anti-hialuronidase de diferentes extratos de algas marinhas, especialmente extratos ricos em florotaninos de algas marrons [73,74]. No entanto, até onde sabemos, esta é a primeira vez que foram relatadas atividades inibitórias de hialuronidase de extratos de P.palmata e U. Lactuca produzidos por PEF.

O ácido hialurônico é um componente importante da derme, onde está envolvido na reparação dos tecidos, se decompõe com o envelhecimento, causando rugas e perda de firmeza da pele. Nesse sentido, os inibidores de hialuronidase aumentam o nível de ácido hialurônico da matriz extracelular dérmica para a melhora da aparência da pele facial envelhecida [13].cistanchPortanto, os resultados deste estudo podem abrir novos caminhos para a exploração de inibidores naturais de hialuronidase de recursos de algas com potencial uso em produtos cosméticos.

Em resumo, os dados coletados permitiram concluir que os extratos de A.esculenta exibiram atividades inibitórias melhores do que P.palmaria e U.lactuca em relação às enzimas testadas. Sendo assim, a espécie de alga mais promissora com excelentes atividades antienzimáticas e por isso foi selecionada para novos estudos em nosso laboratório. Embora os extratos brutos de A. esculenta pareçam ser bons candidatos para experimentos in vitro, mais estudos precisam ser realizados para elucidar a identidade dos metabólitos responsáveis ​​por esses efeitos biológicos.

2.6. Correlações entre Compostos Químicos e Propriedades Bioativas

Os resultados da análise de componentes principais (PCA), mostraram que a principal separação dos grupos foi definida por PC1 e PC2, que responderam por 71,9 por cento e 14,5 por cento da variância dos dados, respectivamente (Figura 2). Os extratos de A. esculenta foram caracterizados por maiores teores de flavonóides e compostos fenólicos, efeitos inibitórios sobre enzimas (colagenase, tirosinase e elastase) e valores de DPPH e FRAP, do que as outras espécies, P. palmata e U.lactuca. Por outro lado, A. esculenta apresentou menor teor de carboidratos, principalmente em relação ao P. palmitato (que se localizava no lado oposto do PC1). A variação nos dados ao longo do PC2 foi principalmente relacionada à inibição de ABTS e hialuronidase. Conforme indicado pela localização na parcela, P. palmitato teve uma correlação mais forte com ABTS enquanto U.lactuca foi mais relacionada aos efeitos de inibição da hialuronidase, em comparação com essas duas espécies.

Uma correlação positiva alta e significativa entre TPC, TFC, DPPH, FRAP e efeitos inibitórios sobre colagenase, elastase e tirosinase foi demonstrada pela análise de correlação de Pearson (Tabela 5).

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Isso estava de acordo com estudos anteriores, relatando que os compostos fenólicos (incluindo flavonóides) são os principais contribuintes para a atividade antioxidante de várias algas marinhas [75-77]. A alta atividade antioxidante de extratos de macroalgas marrons tem sido relacionada a um grupo específico de polifenóis, florotaninos, e sua estrutura molecular única. Phlorotannis de algas marrons é relatado para ter até oito anéis de fenol interconectados que atuam como armadilhas de elétrons [78,79]. Esperava-se que os ABTs se correlacionassem com o TPC e outros parâmetros antioxidantes. Possíveis razões podem ser que os métodos são baseados em diferentes condições de reação e que a reatividade difere tanto em relação ao tempo quanto à faixa de componentes. Por exemplo, o reagente ABTS reage com uma gama mais ampla de antioxidantes do que o radical DPPH [80]. Por outro lado, uma das limitações mencionadas para o ABTS é uma reação longa e o tempo geral de reação pode não permitir atingir um ponto final.

