Experimento 4 Efeito do Glicosídeo Feniletanol de Cistanche Deserticola na Síndrome de Depressão da Perimenopausa de Camundongos Materiais e Métodos 1 Materiais Experimentais

1.1 Animais experimentais

Camundongos de grau SPF, raça Kunming, fêmeas, 18 ~ 22g, fornecidos pela Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., este lote de ratos número de certificado: 0016003; número do certificado de laboratório SYXK (Yu) 2010-001. 1.2 Medicamentos experimentais

Cistanche feniletanol glicosídeofoi preparado conforme método do Experimento 1, e o teor atingiu 66,47%. Cápsula Gengnian'an, ingredientes: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, casca de peônia, Poria cocos, madrepérola, curculigo, Schisandra chinensis, magnetita, videira Polygonum multiflorum, Uncaria, trigo flutuante, polygonum multiflorum . Funções e Indicações:Nutrir o yin e subjugar o yang, aliviar problemaseacalmar a mente. Usado para ondas de calor e sudorese da menopausa, tonturas, zumbido, irritabilidade e insônia. Especificações: 0,3g por cápsula. Uso e dosagem: Oral, 3 cápsulas de cada vez, 3 vezes ao dia. Fabricante: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Número do lote de produção: 121104. Número de aprovação: Nº de aprovação nacional do medicamento Z14021848.

QUANTO TEMPO DEMORA PARA O CISTANCHE FUNCIONAR?

Cápsulas moles de isoflavonas de soja e vitamina E, lista de ingredientes: isoflavonas de soja em pó, vitamina E, óleo de girassol, gelatina, glicerina, água, tartrazina, dióxido de titânio. Ingredientes e conteúdo icônicos: Cada 100g contém 55,2 mg de isoflavonas de soja (calculadas como genisteína) e 608,5 mg de vitamina E. Funções para a saúde: Aumentar a densidade óssea. Instruções e dosagem: Tomar 1 cápsula 2 vezes ao dia com água morna. Especificações: 500mg×100 cápsulas. Fabricante: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Número do lote de produção: 13070302. Número de aprovação: Guoshijianzi G20080032. 1.3 Reagentes experimentais

Carboximetilcelulose de sódio, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., número de lote: 20120418; penicilina sódica para injeção, North China Pharmaceutical Co., Ltd., especificação: 4 milhões de unidades, número do lote de produção: c1206807; solução de formaldeído (grau analítico), Yantai City Shuangshuang Chemical Co., Ltd., número do lote de produção: 20130902; Injeção de cloreto de sódio a 0,9%, Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd.; especificação: 250ml, número do lote de produção: 1301265303;

Hidrato de cloral, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, número de lote 20120827; kit de detecção ELISA E2 para mouse, empresa de P&D, número de lote: 20140101A; kit de detecção mouse T ELISA, R&D Company, número de lote: 20140101A; kit de detecção LH ELISA de mouse, R&D Company, número de lote: 20140101A; Kit de detecção Mouse FSH ELISA, R&D Company, número de lote: 20140101A;

Kit de detecção Mouse DA ELISA, R&D Company, número de lote: 20140101A; Mouse 5-Kit de detecção HT ELISA, R&D Company, número de lote: 20140101A. 1.4 Instrumentos experimentais

Balança eletrônica, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co., Ltd., modelo: JY601; balança analítica eletrônica, Ohaus (Shanghai) Company, modelo: AR1140/C; centrífuga de mesa de alta velocidade, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, modelo: TGL-168 ; Banho-maria termostático elétrico, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd., modelo: HWS12; Testador de atividade autônoma de mouse, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., modelo: ZZ-6; Medidor para evitar o escuro do mouse, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., modelo: BA-200; testador de suspensão traseira, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., modelo: TS-200; centrífuga refrigerada de alta velocidade, filial de Zhongjia da HKUST Innovation Co., Ltd., modelo: KDC-160HR; instrumento de pipetagem ajustável, Shanghai Leibo Analytical Instrument Co., Ltd.;

Leitor de microplacas, American BIO-RAD Company, modelo: 680;

Microscópio elétrico, Japan OLYMPUS Company, modelo: BX61.

