Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol resgata déficits de AD modulando a ativação da microglia, mas não o estresse oxidativo

Abstrato: Ergosta-7,9(11),22-trien{4}}ol (EK100) foi isolado do fungo medicinal Antrodia camphorato, específico de Taiwan, conhecido por sua promoção da saúde e anti- efeitos do envelhecimento na medicina popular. A doença de Alzheimer (DA) é uma importante doença associada ao envelhecimento. Investigamos a eficácia e o mecanismo potencial de ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol para sintomas de DA. Drosophila com a superexpressão pan-neuronal de amilóide-(A) humano foi usado como modelo AD. Comparamos o tempo de vida, função motora, aprendizado, memória, estresse oxidativo e biomarcadores de ativação da microglia e inflamação do ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol- grupo tratado aos do controle não tratado. Ergosta-7,9(11), o tratamento com 22-trien-3 -ol melhorou efetivamente o tempo de vida, a função motora, o aprendizado e a memória do modelo AD em comparação com o controle não tratado. Os biomarcadores de ativação e inflamação da microglia foram reduzidos, enquanto a onipresente peroxidação lipídica, a atividade da catalase e a atividade da superóxido dismutase permaneceram inalteradas. Em conclusão, o ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol resgata os déficits de AD modulando a ativação da microglia, mas não o estresse oxidativo.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

Clique nos benefícios dos comprimidos Cistanche

【Para mais informações:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Palavras-chave: Doença de Alzheimer; Drosophila; EK100; ergosta-7,9(11),22-tentei-3 -ol

1. Introdução

Antrodia camphorata é um fungo medicinal exclusivo de Taiwan e foi uma cultura econômica importante para o comércio exterior de Taiwan no século XIX [1]. O primeiro livro de história de Taiwan, Tâi-uân Thong-sú (literalmente a História Geral de Taiwan), registrou os usos médicos indígenas do antrodia canforato, incluindo a eliminação de patógenos, "melhorar a saúde", "revigorar o sangue", "desintoxicação do álcool", " protegendo o fígado" e "anti-envelhecimento" [2-4]. Uma vez que enfrentamos um desafio de saúde da população global devido ao envelhecimento [5], o estudo científico da medicina indígena para aproveitar o conhecimento antienvelhecimento é crucial.

Entre as principais doenças associadas ao envelhecimento, como degeneração macular, aterosclerose, câncer e acidente vascular cerebral, a doença de Alzheimer (DA) é um osso duro de roer devido ao seu mecanismo patológico indescritível. O tratamento eficaz modificador da doença para a DA ainda não está disponível [6]. As hipóteses patológicas atuais da DA incluem, mas não estão restritas a, reduções na colina acetiltransferase, excitotoxicidade do glutamato, agregação de beta-amilóide (A), fosforilação da tau, resistência à insulina cerebral [7] e alterações do microbioma intestinal [8]. No entanto, não importa o tipo de causa envolvida na DA, o estresse oxidativo e a ativação inflamatória da microglia são os sinais comuns que acompanham a neurodegeneração da DA [9,10]. Curiosamente, a neuroinflamação e o estresse oxidativo são eventos inter-relacionados que são observados na DA e hipotetizados na patologia da DA. Por um lado, a deposição de placas senis de A desencadeia reações inflamatórias, ativação da microglia, liberação de citocinas e astrocitose, levando a consequências indesejáveis ​​como lesão neuronal progressiva e, por fim, disfunções cognitivas. A ativação de respostas imunes pode inicialmente combater patógenos invasores com A ou eliminar depósitos excessivos de A; no entanto, o processo inevitavelmente produz espécies reativas de oxigênio (ROS), que podem causar danos neuronais no microambiente. Por outro lado, A poderia causar ROS de maneira independente da inflamação. Por exemplo, A foi encontrado nas membranas mitocondriais da DA pós-morte e pode entrar na mitocôndria, causando a interrupção da cadeia de transporte de elétrons (ETC) e resultando na geração de ROS. ROS elevados podem, por sua vez, desencadear a liberação de citocinas e iniciar a inflamação [7,9,10]. Portanto, moléculas antioxidantes e anti-inflamatórias podem ser terapêuticas potenciais para a DA.