Os resultados indicam que existe uma alta correlação positiva entre TPC e TFC para a atividade inibitória da colagenase, elastase e tirosinase ({{0}}.93-0,99), enquanto a relação com a inibição de hialuronidase não foi tão forte (r=0,42 e 0,54, respectivamente). Isso indica que outros componentes podem ter contribuído para o efeito inibitório dos extratos. Outros estudos relataram que os polissacarídeos têm atividade inibidora da hialuronidase, por exemplo, ácido algínico em algas marrons [81,82]. Mais estudos sobre a composição química das espécies de macroalgas para os efeitos de compostos isolados sobre a enzima são necessários para avaliar a contribuição de cada componente químico, pois neste estudo o foco foi em extratos brutos. Os achados estão em consonância com estudos anteriores, afirmando que a composição química e os níveis de bioatividade dos extratos variam significativamente entre as três linhagens (algas vermelhas, verdes e marrons) e entre diferentes espécies pertencentes ao mesmo filo e são influenciados pela idade e tipo de tecido. Além disso, a composição e as características dependem de muitos fatores ambientais que afetam a distribuição e o crescimento das macroalgas. Por exemplo, luz (radiação UV), temperatura, disponibilidade de nutrientes, exposição ao ar, movimento da água, exposição a ondas e salinidade. A temperatura tem sido descrita como o fator que tem os efeitos mais fortes na formação de pigmento e concentração de nutrientes, salinidade e radiação UV como os fatores que influenciam a concentração de TPC [83].

A distribuição de diferentes espécies de macroalgas varia com a profundidade da água. As posições mais altas da costa na zona entre-marés ou litoral são mais estressantes, pois as espécies que crescem lá devem suportar múltiplas mudanças nos fatores abióticos devido às mudanças das marés. Por exemplo, o efeito de secagem do ar, altas irradiâncias solares (na maré baixa), mudanças na salinidade e temperatura e, sob condições de baixas temperaturas do ar, incluindo congelamento. Abaixo da marca d'água, o aumento da profundidade resulta em uma diminuição muito rápida na intensidade da luz e menos exposição à irradiância.

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As algas que crescem na faixa de maré têm menor sensibilidade à radiação UV e se recuperam mais rapidamente do estresse solar. Já as algas que crescem na zona sublitoral são mais sensíveis à radiação UV e têm menor recuperação do estresse solar [84]. Ao mesmo tempo, a coluna de água fornece proteção. No presente estudo, a exposição à luz solar foi presumivelmente mais forte para P. palmitate, em comparação com as outras espécies. Outros estudos mostraram que a formação de MAAs está diretamente relacionada à luz solar [85], protegendo os organismos contra a radiação UV-A e UV-B. Além disso, foi demonstrado que a quantidade específica de MAAs diminuiu com o aumento da profundidade de coleta. Kelps, como A.esculenta, são conhecidos por crescer na zona sublitoral superior, mas também se estendem até o intertidal mais baixo, logo acima da marca d'água baixa. Ou seja, a coluna de água forneceu proteção mais forte do que para P. palmitato. Além disso, as características morfológicas são diferentes, as lâminas de A.esculenta são mais espessas em relação às outras duas espécies. IU. lactuca, crescendo principalmente no entremarés e sublitoral é capaz de fotossintetizar e crescer sob irradiâncias muito baixas. A exposição à luz UVB foi indicada para acelerar a recuperação dos parâmetros fotossintéticos de U.lactuca dos efeitos negativos da luz UVA. É menor, mais simples em estrutura e de vida mais curta (3 meses) do que A.esculenta (5-7 anos) e P. palmata, que tem um novo crescimento a cada ano.

Em resumo, pode-se supor que as principais diferenças nas propriedades dos extratos são a variação no tempo de vida, características morfológicas e condições de crescimento das espécies de algas.

3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais

As algas islandesas U.lactuca (algas verdes), A.esculenta (algas marrons) e P. palmitate (algas vermelhas) foram fornecidas pelos mexilhões e algas azuis da Islândia, que colheram algas marinhas em Breidafjordur (Islândia Ocidental). as algas marinhas foram secas (até aproximadamente 90 por cento de material seco), moídas e entregues embaladas a vácuo. As amostras foram mantidas em local seco e escuro à temperatura ambiente até serem utilizadas.

Tirosinase de cogumelo, L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), elastase de pâncreas suíno, ácido ascórbico, N-Succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida(AAPVN), hialuronidase de testículos bovinos, quercetina, a-tocoferol, ácido tânico,2,2-difenil-1-picrilhidrazil(DPPH),2,4,6-Tripiridil-s-triazina(TPTZ), Trolox, Folin- O reagente Ciocalteu, ácido gálico e um kit de ensaio colorimétrico de atividade de colagenase (MAK293) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA). O sal de sódio de ácido hialurônico foi adquirido da MakingCosmetics (Redmond, WA, EUA). Todos os outros produtos químicos e reagentes utilizados eram de grau analítico e obtidos da VWR International, LLC. Água deionizada (Elix Essential, Merck, Darmstadt, Alemanha) foi usada para a extração e preparação de soluções à base de água.