2 métodos experimentais

2.1 Modelagem e administração de medicamentos

90 camundongos Kunming fêmeas com peso corporal de 23-25g foram selecionados, e 10 foram selecionados aleatoriamente como o grupo em branco e foram submetidos a cirurgia simulada, e os camundongos restantes foram usados ​​para criar modelos da perimenopausa. Após a pesagem, os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral 10% (0,03ml/10g) e a posição abdominal foi fixada. Em seguida, o cabelo foi cortado da parte de trás do camundongo sob a última costela, na intersecção da linha axilar média e cerca de 1 cm da parte externa da coluna, e então incisado após a desinfecção. A pele e os músculos das costas têm cerca de 0,5-1cm de largura. Uma massa gorda branca leitosa e brilhante pode ser vista no campo da incisão, e o ovário está embutido nela. Use uma pinça pequena para agarrar suavemente a massa gorda e puxá-la para fora da incisão, separe a massa gorda e você verá um grupo de ovários finos, irregulares e amarelo-avermelhados. Ao cortar, primeiro ligue as trompas de Falópio (incluindo a gordura) sob os ovários com fios finos e depois remova os ovários. Após a operação, os cornos uterinos são recolocados na cavidade abdominal, os músculos e a pele são suturados e ambos os ovários são removidos da mesma forma. Após a operação, os animais foram cuidadosamente criados e penicilina 200,{12}} u/kg (0,1 mL cada) foi injetada por via intramuscular para prevenir infecção por 3 dias consecutivos, uma vez ao dia. 5 dias após a operação, foi realizado exame de esfregaço vaginal em cada rato, um por um, uma vez por dia durante 5 dias consecutivos para determinar se os ovários foram completamente removidos. Os camundongos que apresentaram reação de estro no esfregaço foram descartados e 60 camundongos completamente castrados foram divididos aleatoriamente e uniformemente em 6 grupos para fins experimentais, a saber, grupo modelo, grupo Mengnianan, grupo isoflavona de soja, grande, médio eGrupo glicosídeo feniletanol Cistanche em dose baixa. Os animais de cada grupo receberam os medicamentos correspondentes no 10º dia após a cirurgia. Após 6 dias de administração, os ratos do grupo branco foram criados a 5 por gaiola, com comida e água normais, sem qualquer estimulação. Os 6 grupos modelo foram criados com 1 camundongo por gaiola e receberam estímulos diferentes aleatoriamente todos os dias. Sete fatores de estresse foram aplicados aleatoriamente em 18 dias: cama úmida (1g cama/1ml água); nadar em água gelada (4 graus, 5 min); estresse térmico (45 graus, 5 min); iluminação noturna (24h); pinçamento da cauda (1 min); privação de água (24 h); jejum (24h). Um estímulo foi dado aleatoriamente todos os dias, e cada estímulo não pôde aparecer continuamente por 18 dias.

Método de preparação: 0,5% CMC Método de preparação: Pesar 4g de carboximetilcelulose sódica e misturar com água destilada para perfazer 800ml.

As dosagens de doses grandes, médias e pequenas do grupo feniletanol glicosídeo Cistanche foram 200mg/kg, 10{{20}}mg/kg e 50mg/kg respectivamente (volume de administração 0,1ml/10g). Método de preparo: Pesar 2.000 mg, 1.000 mg e 500 mg de glicosídeo feniletanóide Cistanche respectivamente, dissolver com uma pequena quantidade de CMC 0,5%, ajustar o volume para 100ml, misturar bem e pronto. Cápsulas de Gengniangan (675mg/kg, misturadas com água destilada até 67,5 mg/ml, 0,1ml/10g, equivalente a 15 vezes a dosagem clínica); método de preparo: tomar 9 cápsulas de Gengniangan, primeiro usar uma pequena quantidade de 0,5% CMC Dissolve, depois ajustar o volume para 40ml e misturar bem para obter a dose de Suspensão de Cápsulas de Gengnianan (675mg/kg). Cápsula mole de vitamina E de isoflavona de soja (250mg/kg, use água destilada para fazer 25mg/ml, 0,1ml/10g, equivalente a 15 vezes a dosagem clínica); Método de preparação: Tome 2 cápsulas moles de vitamina E de isoflavona de soja, use-as primeiro. Dissolva uma pequena quantidade de CMC a 0,5%, depois ajuste o volume para 40ml e misture bem para obter a dose de suspensão de cápsulas moles de vitamina E de isoflavona de soja (250mg/kg ). Método de armazenamento: refrigerar, manter aquecido durante o uso.

Método de administração: Os animais de cada grupo receberam os medicamentos correspondentes no 10º dia após a cirurgia. O grupo Gengnian'an recebeu por via oral suspensão de cápsula de Gengnian'an 675 mg·kg-1 o grupo de isoflavona de soja recebeu por via oral 250 mg·kg-1 suspensão de cápsula mole de isoflavona de soja vitamina E e grande médio epequenas doses de Cistanchefeniletanol. O grupo glicosídeo recebeu doses grandes, médias e pequenas de Cistanche feniletanol glicosídeo 200mg·kg-1, 10mg·kg-1, 50mg·kg{{ 5}}, 0,1ml/10g respectivamente. O grupo branco e o grupo modelo foram gavajados com o mesmo volume de solução de CMC a 0,5% uma vez ao dia durante 30 dias consecutivos.

2.2 Itens de observação e métodos de detecção

Natação forçada: No primeiro dia após o término da estimulação de estresse crônico, o tempo de imobilidade dos camundongos em cada grupo dentro de 6 minutos foi medido durante 2-6 minutos. (Coloque os ratos de cada grupo em um copo de 2.000 mL. A temperatura da água é de 25 graus. Além do movimento mínimo necessário para manter a flutuação, os membros dos animais param de se mover e são registrados como imóveis. Registre o tempo total de imobilidade de 2 a 6 minutos dentro de 6 minutos) Teste de atividade voluntária: No segundo dia após o término da estimulação por estresse crônico, foi medido o número de atividades espontâneas de camundongos em cada grupo dentro de 5 minutos.