Antrodia canforato, especialmente um de seus compostos submersos isolados em caldo inteiro ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (também conhecido como EK100), exibiu profundo poder antioxidante e anti -atividades inflamatórias [11-13]. Além disso, Chang et al. [14] mostraram que o antroquinonol, outro composto isolado do micélio fermentado de Antrodia canforato, melhora o aprendizado e a memória em um modelo de camundongo com DA com astrogliose e estresse oxidativo reduzidos. No entanto, as relações causais entre a astrogliose reduzida e o estresse oxidativo após o tratamento com antroquinonol não puderam ser confirmadas, e a redução do estresse oxidativo foi postulada como o fator mediador [14]. A segurança do EK100 foi testada anteriormente seguindo a Diretriz 407 da Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) em um modelo de camundongos de 10 e 20 mg/kg-dia [15]. Portanto, adotamos concentrações aproximadamente equivalentes de alimentação livre para moscas-das-frutas neste estudo.

O modelo da mosca da fruta (Drosophila melanogaster) de superexpressão de A 42 é um modelo animal de DA bem estabelecido [16], com sintomas característicos de DA, incluindo redução do tempo de vida, aprendizado e déficits motores [17], estresse oxidativo [18] e ativação microglial [19]. Os desafios da modelagem de AD em Drosophila melanogaster incluem nenhuma atividade BACE em Drosophila e diferenças de gênero, que mostram sintomas mais graves em arquivos masculinos. Estes não são observados na DA humana [20]. Portanto, adotamos o peptídeo A 42 humano que expressa moscas para modelar a DA, onde a produção de A 42 não requer atividade de BACE. Neste estudo, testamos se o EK100 melhora os sintomas da DA e, mais importante, se ambas as modulações do estresse oxidativo e da astrogliose são essenciais para melhorar a DA.

2. Resultados

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Sobrevivência resgatada e escalada de AD Drosophila

O diagnóstico de DA está associado a uma redução no tempo médio de vida [21], e quase metade dos pacientes com DA sofre de distúrbios de atividade [22]. Portanto, testamos se o extrato de Antrodia camphorata ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) melhora a capacidade de sobrevivência e escalada de um Modelo AD Drosophila. Descobrimos que o tratamento com 125 ou 250 µg/mL de ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol melhorou significativamente a sobrevida de AD Drosophila (p < 0,01) (Figura 1A e Tabela Suplementar S1), mas apenas uma dose alta (250 µg/mL) melhorou a escalada de AD Drosophila (Figura 1B). Como os déficits de sobrevivência e mobilidade são sintomas clínicos da DA, a concentração de 250 µg/mL, que melhorou ambos os sintomas, foi utilizada nas investigações seguintes.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Aprendizagem resgatada e memória de uma hora de AD Drosophila

Em seguida, testamos se o tratamento com ergosta{{0}},9(11),22-trien-3 -ol melhora os defeitos de aprendizado e memória, um sintoma característico da DA. Moscas AD foram tratadas com ergosta- 7,9(11),22-trien{9}}ol a 250 ug/mL por 14 dias e submetidas a testes de aprendizado e memória com Labirinto em T. Conforme mostrado na Figura 2A, em comparação com o controle de tipo selvagem (AD(-)/EK(-)), a capacidade de aprendizado do controle AD (AD(mais)/EK(-)) diminuiu significativamente (p <0,01), enquanto o tratamento com ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol melhorou significativamente a capacidade de aprendizagem da DA (p < 0,05). Além disso, o ergosta-7,9(11), o tratamento com 22-trien-3 -ol também melhorou a memória de uma hora diminuída da DA (Figura 2B).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-testou-3 -ol Ativação microglial modulada em AD Drosophila

Em seguida, testamos se o tratamento com ergosta-7,9(11),22-trien{4}}ol diminui a ativação microglial na DA. Na DA, a microglia ativada é acompanhada por fagocitose e neurodegeneração [23]. Em Drosophila, o marcador de engolfamento de células microgliais e, portanto, o marcador de ativação microglial, é a expressão de draper (Drpr) e o CED a jusante [24]. Após o tratamento com ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol, as moscas DA foram eliminadas e o RNA foi extraído da cabeça das moscas para RT-qPCR. Conforme mostrado na Figura 3A, ambos os Drpr foram significativamente diminuídos na AD Drosophila tratada com ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol em comparação com a AD não tratada. Isso implica que ergosta-7,9(11),22-trien{25}}ol diminuiu a ativação microglial em AD Drosophila. Além disso, o tratamento com ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -ol também reduziu a inflamação do SNC, conforme revelado na regulação negativa de genes relacionados à inflamação (Figura 3B) .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-experimentado-3 -ol não modulou o estresse oxidativo onipresente na AD Drosophila