3.2. Projeto Experimental

Um planejamento fatorial foi usado para avaliar os efeitos de espécies de algas islandesas (U. Lactuca, A. esculenta, P. palmitate) e tratamento de extração (extração de água quente (HW,95 graus), extração assistida por PEF (PEF) e a combinação de ambas as técnicas (PEF mais HW), na composição e bioatividade do extrato (Tabela 6) A extração foi realizada em triplicata para cada grupo e cada réplica do extrato foi analisada em triplicata.

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3.3. A extração de bioativos das algas islandesas

A exploração da biomassa de macroalgas em diferentes níveis tem motivado os cientistas a explorar técnicas de extração mais ecologicamente corretas, eficientes e econômicas, baseadas em abordagens de extração verde. Neste trabalho, a extração assistida por PEF foi avaliada como um método novo e verde para produzir extratos funcionais, enquanto a extração tradicional com água quente foi usada para comparação. Além disso, estudou-se o efeito da combinação de ambas as técnicas, tratamento PEF de macroalgas seguido da extração tradicional com água quente, na recuperação bioativa. Devido à esperada eletroporação produzida nas membranas celulares após o tratamento físico, a extração seguinte com água quente poderia facilitar ainda mais a liberação do material intracelular [86], aumentando o campo de extração. Um tempo após o tratamento é necessário para que os materiais se difundam para fora das células [87,88], e neste experimento, as suspensões esperaram durante a noite até a separação do líquido (extrato) da polpa.

Em relação ao meio de extração, a água destilada foi usada para produzir os extratos de algas marinhas para superar as limitações quanto ao uso de solventes tóxicos e orgânicos. A água provou ser um bom solvente para a extração de vários compostos bioativos de algas marinhas [46,89-91], além de ser ecologicamente correta. Além disso, a água é comumente usada para extração assistida por PEF, pois é um bom condutor de eletricidade.

3.3.1. Procedimentos de extração

Para cada réplica em cada grupo, algas marinhas (15 g) foram embebidas durante a noite à temperatura ambiente (22 graus) em água desionizada (300 mL). Em seguida, a suspensão foi tratada com PEF (PEF), aquecida (HW), ou tratada com PEF e aquecida (PEF mais HW). As suspensões foram mantidas durante a noite em um refrigerador seguido de filtração com papel de filtro grosso (20 µm). Em seguida, os filtrados (extratos) foram armazenados a 4 graus até suas análises.

A extração assistida por campo elétrico pulsado foi realizada usando um gerador de pulsos construído internamente. Ele tinha um capacitor FuGHCK-200-2000 (Fu.G.Elektronik GmbH, Rosenheim, Alemanha) e centelhador (18,5 kV OG75, Perkin-Elmer Optoelectronics, GMBH, Wiese-baden, Alemanha). O equipamento PEF gerou pulsos de decaimento exponencial com largura de 0,96 us e amplitude de 18 kV. Uma câmara de tratamento de plexiglass com as dimensões (L× H× W) 20×8×2,5 cm, com a menor distância entre os eletrodos da placa, foi usada para tratar as suspensões com um campo elétrico de 8 kV/cm a 1,2 Hz por 10 min. . Os extratos HW foram preparados aquecendo a suspensão em um béquer em banho-maria termostático e mantidos a 95 graus por 45 min. Para o campo elétrico pulsado combinado e tratamento de aquecimento, as suspensões foram tratadas com PEF e, em seguida, colocadas em um béquer, aquecidas em banho-maria e mantidas a 95 graus por 45 min.

3.3.2. Medições de condutividade, pH e temperatura

A condutividade elétrica e o pH das suspensões de algas marinhas foram medidos após a embebição e após os tratamentos de extração, à temperatura ambiente, usando um medidor de pH (Orion StarTM A215 pH/Conductivity Benchtop Meter, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) equipado com um sensor de condutividade e eletrodo de combinação de triodo pH/ARC. Além disso, as mudanças de temperatura devido aos tratamentos foram registradas.

3.4. Perfis Espectrais dos Extratos de Algas Marinhas

Os espectros de absorção UV-VIS dos diferentes extratos de algas marinhas foram medidos na faixa de 200 a 450 nm usando um espectrofotômetro de feixe duplo Thermo Scientific Evolution 350 UV-Vis (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) com cubetas de quartzo de 1 cm. Três varreduras foram realizadas para cada extrato de algas marinhas.