Método de evitar o escuro: No terceiro dia após o término da estimulação do estresse crônico, coloque a cauda do rato na caixa de medição voltada para a pequena abertura na câmara escura e conduza o treinamento. Após 24 horas, meça novamente a latência do mouse entrando na câmara escura pela primeira vez e o tempo que leva para entrar na câmara escura em 5 minutos. Número de choques elétricos.

Teste de suspensão da cauda: No 5º dia após o término da estimulação de estresse crônico, o tempo de imobilidade dos camundongos em cada grupo dentro de 6 minutos foi medido durante 2-6 minutos.

2 horas após a última dose (12 horas sem comida ou água), os camundongos foram pesados, os globos oculares foram removidos, o sangue foi coletado, o soro foi separado e os conteúdos de E2, T, LH e FSH no soro foram medidos. medido; os ratos foram então mortos por deslocamento das vértebras cervicais e os ratos foram dissecados. , remova o timo, o baço e o tecido uterino, pese seu peso úmido e calcule o índice do órgão (índice do órgão=peso úmido do órgão mg/peso do camundongo g), em seguida, remova o cérebro, corte a metade e prepare o cérebro homogeneizado de tecido. O imunoensaio enzimático foi utilizado para determinar o conteúdo dos neurotransmissores monoaminas 5-HT e DA no homogeneizado de tecido cerebral. Os tecidos do timo, baço, útero e cérebro foram fixados em solução de formaldeído a 10%, embebidos em parafina, seccionados e corados com HE. As alterações morfológicas de cada grupo foram observadas ao microscópio óptico. 2.3 Método de determinação do kit

Obtenha amostras de soro: Use tubos de ensaio livres de pirogênios e endotoxinas. Evite qualquer estimulação celular durante a operação. Após a coleta do sangue, centrifugue-o a 3.000 rpm por 10 minutos para separar rápida e cuidadosamente o soro e os glóbulos vermelhos. Obtenha amostras homogeneizadas de tecido: Adicione uma quantidade adequada de solução salina fisiológica ao tecido e amasse-o. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos e retirar o sobrenadante.

O método de determinação do kit ELISA de estradiol (E2) de camundongo (Rato) é o mesmo do Experimento 2. As concentrações dos produtos padrão (S0-55) são: 0, 4, 8, 16, 32 e 64 pmol/L.

O método de determinação do kit ELISA de testosterona em camundongos (T) é o mesmo do estradiol (E2). As concentrações dos produtos padrão (S0-55) são: 0, 50, 100, 200, 400, 800pg/mL.

O método de determinação do kit ELISA do hormônio folículo-estimulante de camundongo (FSH) é o mesmo do estradiol (E2). As concentrações dos produtos padrão (S0-55) são: 0, 5, 10, 20, 40 e 8{{30} }mUI/mL. O método de determinação do kit ELISA de hormônio luteinizante (LH) de camundongo (Rato) é o mesmo do estradiol (E2). As concentrações do padrão (S0-55) são: 0, 0,5, 1, 2, 4 e 8mIU/mL. O método de determinação do kit ELISA de 5-hidroxitriptamina (5-HT) de camundongo é o mesmo do estradiol (E2). As concentrações dos produtos padrão (S0-55) são: 0, 15, 30, 60, 120, 240ng/ml. O método de determinação do kit de detecção de dopamina (DA) ELISA de camundongo (Rato) é o mesmo do estradiol (E2). As concentrações dos produtos padrão (S0-55) são: 0, 7,5, 15, 30, 60 e 120pg/ml.

Pode-se observar na Tabela 21 e na Figura 25 que, em comparação com o grupo branco, o tempo de imobilidade dos camundongos no grupo modelo aumentou significativamente nos experimentos de natação forçada e suspensão da cauda (P<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).

2 Efeitos nas atividades autônomas em camundongos modelo de depressão na perimenopausa

Os resultados do teste de atividade autônoma dos camundongos de cada grupo experimental são apresentados na Tabela 22 e Figura 26.

Pode-se observar na Tabela 23 e nas Figuras 27 e 28 que, em comparação com o grupo branco, o período de latência dos camundongos no grupo modelo foi significativamente reduzido e o número de choques elétricos aumentou significativamente (P<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).

4 Efeitos no índice de órgãos em camundongos modelo de depressão na perimenopausa

Pode-se observar na Tabela 24 e na Figura 29 que, em comparação com o grupo branco, o índice do timo, o índice do baço e o índice uterino do grupo modelo foram significativamente reduzidos (P<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Cistanche feniletanol glicosídeogrupo O índice do timo e o índice uterino de camundongos podem ser significativamente aumentados (P<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).