Em seguida, testamos se a modulação do estresse oxidativo onipresente, ou seja, de corpo inteiro, é necessária para o ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol resgatar a DA. O tratamento com ergosta-7,9(11),22-tested- 3 -ol não alterou a peroxidação lipídica (Figura 4A), atividade da catalase (Figura 4B), atividade da superóxido dismutase (Figura 4C) , ou a expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo (Figura

3. Discussão

Este estudo relata a eficácia e o possível mecanismo subjacente do ergosta-7,9(11),22- try-3 -ol, um extrato do Antrodia camphorate, para a modificação dos sintomas da DA usando a Drosophila modelo com superexpressão de humano-A. O ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol melhorou efetivamente o aprendizado e a memória e estendeu o tempo de vida de pacientes com DA. Além disso, os biomarcadores de ativação e inflamação da microglia foram reduzidos, enquanto o estresse oxidativo onipresente permaneceu inalterado.

Existem muitas fontes de estresse oxidativo na DA, incluindo, mas não se limitando à ativação da imunidade inata - por exemplo, acúmulo de A, ruptura das mitocôndrias por A, tau hiperfosforilada e mau metabolismo de metais também são fontes [25]. Embora a inflamação e o estresse oxidativo possam induzir um ao outro reciprocamente, podemos assumir que suas mudanças síncronas ocorrem apenas em circunstâncias nas quais outras fontes de estresse oxidativo permanecem constantes. No entanto, este não é o caso neste estudo. A diminuição da imunidade inata, especialmente a ativação da microglia, ao mesmo tempo, atenua sua contribuição para a depuração de A , o que pode resultar em acúmulo de A. Curiosamente, o próprio acúmulo de A desencadeia a produção de estresse oxidativo de várias maneiras. Assim, a diminuição da ativação microglial e das respostas inflamatórias de EK1000 pode, em parte, proteger os neurônios de ataques imunes fora do alvo, mas pagará o preço da atenuação da depuração de A. Assim, o resultado deste estudo pode refletir a limitação da estratégia de segmentação microglia, pelo menos no modelo AD Drosophila.

O sistema imunológico inato mediado pela microglia é descrito como uma faca de dois gumes em doenças neurodegenerativas, especialmente DA [26,27]. A microglia ativada tenta remover patógenos tóxicos como A, mas inevitavelmente causa danos neuronais no microambiente. A superioridade de 250 µg/mL de EK100 em 35 dias pode implicar que a estratégia de redução da ativação da microglia é limitada ao estágio patológico, pelo menos no caso do modelo AD da mosca-das-frutas. Além disso, a redução significativa de biomarcadores para ativação microglial e resposta inflamatória não conseguiu se traduzir em uma melhora igualmente significativa na sobrevida, e a função do SNC pode ser parcialmente explicada pela característica de espada de dois gumes da microglia. Isso implica que a ativação da microglia não é o único nem o fator dominante do progresso da DA. A ativação microglial reduzida também implica que a degradação do A superexpresso foi parcialmente desligada no modelo da mosca da fruta, o que também pode explicar a maior mortalidade para a maior concentração de EK100 entre as idades de 35 e 52 dias.

O antroquinonol, outro extrato do antrodia canforato, foi relatado por sua eficácia no tratamento de camundongos com DA, para o qual a redução do estresse oxidativo foi postulada como o fator mediador [14]. Portanto, isso pode significar que o antroquinonol e o ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol melhoram os sintomas da DA por vias independentes, mediando ou não o estresse oxidativo, respectivamente. Portanto, seria interessante testar se o cotratamento com antroquinonol e ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol teria um efeito sinérgico na melhora da DA.

Para o estágio inicial da DA, o foco principal do design de medicamentos é eliminar a deposição de A (como no anticorpo monoclonal recentemente aprovado aducanumabe [28], apesar de sua controvérsia de benefícios clínicos mínimos e ineficácia em um dos dois ensaios clínicos de fase III [29]), ou tenta aumentar a absorção microglial de A [30-32]. No entanto, para estágios moderados ou avançados de DA, a superativação da microglia, inversamente, agrava a neurodegeneração [33] e, portanto, estratégias terapêuticas alternativas são necessárias.