3.5. Determinação do Conteúdo Polifenólico Total

O conteúdo fenólico total (TPC) em extratos de algas marinhas foi determinado usando o reagente Folin-Ciocalteu seguindo um método ligeiramente modificado descrito por Zhang [92] usando um Espectrofotômetro Multiskan Sky Microplate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA）. Um volume de 20 μL de extrato de algas marinhas ou solução padrão em série foram misturados com 100 μL de reagente Folin-Ciocalteu (10 por cento em água destilada). Após 5 min, 80 μL de solução de carbonato de sódio a 7,5 por cento (/p) foi adicionado. A mistura de reação foi incubado à temperatura ambiente e no escuro por 30 min. A absorbância foi medida no comprimento de onda de 760 nm. Água destilada foi usada como branco. Uma curva padrão de ácido gálico foi usada para determinar o conteúdo fenólico total e expresso em ug de equivalentes de ácido gálico（ GAE）por grama de material seco (ug GAE/g do）.

3.6. Determinação do teor total de flavonóides

O conteúdo total de flavonóides (TFC) em extratos de algas marinhas foi determinado pelo método descrito por Kamtekar 【93】 e adaptado para 96-microplacas de poços. Resumidamente, um volume de 25 μL de extrato de algas marinhas ou solução padrão em série foi misturado com 100 μL de nitrito de sódio （0,375 por cento w/o）. Após 5 min, 25 μL de cloreto de alumínio (3 por cento w/o) foi adicionado à mistura e incubado por 6 min à temperatura ambiente. Em seguida, 100 μL de hidróxido de sódio （2 por cento w/ø）foi adicionado à mistura e misturado. Imediatamente, a absorbância foi medida no comprimento de onda de 510 nm. Água destilada e etanol foram usados ​​como branco. Uma curva padrão de quercetina (dissolvida em etanol) foi usada para determinar o conteúdo fenólico total e expressa como ug de equivalentes de quercetina (QE) por grama de material seco (ug QE/g do). 3.7. Determinação do Teor de Carboidratos

O teor de açúcar livre foi medido de acordo com o método descrito por [94], com pequenas modificações. A 50 μL de solução de fenol (4 por cento) e 250 μL de ácido sulfúrico (96 por cento) foram adicionados a 100 μL de amostra ou solução padrão. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, a absorvância da mistura foi lida a 490 nm. Uma curva padrão de glicose foi usada para determinar o teor total de carboidratos e expressa em mg de equivalentes de glicose (GluE) por grama de material seco (mg GluE/g do).

3.8. Propriedades antioxidantes dos extratos de algas marinhas

3.8.1.2,2 Ensaio de eliminação de radicais livres de difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)

A atividade antioxidante (DPPH) dos extratos de algas marinhas foi determinada seguindo a metodologia descrita anteriormente 【94】 com algumas modificações. Resumidamente, 200 μL de solução de 10,825 × 10-5 M DPPH foram adicionados a 100 uL de amostra (1:1 em metanol) em uma placa de 96-poço. O mesmo volume de DPPH foi misturado com 50μL padrão mais 50μL de metanol. Em seguida, as amostras e o padrão foram incubados em local escuro à temperatura ambiente por 30 min. A absorbância foi medida no comprimento de onda de 517 nm. A água destilada foi usada como branco. A capacidade de eliminar o radical DPPH foi calculada usando a seguinte equação: onde o controle é a absorbância do controle (solução de DPH sem amostra), a amostra A é a absorbância da amostra de teste (solução de DPPH mais amostra de teste) e a A o branco da amostra é a absorbância somente da amostra (amostra sem solução DPPH) e o branco do Ametanol é a absorbância somente do metanol. Antioxidantes comerciais (ácido ascórbico, ácido gálico e -tocoferol) foram usados ​​como controles positivos.