4. Materiais e Métodos

4.1. Manutenção de estoque de moscas e medição de vida útil

A cepa A transgênica de Drosophila H29.3/CyO foi obtida de [16] e foi cruzada com w(CS10) por seis gerações. A linha pan-neural driver elav-GAL4c155 foi cruzada com w(CS10) por seis gerações. A linhagem white eye w1118 (Bloomington Drosophila Stock Center #3605) cruzada com a linha Canton S (Bloomington Drosophila Stock Center # 64349) 10 vezes (w (CS10)) foi usada como estoque padrão. A linha pan-neural driver elav-GAL4c155 foi obtida do Bloomington Drosophila Stock Center (#458). O genótipo das moscas experimentais - ou seja, o modelo AD - foi [elav; H29.3/ plus ], que foi selecionado da prole F1 sem o marcador CyO. As moscas foram mantidas em meio padrão de farinha de milho a 25 ◦C sob um ciclo claro-escuro de 12 horas. Para T-maze, o emergente [elav; Moscas H29.3/ plus ] foram coletadas (ambos os sexos misturados e não virgens) e cultivadas com ou sem tratamento com EK100 até d14 após a emergência. Para sobrevivência, escalada e RT-qPCR, apenas as moscas machos foram usadas. Amostras de RNA foram coletadas no d30 após a emergência, quando tanto o tempo de vida quanto as curvas de escalada mostraram separação significativa em comparação com o modelo AD não tratado.

Em uma análise de tempo de vida, vinte a trinta moscas foram criadas em um frasco de comida com ou sem CS; pelo menos quatro frascos foram preparados para cada tratamento. Os frascos de comida foram substituídos a cada 2 a 3 dias, e as moscas mortas foram contadas nesse momento. Pelo menos três réplicas foram realizadas por ensaio. A porcentagem de sobrevivência é definida como o número de moscas vivas dividido pelo número total de moscas no início do teste.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

O ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol foi extraído do gentil presente de Antrodia camphorata, conforme descrito anteriormente [34]. O ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol forma um pó de cor amarelo claro à temperatura ambiente. A solução estoque foi preparada na concentração de 6,25 mg/mL em EtOH imediatamente antes do uso. Para os ensaios de tempo de vida e anti-geotaxia, as concentrações finais foram 125 e 250 µg/mL. Para os ensaios de memória de aprendizado e expressão gênica, a concentração final foi de 250 µg/mL. O peso molecular de EK100 é 396,65. Portanto, as concentrações molares correspondentes são 315 ou 630 µM, respectivamente. As moscas foram tratadas com duas doses de EK100 com as concentrações finais de 125 e 250 µg/mL misturadas na ração por alimentação Ad libitum. A comida de controle continha a mesma quantidade de solvente EtOH que os grupos experimentais com a concentração final de EtOH de 3 por cento v/v. O tratamento começou desde a emergência até o momento da coleta de dados de cada ensaio. Para o ensaio de sobrevivência e escalada, o tratamento foi administrado durante toda a vida. O número de moscas para cada replicação foi descrito na seção de método de cada ensaio. Também testamos ensaios de vida útil com moscas do tipo selvagem tratadas/não tratadas para garantir a segurança do ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol em modelos de mosca (Figura complementar S1 ).

4.3. Ensaios de Antigeotaxia

O presente protocolo é baseado em um método publicado anteriormente [35], com algumas modificações. Resumidamente, um frasco de plástico cilíndrico transparente com diâmetro de 2,5 cm e altura de 9,5 cm (mais comprido ficará bom, mas será mais difícil de manusear) como aparelho de geotaxia. O fundo do frasco foi revestido com uma única camada de ração para moscas como uma almofada. Uma marca de 5 cm acima da almofada foi fixada na superfície externa do frasco. A outra extremidade do frasco foi aberta e as moscas foram carregadas a partir daí. Como o ensaio foi conduzido concomitantemente ao ensaio de sobrevivência, o número de moscas carregadas era idêntica às sobreviventes naquele momento. As moscas foram carregadas no frasco; a parte superior foi selada com uma tampa e o fundo do frasco foi repetidamente (durante dois segundos) batido contra a superfície dura sobre a qual estava apoiado (neste caso, bancada de laboratório). A batida foi forte o suficiente para assustar as moscas e fazê-las escalar as paredes do frasco, mas não tão forte a ponto de machucá-las fisicamente. Todo o processo foi gravado em vídeo por 18 segundos, com o número de moscas subindo acima da marca de 5 cm anotado e expresso como uma porcentagem para cada grupo. Foi contado o número de moscas que ultrapassaram a marca de 5 cm. Quatro repetições foram realizadas para cada grupo. A porcentagem de capacidade de escalada é definida como o número de moscas subindo dividido pelo número total de moscas no início do teste. A capacidade de escalar também foi testada em moscas do tipo selvagem tratadas/não tratadas para garantir a segurança de ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol em modelos de mosca (Figura complementar S2) .

4.4. Drosophila Learning and Memory Platform (T-Maze)

Para observar o aprendizado e a memória da Drosophila, cerca de 100 moscas foram primeiro colocadas na câmara superior do coletor, que pode ser fornecida com voltagem elétrica e aplicar um choque elétrico nas moscas. As moscas foram entregues pela primeira vez em odor 1 (MCH) juntamente com ondas de choque elétrico. Em seguida, as moscas receberam odor 2 (OCT) sem ondas de choque elétrico. Após o treinamento, as moscas foram movidas para o espaço abaixo, no qual dois lados abertos receberam odor 1 ou odor 2, respectivamente. Observando a direção do movimento das moscas, o viés do odor 2 sobre o odor 1 pode ser estimado com o Índice de Desempenho (PI), definido como a diferença no número de moscas entre dois odores dividida pelo número total de moscas. O Performance Index representa a capacidade de aprendizado e memória da Drosophila [36]. Outro grupo de moscas foi condicionado com pares de odores invertidos, de modo que cada odor serviu uma vez como um choque elétrico mais e uma vez como um choque elétrico −. Os PIs desses dois testes foram calculados como o PI final de uma réplica. "1 h-memória" foi testada após 1 h de espaçamento para o treinamento, enquanto "aprendizagem" foi, ao contrário, testada após 1,5 min de espaçamento para o treinamento. Também testamos a prevenção de MCH e OCT das moscas AD com ou sem tratamento EK100 para garantir que o tratamento cause viés contra os odores aversivos (Figura complementar S3).

4.5. PCR quantitativo

Cabeças e corpos foram separados antes da extração do RNA. Para uma réplica, as moscas foram anestesiadas com CO2; coletados, 100 de cada vez, em tubos Eppendorf; e então imersos em nitrogênio líquido por 1 min para tornar os corpos quebradiços. Os cadáveres congelados resultantes foram então carregados em pilhas de peneiradores (Bunsekifurui, nº 40 e nº 25) e agitados. Os corpos se separaram e foram classificados de acordo com o tamanho das malhas da peneira em duas frações separadas: "cabeças" e "corpos". O RNA total foi extraído com o kit RNeasy Mini (Qiagen, Düsseldorf, Alemanha) e, em seguida, usado para sintetizar o cDNA com o VersoTM cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Os níveis de expressão de RNA dos genes investigados foram quantificados por PCR em tempo real (Applied Biosystems 7700, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) com o Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Os resultados foram normalizados para a quantidade relativa de Gapdh ou Rpl32. Os primers utilizados estão listados abaixo. Gapdh: 50 -GAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 e 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGGAGGAC-30 e 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 e 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30 ; Gato: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 e 50 -TTGATTCCAATGGGTGCTC-30 ; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGTGT-30 e 50 -CGGTCTGCTTGGCCTTTA-30 ; Cnc: 50 -GCCAACTATGGTGG TGGAGT-30 e 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAATCGTCAC CT-30 e 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30 ; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 e 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30 ; SOD3: 50 -TCAGCATGGGTGCTCACTAT-30 e 50 -TAATGCCCGTGGAGTTGG-30 ; mkk3: 50 -CCCGTACCCATACGACAAT-30 e 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30 ; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 e 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 e 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30 ; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 e 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30 ; relish: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 e 50 -TCTCCCTTCTCCG GATACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAGCTGT-30 e 50 -CGACGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Ensaios de Estresse Oxidativo

Três réplicas da peroxidação lipídica, atividade da catalase e atividade da superóxido dismutase foram medidas por BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, EUA), o Catalase Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI , EUA) e o Superoxide Dismutase Assay Kit (Cayman), respectivamente, seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, a atividade da SOD foi avaliada medindo a dismutação dos radicais superóxido gerados pela xantina oxidase fornecida pelo kit e foi detectada pela transformação do sal de tetrazólio em corante formazano, então quantificado por absorbância em 440–460 nm. A atividade da CAT foi avaliada medindo a formação de formaldeído a partir do metanol na presença de H2O2 catalisada pela CAT, detectada pelo 4-amino-3- hidrazino-5-mercapto-1 cromogênico fornecido pelo kit ,2,4-triazol, então quantificado pela absorbância em 540 nm. A atividade de peroxidação lipídica foi avaliada medindo a decomposição de peróxidos de ácidos graxos poliinsaturados em malonaldeído (MDA) e 4-hidroxialquenais, detectados pelo N-metil-2-fenilindol cromogênico fornecido pelo kit, depois quantificado por absorbância a 586 nm. Para os ensaios SOD, Cat e LPO, o número de moscas inteiras homogeneizadas de cada réplica foi de 50, 50 e 100, respectivamente.