3.8.2. Ensaio do Poder Antioxidante Redutor de Íons Férricos (FRAP)

A atividade FRAP foi medida de acordo com o método de Benzie e Strain [95]. Resumidamente, tampão acetato (300mM,pH3,6),2,4,6-tripiridil-s-triazina(TPTZ)10mM em 40mMHCl e FeCl; 6H-O (20 mM) foram misturados na proporção de 10:1 para obter o reagente FRAP de trabalho. A mistura reaccional foi incubada a 37 graus durante 10 min. Uma amostra de 50 μL de cada extrato foi misturada com 150 μL de solução FRAP de trabalho por 8 min à temperatura ambiente. A absorbância do produto colorido, Ferrous-TPTZ foi medida no comprimento de onda de 593 nm. Os valores de FRAP de extratos de algas marinhas foram expressos como uM de equivalentes de Trolox (TE) por grama de material seco.

3.8.3.2,2 Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)(ABTS)

A análise foi realizada utilizando o protocolo de descoloração ABTS [76] com algumas modificações. Um cátion radical ABTS (ABTS plus ) foi produzido pela reação de ABTS (66mg) com 10 mL de solução de persulfato de potássio (2,45 mM). A mistura foi deixada no escuro à temperatura ambiente por 12-16 h antes do uso. A solução ABTS plus foi diluída com água até uma absorbância de 0,700 a 734 nm. A mistura reacional (200 ul) foi transferida para uma microplaca, foram adicionados 50 μL da amostra e, em seguida, 150 μL da solução reagente. A placa foi agitada por 10 s em velocidade média, e a absorbância foi medida a 734 nm após 5 min de incubação em temperatura ambiente. Uma curva padrão foi preparada traçando a inibição de A734nm de padrões Trolox em função de suas concentrações. O valor da capacidade antioxidante equivalente de Trolox (TEAC) das amostras foi calculado usando a equação obtida a partir da regressão linear dos valores de A734nm substituídos pela curva padrão para cada amostra:

3.9. Atividades anti-enzimáticas de extratos de algas marinhas

3.9.1. Ensaio de Inibição de Colagenase

Um kit de ensaio colorimétrico de atividade de colagenase (MAK293), adquirido de Sigma-Aldrich, foi usado para determinar a inibição de colagenase de extratos de algas marinhas. O kit mediu a atividade da colagenase usando um peptídeo sintético (FALGPA) que imita a estrutura do colágeno. O procedimento foi realizado de acordo com as instruções do kit.

3.9.2. Ensaio de Inibição da Elastase

A inibição da elastase de extratos de algas marinhas foi investigada em solução tampão TRIS com o método modificado conforme descrito anteriormente 【96】. Resumidamente, 100 μL de solução tampão TRIS 0,1 M （pH8,0）, 25 μL de elastase（1 U/mL em tampão TRIS）e 25μL de extratos de amostra foram misturados e incubados por 15 min a 30 C antes de adicionar o substrato para iniciar a reação. Após o tempo de incubação, 50μL de solução de 2 mM AAAPVN foi adicionado. Em seguida, a absorbância em 420 nm foi monitorada por 20 min usando um leitor de microplacas sob uma temperatura constante de 30 C. Finalmente, a inibição da elastase foi calculada em porcentagem usando a equação: onde controle Abs é a absorbância do ensaio usando o tampão em vez de inibidor(amostra) e Absmple é a absorbância dos extratos da amostra. A quercetina foi usada como controle positivo. O tampão Tris foi usado como branco.

3.9.3. Ensaio de Inibição da Tirosinase

O ensaio inibitório da tirosinase foi realizado de acordo com o método descrito anteriormente por 【66】 usando L-DOPA como substrato. 20 μL da amostra, 10 μL de solução de tirosinase de cogumelo （50 U/mL em tampão fosfato） e 80 μL de tampão fosfato （pH=6.8）foram misturados em uma microplaca e pré-incubados a 37C por 5 min. Em seguida, foram adicionados 90 µL de L-DOPA (2 mg/mL). A formação de dopacromo foi imediatamente monitorada por 20 min a 475 nm em um leitor de microplacas sob temperatura constante de 37 graus. A porcentagem de inibição da enzima tirosinase foi calculada usando a equação: onde controle Abs é a absorbância do ensaio usando o tampão em vez do inibidor (amostra) e A amostra é a absorbância dos extratos da amostra. A quercetina foi usada como controle positivo. O tampão fosfato foi usado como branco.