4.7. Análise estatística

A significância da diferença entre as curvas de sobrevivência e as curvas de escalada dos grupos tratados com ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol e controle foram julgadas por log-rank (Mantel– Cox) e testes de Gehan-Breslow-Wilcoxon. A significância da diferença entre o índice de desempenho da memória de aprendizagem dos grupos tratados com ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol e controle foi julgada pelo teste t de Student.

5. Conclusões

Verificamos que ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) de Antrodia canforato melhora a sobrevivência, aprendizado e memória em um modelo de DA de Drosophila, com biomarcadores reduzidos ativação da microglia e inflamação. Além disso, a modificação dos sintomas não ocorreu por meio da redução onipresente do estresse oxidativo, o que significa que o ergosta-7,9(11) e o 22-trien-3 -ol melhoram os sintomas da DA por caminhos diferentes para outro Extrato de antrodia canforato, antroquinonol. O EK100 diminuiu efetivamente a ativação e a inflamação da microglia, o que pode ajudar a reverter os déficits cognitivos típicos associados à DA, como déficits de aprendizado e memória.

Materiais Suplementares:Os seguintes estão disponíveis online. Figura S1: Sobrevivência de moscas selvagens tratadas com EK100; Figura S2: Escalada de moscas selvagens tratadas com EK100; Figura S3: Prevenção de odor aversivo de moscas AD tratadas com EK100; Tabela S1: Estatísticas das curvas de sobrevivência.

Contribuições do autor:H.-PL, Y.-HK e W.-YL planejaram os experimentos. Y.-HK contribuiu para a preparação do EK100. JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS e T.-NC realizaram os experimentos. Todos os autores participaram da preparação do manuscrito. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por doações do Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (MOST 108-2320-B-039-031-MY3, MOST 109-2314-B-039-030, MOST 110-2314- B-039-009), China Medical University & Hospital (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, CMU109- AWARD-02 e DMR-109-150) e do Programa do Centro de Pesquisa de Áreas Destacadas no âmbito do Projeto Sprout de Ensino Superior do Ministério da Educação (MOE) em Taiwan (CMRC-CHM-2-1).

Declaração do Conselho de Revisão Institucional:Não aplicável.

Declaração de Consentimento Informado:Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados:Os dados usados ​​para apoiar os resultados deste estudo estão incluídos no artigo.

Conflitos de interesse:Y.-HK é um dos inventores, mas não o cessionário da patente US-9757393-B2 intitulada "Derivatives of ergostatrien-3- -ol from aniridia canforate and antiglycemic, antihyperlipidemic and using hepatic fat use its". Outros autores declaram não ter interesses conflitantes. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo; na coleta, análise ou interpretação de dados; na redação do manuscrito, ou na decisão de publicar os resultados.

Disponibilidade de amostra:Amostras dos compostos estão disponíveis com os autores.

Referências

1. Davidson, JW A Ilha de Formosa, Passado e Presente: História, Pessoas, Recursos e Perspectivas Comerciais. Chá, Cânfora, Açúcar, Ouro, Carvão, Enxofre, Plantas Econômicas e Outras Produções; Macmillan & Company: Nova York, NY, EUA, 1903.

2. Tsai, Z.; Liaw, S. O uso e o efeito do Ganoderma; Sheng-Yun Publishers, Inc.: Taichung, Taiwan, 1985; pp. 116–117.

3. Chen, C.-J. Estudo do cultivo sólido e bioatividade de Antrodia camphorata. Fung. ciência 2001, 16, 65–72.

4. Geethangili, M.; Tzeng, Y.-M. Revisão dos efeitos farmacológicos do antrodia canforato e seus compostos bioativos. Complemento baseado em evidências. Altern. Med. 2011, 2011, 212641. [CrossRef] [PubMed]

5. Ogura, S.; Jakovljevic, MM Envelhecimento da população global – cuidados com a saúde, consequências sociais e econômicas. Frente. Public Health 2018, 6, 335. [CrossRef] [PubMed]

6. Cummings, J.; Lee, G.; Ritter, A.; Zhong, K. pipeline de desenvolvimento de medicamentos para a doença de Alzheimer: 2018. Alzheimer's Dement. Trad. Res. Clin. Interv. 2018, 4, 195–214. [CrossRef] [PubMed]

7. Sharma, P.; Srivastava, P.; Seth, A.; Tripathi, PN; Banerjee, AG; Shrivastava, SK Revisão abrangente dos mecanismos da patogênese envolvidos na doença de Alzheimer e potenciais estratégias terapêuticas. Prog. Neurobiol. 2019, 174, 53–89. [CrossRef] [PubMed]

8. Sochocka, M.; Donskow-Łysoniewska, K.; Diniz, BS; Kurpas, D.; Brzozowska, E.; Leszek, J. As alterações do microbioma intestinal e a patogênese da doença de Alzheimer causada pela inflamação - uma revisão crítica. Mol. Neurobiol. 2019, 56, 1841–1851. [CruzRef]

9. Agostinho, P.; A Cunha, R.; Oliveira, C. Neuroinflamação, estresse oxidativo e patogênese da doença de Alzheimer. atual farm. Des. 2010, 16, 2766–2778. [CruzRef]

10. Galasko, D.; Montine, TJ Biomarcadores de dano oxidativo e inflamação na doença de Alzheimer. Biomark. Med. 2010, 4, 27–36. [CruzRef]

11. Kuo, Y.-H.; Lin, T.-Y.; Você, Y.-J.; Wen, K.-C.; Sung, P.-J.; Chiang, H.-M. Efeitos antiinflamatórios e antifotodano do ergostatrien-3 -ol, isolado de Antrodia camphorata, na pele de camundongos sem pelos. Molecules 2016, 21, 1213. [CrossRef]

12. Chao, T.-Y.; Hsieh, C.-C.; Hsu, S.-M.; Wan, C.-H.; Lian, G.-T.; Tseng, Y.-H.; Kuo, Y.-H.; Hsieh, S.-C. Ergostatrien-3 -ol (EK100) de Antrodia camphorata atenua o estresse oxidativo, inflamação e lesões hepáticas in vitro e in vivo. Anterior nutr. Ciência Alimentar. 2021, 26, 58. [CrossRef]

13. Tsai, T.-C.; Tung, Y.-T.; Kuo, Y.-H.; Lião, J.-W.; Tsai, H.-C.; Chong, K.-Y.; Chen, H.-L.; Chen, C.-M. Efeitos anti-inflamatórios de Antrodia camphorata e seu composto ativo, Ergostatrien-3 -ol, em um modelo de isquemia de pele de camundongo. FASEB J. 2015, 29, LB444.

14. Chang, W.-H.; Chen, MC; Cheng, IH Antroquinonol reduz os níveis de amiloide no cérebro e melhora o aprendizado espacial e a memória em um modelo de camundongo transgênico da doença de Alzheimer. ciência Rep. 2015, 5, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, Y.-M.; Sung, H.-C.; Kuo, Y.-H.; Hsu, Y.-J.; Huang, C.-C.; Liang, H.-L. Os efeitos de Ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol de Antrodia canforato no perfil bioquímico e no desempenho de exercícios de camundongos. Molecules 2019, 24, 1225. [CrossRef]

16. Finelli, A.; Kelkar, A.; Canção, H.-J.; Yang, H.; Konsolaki, M. Um modelo para estudar a toxicidade induzida por Alzheimer A 42- em Drosophila melanogaster. Mol. Célula. Neurosci. 2004, 26, 365–375. [CrossRef] [PubMed]

17. Ping, Y.; Hahm, E.-T.; Waro, G.; Canção, Q.; Vo-Ba, D.-A.; Licursi, A.; Bao, H.; Ganoé, L.; Finch, K.; Tsunoda, S. Vinculando uma 42-hiperexcitabilidade induzida a neurodegeneração, aprendizado e déficits motores e uma vida útil mais curta em um modelo de Alzheimer. PLoS Genet. 2015, 11, e1005025. [CrossRef] [PubMed]

18. Rival, T.; Página, RM; Chandraratna, DS; Sendall, TJ; Ryder, E.; Liu, B.; Lewis, H.; Rosahl, T.; Hider, R.; Camargo, L. Fenton A química e o estresse oxidativo medeiam a toxicidade do peptídeo -amilóide em um modelo de Drosophila da doença de Alzheimer. EUR. J. Neurosci. 2009, 29, 1335–1347. [CruzRef]

19. Ray, A.; Speese, SD; Logan, MA Glial draper resgata uma toxicidade em um modelo de Drosophila da doença de Alzheimer. J. Neurosci. 2017, 37, 11881–11893. [CruzRef]

20. Jeibmann, A.; Paulus, W. Drosophila melanogaster como um organismo modelo de doenças cerebrais. Int. J. Mol. ciência 2009, 10, 407–440. [CrossRef] [PubMed]

21. Brookmeyer, R.; Corrada, MM; Curriero, FC; Kawas, C. Sobrevivência após o diagnóstico da doença de Alzheimer. Arco. Neurol. 2002, 59, 1764-1767. [CruzRef]

22. Lam, LC; Tang, W.; Leung, V.; Chiu, HF Perfil comportamental da doença de Alzheimer em idosos chineses – um estudo de validação da versão chinesa da escala de avaliação da patologia comportamental da doença de Alzheimer. Int. J. Geriatr. psic. 2001, 16, 368–373. [CrossRef] [PubMed]

23. Schwab, C.; McGeer, PL Aspectos inflamatórios da doença de Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas. J. Doença de Alzheimer. 2008, 13, 359–369. [CrossRef] [PubMed]

24. MacDonald, JM; Praia, MG; Porpiglia, E.; Sheehan, AE; Watts, RJ; Freeman, MR O receptor Draper de engolfamento de cadáveres de células de Drosophila medeia a depuração glial de axônios cortados. Neuron 2006, 50, 869–881. [CruzRef]

25. Chen, Z.; Zhong, C. Estresse oxidativo na doença de Alzheimer. Neurosci. Touro. 2014, 30, 271–281. [CruzRef]

26. Stankovic, ND; Teodorczyk, M.; Ploen, R.; Zipp, F.; Schmidt, MH Microglia–interações dos vasos sanguíneos: uma faca de dois gumes em patologias cerebrais. Acta Neuropathol. 2016, 131, 347–363. [CruzRef]

27. Konishi, H.; Kiyama, sinalização H. Microglial TREM2/DAP12: uma faca de dois gumes em doenças neurais. Frente. Célula. Neurosci. 2018, 12, 206. [CrossRef] [PubMed]

28. Sevigny, J.; Chião, P.; Bussière, T.; Weinreb, PH; Williams, L.; Maier, M.; Dunstan, R.; Salloway, S.; Chen, T.; Ling, Y. O anticorpo aducanumab reduz as placas A na doença de Alzheimer. Nature 2016, 537, 50–56. [CruzRef]

29. Lalli, G.; Schott, JM; Hardy, J.; De Strooper, B. Aducanumab: Uma nova fase no desenvolvimento terapêutico para a doença de Alzheimer? EMBO Mol. Med. 2021, 13, e14781.

30. Takata, K.; Kitamura, Y.; Saeki, M.; Terada, M.; Kagitani, S.; Kitamura, R.; Fujikawa, Y.; Maelicke, A.; Tomimoto, H.; Taniguchi, T. Galantamine-induzida depuração amiloide mediada por estimulação de receptores nicotínicos microgliais de acetilcolina. J. Biol. Chem. 2010, 285, 40180–40191. [CrossRef] [PubMed]

31. Mandrekar-Colucci, S.; Carlos, JC; Landreth, GE Mecanismos subjacentes à depuração amiloide mediada por receptores ativados por proliferadores de peroxissoma rápida- -e reversão de déficits cognitivos em um modelo murino da doença de Alzheimer. J. Neurosci. 2012, 32, 10117–10128. [CruzRef]

32. McGeer, PL; McGeer, EG Segmentação microglia para o tratamento da doença de Alzheimer. Opinião do Especialista. Lá. Metas 2015, 19, 497–506. [CrossRef] [PubMed]

33. Canção, WM; Colonna, M. A identidade e função da microglia na neurodegeneração. Nat. imunol. 2018, 19, 1048–1058. [CrossRef] [PubMed]

34. Kuo, Y.-H.; Lin, C.-H.; Shih, C.-C. Ergostatrien-3 -ol de Antrodia camphorata inibe diabetes e hiperlipidemia em camundongos tratados com dieta rica em gordura por meio da regulação de genes relacionados ao fígado, transportador de glicose 4 e fosforilação de proteína quinase ativada por AMP. J. Agric. Química Alimentar. 2015, 63, 2479–2489. [CrossRef] [PubMed]

35. Le Bourg, E.; Lints, FA Hipergravidade e envelhecimento em Drosophila melanogaster. 4. Atividade de escalada. Gerontologia 1992, 38, 59–64. [CruzRef]

36. Waddell, S.; Quinn, WG Moscas, genes e aprendizagem. Ana. Rev. Neurosci. 2001, 24, 1283–1309. [CrossRef] [PubMed]

【Para mais informações:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】