3.9.4. Ensaio de Inibição de Hialuronidase

A atividade inibitória da hialuronidase foi medida conforme descrito anteriormente por [66] com poucas modificações. Um volume de 100 ulof tipo-1-hialuronidase de testículos bovinos（2100 U/mL）dissolvido em 0,1 M tampão de acetato (pH 3,5) foi misturado com 100 μL de extrato e incubado a 37 graus por 20 min. Um volume de 200 μL de 6 mM de cloreto de cálcio foi adicionado à mistura de reação e, em seguida, a mistura foi incubada a 37 graus C por 20 min. Esta hialuronidase ativada por Ca2 plus foi tratada com 250 µL de hialuronato de sódio (1,2 mg/mL) dissolvido em tampão acetato 0,1 M (pH 3,5) e depois incubado em banho-maria a 37 graus por 40 min. Um 50 μL de hidróxido de sódio 0,9 M e 100 μL de borato de sódio 0,2 M foram adicionados à mistura de reação e, em seguida, incubados em banho-maria fervente por 5 min. Após arrefecimento à temperatura ambiente, adicionaram-se 250 uL de solução de p-dimetilaminobenzaldeído (DAMB) à mistura reaccional. A solução DAMB foi preparada dissolvendo 0,25 g de DAMB em 21,88 mL de ácido acético 100 por cento e 3,12 mL de ácido clorídrico 10N. O grupo controle foi tratado com 100 μL de 5% de água em vez de extrato. A absorbância foi medida no comprimento de onda de 585 nm após 45 min. A porcentagem de inibição enzimática foi calculada usando a seguinte equação: onde Abs controle é a absorbância do ensaio usando o tampão em vez do inibidor (amostra) e Abs amostra é a absorbância dos extratos da amostra. O ácido tânico é usado como padrão de referência.

3.10. Análise Estatística

A média da análise triplicada de cada extrato foi calculada e utilizada para encontrar os valores médios e desvios padrão para cada grupo (n=3). Modelos lineares gerais (GLM) para fatores fixos foram aplicados para avaliar os principais efeitos e interações bidirecionais dos fatores experimentais (espécies e métodos de extração) nas variáveis ​​medidas. Além disso, ANOVA e o teste de Tukey-Kramer foram usados ​​para identificar<0.05)differences between="" the="" groups.="" pearson="" correlation="" was="" used="" to="" evaluate="" linear="" relationships="" between="" the="" variables.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" was="" used="" to="" detect="" structure="" in="" the="" relationship="" between="" measured="" variables="" and="" experimental="" factors.="" the="" pca="" reduces="" voluminous="" data="" to="" a="" small="" set="" of="" linear="" combinations="" of="" related="" variables(i.e.,="" factors)="" based="" on="" patterns="" of="" correlation="" among="" the="" original="" variables.="" the="" resulting="" linear="" attribute="" combinations="" can="" be="" used="" for="" profiling="" specific="" product="" characteristics="" based="" on="" the="" variables="" studied.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" ncss="" 2020="" statistical="" software="" (2020)="" (ncss,="" llc.,="" kaysville,="" ut,="">

4. Conclusões

Os resultados desta primeira experiência de triagem mostraram o potencial de três espécies de algas islandesas, proporcionando efeitos benéficos eficazes através de várias vias. A abordagem verde desenvolvida usando campos elétricos pulsados ​​aquosos apresentou resultados semelhantes à extração tradicional com água quente, apresentando várias vantagens, como sua natureza não térmica e menor tempo de extração (10 min vs. 45 min). Entre as três espécies de algas, a macroalga marrom A.esculenta apresentou o maior teor de TPC e TFC também exibindo as maiores capacidades antioxidantes. tirosinase e hialuronidase sendo a espécie de alga mais promissora com excelentes atividades antienzimáticas para uso no clareamento da pele, antienvelhecimento e saúde da pele. Curiosamente, os extratos de A.esculenta produzidos pelo método PEF apresentaram uma inibição da colagenase de 91 por cento , maior do que a atividade de inibição apresentada pela extração tradicional com água quente e ainda maior do que o inibidor fornecido pelo kit comercial. Em conclusão, nosso estudo preliminar sugere que extratos à base de algas islandesas, especialmente os extratos da macroalga marrom A. esculenta, produzidos por extração assistida por campos elétricos pulsados ​​aquosos são ingredientes funcionais potenciais que podem ser usados ​​como compostos ativos para formulações cosméticas e cosmecêuticas no futuro próximo.

Este artigo foi extraído de Mar. Drugs 2021, 19, 662. https://doi.org/10.3390/md19120662 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs