A epigalocatequina-3-galato melhorou o acúmulo de ferro e a apoptose e promoveu a regeneração neuronal e a memória/funções cognitivas no hipocampo induzidas pela exposição a um ambiente crônico de hipóxia em grandes altitudes

Abstrato

Nosso objetivo foi explorar os efeitos protetores e o potencial mecanismo de tratamento do galato -3-de epigalocatequina (EGCG) em um modelo animal de exposição crônica em um ambiente natural de hipóxia em grandes altitudes (HAH). As alterações comportamentais foram avaliadas pelo teste do labirinto aquático de Morris. O acúmulo de ferro no hipocampo foi detectado usando coloração Perl aprimorada por DAB, ressonância magnética, qPCR e colorimetria, respectivamente. Estresse oxidativo (malondialdeído, MDA), apoptose (Caspase-3) e regeneração neural (fator neurotrófico derivado do cérebro, BDNF) foram detectados usando ELISA e western blotting. As alterações ultraestruturais neurais foram avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

A relação entre apoptose e memória sempre foi um dos temas quentes dos neurocientistas. A apoptose refere-se ao processo de morte celular ordenada através de uma série de mecanismos reguladores internos. Em circunstâncias normais, a apoptose celular não causa nenhum dano ao corpo humano, mas ajuda a manter uma boa saúde. No entanto, sob certas condições patológicas, a apoptose descontrolada pode levar à ocorrência de diversas doenças.

Ao mesmo tempo, também foi demonstrado que a memória está intimamente relacionada à apoptose celular. Alguns estudos sugerem que a apoptose adequada desempenha um papel importante na formação e consolidação da memória. Essa relação segue uma regra simples: alguns neurônios desnecessários ou expirados são eliminados por apoptose, criando mais espaço e recursos para a formação de novos neurônios e armazenamento de memória. Além disso, a apoptose apropriada também pode proteger os neurônios contra danos, eliminando proteínas tóxicas nos neurônios.

Porém, se houver apoptose excessiva ou insuficiente, isso afetará o funcionamento normal da memória. A apoptose excessiva pode levar à perda excessiva de neurônios, levando à perda de memória. Por outro lado, se não houver apoptose suficiente para eliminar neurônios e células desnecessárias, essas células consumirão espaço e recursos muito limitados, o que também pode levar ao declínio da memória. Portanto, é necessário evitar a apoptose excessiva ou insuficiente, mantendo o grau normal de apoptose.

A apoptose é um processo biológico complexo com muitos fatores de influência. Embora a relação com a memória não seja totalmente compreendida, este fenómeno permite-nos obter uma compreensão mais profunda do sistema nervoso e abre novos caminhos para melhorar a memória. Em resumo, dominar a apoptose apropriada é crucial para a saúde da memória. Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória. Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da carne picada vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácidos, polissacarídeos, flavonóides, etc. Esses ingredientes podem promover a saúde do cérebro de várias maneiras.

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Os resultados mostraram que o desempenho de aprendizagem e memória dos ratos diminuiu quando expostos ao ambiente HAH. Foi seguido por acúmulo de ferro, metabolismo disfuncional do ferro, redução do BDNF e regulação positiva de MDA e Caspase-3. TEM confirmou as mudanças ultraestruturais em neurônios e mitocôndrias. O EGCG reduziu o comprometimento cognitivo induzido pela HAH, a deposição de ferro, o estresse oxidativo e a apoptose e promoveu a regeneração neuronal contra a lesão neural crônica mediada pela HAH.

Palavras-chave
Alta altitude · Hipóxia · Mapeamento quantitativo de suscetibilidade · Acumulação de ferro · Intervenção medicamentosa.

Introdução
As atividades humanas em áreas de grande altitude (mais de 3.000 m) aumentaram significativamente recentemente [1]. Entre os 140 milhões de pessoas em todo o mundo que vivem permanentemente em grandes altitudes [2, 3] e outras para turismo ou defesa de fronteiras, 5–10% correm o risco de desenvolver a doença crónica das montanhas, caracterizada por eritrocitose excessiva e hipoxemia grave [4, 5] . O cérebro, como um dos órgãos que mais consome oxigênio, é sensível à hipóxia [6]. Além disso, a hipóxia de alta altitude (HAH) perturba gravemente a integridade estrutural dos principais neurônios e a morfologia mitocondrial no hipocampo [7]. Os sintomas induzidos pela exposição crônica a um ambiente HAH incluem dor de cabeça, tontura, distúrbios do sono, fadiga e falta de concentração mental [5, 8, 9]. Além disso, a HAH também pode desencadear disfunções neurocognitivas, como aprendizagem espacial, memória e humor [10]. O tratamento da lesão neural induzida pela HAH tornou-se assim um foco de atenção no campo da medicina de grandes altitudes [11, 12].

É de grande importância encontrar formulações adequadas para a prevenção de lesões cerebrais induzidas por HAH. As folhas de chá verde contêm (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG) (50–60%), (−)-epigalocatequina (EGC) (15–20%), (−)-epicacatequina-3- galato (ECG) (10–15%) e (-)-epicaquina (EC) (5–10%) [13, 14]. O EGCG, que é supostamente mais abundante nas folhas de chá verde (7,1 g por 100 g) do que no chá oolong (3,4 g por 100 g) e nas folhas de chá preto (1,1 g por 100 g) [15], tem uma potente propriedade antioxidante devido aos oito grupos hidroxila e dois grupos trifenólicos em sua estrutura básica [16, 17]. Além disso, foi demonstrado que é capaz de cruzar a barreira hematoencefálica e atingir o parênquima cerebral em estudos com animais [18, 19]. Houve alguns relatos sobre os mecanismos neuroprotetores do EGCG, como propriedades de quelação de metais, supressão do estresse oxidativo, inflamação, apoptose e aceleração da regeneração nervosa [20–22]. Zhang et al. revisaram o efeito do EGCG em muitas doenças e apontaram que o EGCG protegia as células neuronais induzindo a autofagia. Eles também resumiram que as propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes do EGCG eram vitais para o seu papel protetor nas doenças do sistema nervoso central [23].

No entanto, poucos estudos relataram o efeito neuroprotetor do EGCG contra a lesão neural crônica mediada pela HAH. Para preencher essa lacuna, neste estudo, estabelecemos um modelo de exposição crônica em ratos a um ambiente natural de HAH, na tentativa de verificar o potencial mecanismo de tratamento do EGCG. Além disso, utilizamos mapeamento quantitativo de suscetibilidade (QSM), por ressonância magnética gradiente-eco a 7 T, que pode superar o efeito não local do campo magnético e fornecer um mecanismo de contraste para tecidos in vivo, para quantificar o conteúdo de ferro cerebral [24].
Materiais e métodos

Animais

Um total de 120 ratos Sprague-Dawley machos pesando 130-150 g foram obtidos da Chengdu Dashuo Laboratory Animal Co., Ltd. Eles foram mantidos em um biotério a 18-22 graus em um ciclo claro / escuro de 12 horas com comida e água. fornecido ad libitum. Todos os procedimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital da China Ocidental.

Design de estudo

Os ratos foram randomizados e divididos em quatro grupos. Os ratos do grupo hipóxia e do grupo h-EGCG foram alimentados e alojados em Yushu, China, a uma altitude de 4500 m. Os ratos do grupo de altitude normal (grupo n) e do grupo n-EGCG foram alimentados em Chengdu, China, a uma altitude de 500 m. Esses ratos receberam alimentação normal durante um mês, seguida de diferentes tratamentos. (1) Grupo hipóxia: os ratos foram injetados intraperitonealmente todos os dias com solução salina fisiológica (0,9%) durante um mês. (2) grupo h-EGCG: ratos foram injetados intraperitonealmente todos os dias com 50 mg/kg de EGCG (pureza, 98%; Cas, 989-51-5; Sigma-Aldrich; armazenado a 4 graus) durante um mês. (3) grupo n: ratos foram injetados intraperitonealmente todos os dias com soro fisiológico (0,9%) durante um mês. (4) grupo n-EGCG: ratos foram injetados intraperitonealmente todos os dias com 50 mg/kg de EGCG durante um mês.

O EGCG (5 mg/mL) foi dissolvido em água na proporção de 1:1. O volume injetado nos ratos foi determinado pelo peso dos ratos, que atingiu uma quantidade final de injeção de 50 mg/kg. Após esse tratamento, alguns ratos foram utilizados para ensaio de labirinto aquático de Morris (n=10 para cada grupo) e análise de ressonância magnética cerebral (n=10 para cada grupo), respectivamente. Alguns outros ratos foram sacrificados e tecidos cerebrais foram coletados para coloração de Perls aprimorada por DAB (n=3 para cada grupo), para Western blotting, avaliações bioquímicas e ensaios qPCR (n=6 para cada grupo) e ensaio de microscópio eletrônico de transmissão (n=1 para cada grupo).

Experimento Comportamental

O labirinto aquático de Morris (MWM) foi realizado conforme descrito anteriormente para analisar o aprendizado e a memória dos ratos [25], foi realizado no mesmo local onde os ratos foram alojados. O MWM consistia em uma piscina redonda de aço (160 cm de diâmetro, 60 cm de altura e 31 cm de profundidade) preenchida com água até um nível de 1 cm acima do topo de uma plataforma (10 cm de diâmetro e 30 cm de profundidade). ). A temperatura da água foi mantida em 22±2 graus e opacificada com tinta preta brilhante. A plataforma foi fixada em um dos quatro quadrantes montados durante o treinamento durante quatro dias consecutivos. O teste foi concluído quando os ratos chegaram à plataforma. A latência de escape foi registrada. Se os ratos não conseguissem alcançar a plataforma dentro de 60 segundos, eles eram então guiados manualmente até a plataforma e deixados nela por 15 segundos. No quinto dia, após a retirada da plataforma, os ratos entraram no quadrante oposto ao da plataforma original. Em seguida, foram registrados o número de travessias de plataforma e trajetórias de movimento em 60 segundos.

Protocolo de ressonância magnética

O QSM foi avaliado por ressonância magnética, o que foi relatado em um estudo anterior [26]. A ressonância magnética foi realizada em um scanner 7 Tesla (BioSpec 70/30, Bruker, Alemanha). Uma sequência tridimensional (3D) multi-eco gradiente-recall echo (GRE) foi utilizada para QSM. Os parâmetros experimentais foram definidos da seguinte forma: tempo de repetição (TR)=60 ms, ângulo de rotação=15 grau, espessura do corte=23 mm, tamanho da matriz de aquisição=256×256, campo de visão (FOV)=32 mm×32 mm, tempo de eco do primeiro eco (TE1)=5 ms, espaçamento de eco (ΔTE)=50,77 ms, número de ecos{{19 }} e largura de banda=50 kHz. Ambas as imagens de magnitude e fase foram salvas para reconstrução QSM. Houve três etapas nos algoritmos de mapeamento QSM realizados com MATLAB R2014a (The Math Works, Natick, MA), desembrulhando a fase embrulhada, removendo o campo de fundo e gerando mapas de suscetibilidade do campo de tecido.

Preparação de tecidos

Os ratos de cada grupo receberam hidrato de cloral a 10% por via intraperitoneal para anestesia profunda (1,5 mg/kg) e depois perfundidos transcardialmente com solução salina gelada (aproximadamente 30 min) por uma bomba peristáltica (BT100-2 J, LongerPump, Xangai, China). Para coloração de Perls melhorada por DAB, os cérebros foram dissecados e pós-fixados em paraformaldeído a 2,5% durante a noite a 4 graus. No dia seguinte, foram retiradas secções coronais do hipocampo para coloração. Para outras determinações além da imuno-histoquímica, o hipocampo foi rapidamente removido em gelo e armazenado a 80 graus.

Coloração de Perls aprimorada por DAB

A coloração Perls aprimorada por DAB foi usada para detectar o acúmulo de ferro celular [27]. Seções de tecido cerebral foram imersas em água destilada por 3 min e depois incubadas com solução de Perls recém-preparada (ferrocianeto de potássio a 2%/ácido clorídrico a 2%) por 30 min, seguida de solução salina tamponada com fosfato (PBS) lavagens. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% em metanol por 15 min, seguido de 3 lavagens em PBS. Os sinais foram desenvolvidos por incubação por 3 min em 3,3-diaminobenzidina (DAB) e hematoxilina (Sigma-Aldrich) foram usadas para contrastação.

Avaliações Bioquímicas

O hipocampo foi isolado e agitado uniformemente para obter um homogeneizado a 10% que foi então centrifugado a 30,000–40,000 RPM por 10 min para obter um sobrenadante para estimar o ferro do hipocampo por um kit colorimétrico (E-BCK139S, Elabscience, Wuhan, China) e malondialdeído (MDA) foi detectado no sobrenadante usando um kit ELISA (Elabscience, Wuhan, China).

Western Blot

A concentração de proteína foi determinada utilizando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA, Biosharp, Pequim, China). As proteínas foram separadas por SDS-PAGE a 12% e depois transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Estes últimos foram bloqueados por 2 horas à temperatura ambiente em leite em pó desnatado a 5% diluído com tampão e depois incubados com anticorpos primários durante a noite a 4 graus, incluindo caspase anti-clivada de coelho-3 (1:1000 , Affinity Biosciences, Jiangsu, China), fator neurotrófico derivado do cérebro de coelho (BDNF) (1:1000, Affinity Biosciences, Jiangsu, China) e anti-actina de coelho (1:5000, Affinity Biosciences, Jiangsu, China). No dia seguinte, as membranas foram lavadas três vezes com TBST durante 5 min de cada vez e depois incubadas com uma solução de anticorpo secundário de cabra anti-coelho marcada com HRP (1:10.000, Servicebio, Wuhan, China) durante 1 h, e lavadas três vezes por 5 min.

PCR quantitativo em tempo real

Animal Total RNA Isolation Kit (Foregene), 5×All-In-One MasterMix (com kit AccuRT Genomic DNA Removal) (abm) e EvaGreen Express2×qPCR MasterMix-No Dye (abm) foram utilizados pelas instruções dos fabricantes. Os pares específicos de primers foram os seguintes: Fpn, primer forward, 5ʹ-CACCACAGGATATGCTTACAC TCAGG-3ʹ; iniciador reverso, 5'-GAGAACAGACCAGTC CGAACAAGG-3'; b-actina, iniciador forward, 5'-TGTCAC CAACTGGGACGATA-3'; iniciador reverso: 5ʹ-GGGGTG TTGAAGGTCTCAAA-3ʹ. O nível de mRNA de Fpn de cada amostra foi normalizado para o mRNA de b-actina.

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

Os hipocampos foram pós-fixados em líquido estacionário de microscópio eletrônico de glutaraldeído a 2,5% e depois desidratados em soluções de acetona em concentrações crescentes e embebidos em Epox 812. Em seguida, os cortes foram corados com acetato de uranila e citrato de chumbo. Imagens ultraestruturais no campo CA3 do hipocampo foram então capturadas com um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) com um JEM-1400-FLASH (JEOL, Tóquio, Japão).

Métodos estatísticos

Os dados são apresentados como média e desvio padrão (DP). As variáveis ​​que atenderam às condições do teste paramétrico foram avaliadas por meio do teste t de Welch, análise de variância de medidas repetidas (ANOVA) unidirecional ou bidirecional, seguida do teste de comparações múltiplas de Tukey. As variáveis ​​que não atenderam às condições do teste paramétrico foram avaliadas pelo teste U de Mann-Whitney, teste de Kruskal-Wallis ou ANOVA de Welch e Brown-Forsythe. Um valor de P<0.05 was considered statistically significant. Statistical analysis and figures were obtained by GraphPad Prism Version 9.0 (GraphPad Software, CA, USA).

Resultados

Efeito do EGCG na aprendizagem e na memória em ratos expostos à HAH crônica

Para verificar se o EGCG tem efeito no aprendizado espacial e no desempenho da memória de ratos expostos à HAH crônica, foi realizado o teste MWM. Como mostrado na Figura 1A, o número de travessias de plataforma pelo grupo de hipóxia diminuiu significativamente (P< 0.001, vs. the n group). The treatment of EGCG did not affect the number of crossings of rats in either the normal altitude group (n group vs. n-EGCG group, P>{{0}},05) ou o grupo HAH (grupo hipóxia vs. grupo h-EGCG, P > 0,05). Em seguida, a latência de escape foi calculada como o tempo que o rato levou para alcançar a plataforma escondida (Fig. 1B). Os resultados mostraram que do segundo ao quarto dia de treinamento, a latência de escape dos ratos do grupo hipóxia aumentou significativamente (todos os valores de P<0.01, vs. the n group). Moreover, the h-EGCG group showed reduced escape latency than that in the hypoxia group (all P values<0.05). Also, the swimming speed and distance in MWM were measured. No significant difference was found among these four groups at different time points (All P values>0.05, Figura 1C). Então, descobrimos que a velocidade de natação dos ratos no grupo hipóxia reduziu quando comparado com o grupo n no segundo e terceiro dia (todos os valores de P<0.01, Fig. 1D). Also, the swimming speed of rats in h-EGCG group was higher than that in hypoxia group (all P values<0.05, Fig. 1D).

Coloração de Perls aprimorada por DAB

Após 8 semanas de exposição crônica à HAH, o ferro aumentou significativamente nas áreas CA1 e CA3 do hipocampo do cérebro em comparação com o do grupo n (todos os valores de P<0.01). After EGCG intervention, iron accumulation in CA3 and CA1 of the hippocampus was reduced compared to that of the hypoxia group (P<0.0001, P<0.001, respectively; Fig. 2).

Mudanças na suscetibilidade magnética nas regiões do hipocampo

Os valores de suscetibilidade no hipocampo aumentaram significativamente após a exposição à HAH em comparação com os do grupo n (P<0.0001, Fig. 3A). After EGCG intervention, the values decreased compared to those of the hypoxia group (P<0. 0001, Fig. 3A).

Efeitos do EGCG no estresse oxidativo do hipocampo, ferro e Fpn
Em comparação com o grupo n, os conteúdos de MDA e ferro do grupo hipóxia estavam elevados (P<0.05, Fig. 3B, C). EGCG treatment reduced the levels of MDA and iron, indicating that alleviation of oxidative stress may facilitate EGCG to play a protective role in chronic HAH-induced brain injury in rats. To understand the mechanisms by which brain iron contents were changed by HAH, we further examined the mRNA expression of hippocampal Fpn and found that the Fpn decreased in the hypoxia group and increased in the h-EGCG group (P < 0.01, P < 0.05, respectively, Fig. 3D).

Resultados de Western Blotting

Avaliamos os efeitos do EGCG nos níveis de Caspase{{0}} e BDNF. A análise de Western blotting (WB) mostrou maior expressão de Caspase -3 e menor expressão de BDNF no hipocampo do grupo hipóxia do que no grupo n (todos os valores de P <0,0001, Fig. 4). Além disso, o tratamento com EGCG diminuiu os níveis de Caspase-3 e aumentou os níveis de BDNF (todos os valores de P<0.0001, Fig. 4).

Mudanças Ultraestruturais Neurais

Após 2 meses de exposição crônica à HAH, as mitocôndrias no hipocampo CA3 do grupo hipóxia ficaram inchadas devido à redução ou quebra da crista. Além disso, os ratos do grupo hipóxia apresentaram cromatina nuclear condensada, encolhimento nuclear, alto grau de inchaço do retículo endoplasmático, aumento dos lisossomos e aumento da densidade eletrônica. Após o tratamento com EGCG, o inchaço mitocondrial, a dissolução do cristal mitocondrial e a densidade eletrônica diminuíram acentuadamente em comparação com aqueles do grupo hipóxia (Fig. 5).

Discussão

No presente estudo, descobrimos que o tratamento com EGCG melhorou substancialmente as habilidades de aprendizagem, memória e exploração espacial dos ratos do grupo hipóxia e mitigou a lesão neural do hipocampo induzida pela exposição crônica ao ambiente HAH. Além disso, também descobrimos que, apesar de melhorias significativas em todos os indicadores após o tratamento com EGCG, estes indicadores raramente retornaram aos níveis normais de hipóxia.

Estudos anteriores descobriram que o EGCG tem alguns efeitos em vários tipos de modelos de aprendizagem e comprometimento da memória [28, 29]. Safar et al. descobriram que o EGCG pode melhorar a memória de ratos tratados com morfina [30]. Consistente com seus resultados, em nosso estudo, após intervenção diária com 50 mg/kg de EGCG em ratos cronicamente expostos ao HAH, as habilidades de aprendizagem, memória e exploração espacial dos indivíduos foram melhoradas, sugerindo que o EGCG pode melhorar os comprometimentos de aprendizagem e memória em altitudes elevadas.

Muitos estudos demonstraram que a superprodução de ferro no cérebro tem um efeito neurotóxico, pois contribui para o dano oxidativo [31]. Neste estudo, o acúmulo de ferro foi detectado por ressonância magnética, coloração imuno-histoquímica e avaliações bioquímicas. Além disso, a FPN, como a única proteína de exportação de ferro multitransmembrana conhecida em células de mamíferos, foi avaliada por PCR. Os valores de suscetibilidade, células positivas de DAB melhoraram a coloração de Perls e o conteúdo de ferro no hipocampo aumentou no grupo hipóxia e diminuiu no grupo h-EGCG, enquanto a expressão de FPN mostrou a tendência oposta. Portanto, concluímos que o acúmulo de ferro induzido pela HAH pode ocorrer através da inibição do efluxo de ferro através da redução na expressão de FPN.

O MDA é o produto final da peroxidação lipídica [32, 33] e pode ser usado como indicador de peroxidação. Estudos anteriores mostraram que o estresse oxidativo pode aumentar com o aumento da altitude [34]. Nosso estudo também revelou que as concentrações de MDA aumentaram significativamente em grandes altitudes. Além disso, analisamos a expressão de Caspase-3 e BDNF. A caspase -3 é o iniciador e executor mais importante de enzimas de clivagem terminal e apoptose [35], enquanto o BDNF, como uma neurotrofina, que pode regular a sobrevivência e diferenciação dos neurônios, bem como melhorar a transmissão sináptica [36], promove a regeneração. Lin et al. relataram que a hipóxia pode aumentar os níveis de Caspase -3 e induzir apoptose em neurônios do hipocampo [37]. Lee et al. relataram que após 3 min de isquemia global no gerbil, o EGCG evitou a morte celular do hipocampo induzida por isquemia (38). Em nosso estudo, também descobrimos que o EGCG diminuiu os níveis da proteína pró-apoptótica, Caspase-3, e aumentou a expressão do BDNF.

Danos e disfunções estruturais mitocondriais são características patológicas importantes no cérebro sob hipóxia [39]. Em nosso estudo, a observação ultraestrutural detectou a presença de coloração profunda, inchaço mitocondrial e desaparecimento de cristas em neurônios do hipocampo sob HAH, enquanto os neurônios do hipocampo após o tratamento com EGCG foram significativamente protegidos dessas lesões, como a cariopicnose. Iwona Zwolak resumiu que o EGCG pode proteger contra a toxicidade de metais pesados, preservando o potencial da membrana mitocondrial e melhorando as funções antioxidantes e respiratórias mitocondriais [40]. Suspeitamos que esses mecanismos também possam estar presentes no papel protetor do EGCG na exposição cerebral ao ambiente HAH. Em conclusão, o EGCG pode reduzir o acúmulo de ferro, diminuir os níveis de estresse oxidativo e a apoptose, e promover a regeneração neuronal, melhorando assim o comprometimento cerebral do rato induzido pela exposição crônica à hipóxia em grandes altitudes. Portanto, tem potencial para servir como um novo medicamento para tratar e prevenir o mal crônico das montanhas.

Agradecimentos

Gostaríamos de expressar nossa sincera gratidão às Instalações Centrais do Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan, Chengdu, China, por nos fornecer as instalações e assistência, como o teste de campo aberto e o teste do labirinto aquático de Morris usados ​​neste estudo.

Contribuições do autor

CC e HC conceberam, desenharam e realizaram este estudo; CC processou os dados e redigiu o manuscrito; JC modificou o manuscrito; BL, BH, YW, DZ e YQ auxiliaram na realização dos experimentos e FG foi responsável por todos os processos.

Financiamento

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nºs 81930046, 81771800 e 81829003).

Disponibilidade de dados

Os conjuntos de dados gerados e/ou analisados ​​durante o presente estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação razoável.

Declarações

Conflito de interesses

Os autores não têm interesses financeiros ou não financeiros relevantes a divulgar.

Aprovação ética

Este estudo foi realizado de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque. A aprovação foi concedida pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais do Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan, Chengdu, China.

Acesso livre

Este artigo está licenciado sob uma Licença Creative Commons Atribuição 4.0 Internacional, que permite o uso, compartilhamento, adaptação, distribuição e reprodução em qualquer meio ou formato, desde que você dê o devido crédito ao(s) autor(es) original(ais). ) e a fonte, forneça um link para a licença Creative Commons e indique se foram feitas alterações. As imagens ou outros materiais de terceiros neste artigo estão incluídos na licença Creative Commons do artigo, salvo indicação em contrário na linha de crédito do material. Se o material não estiver incluído na licença Creative Commons do artigo e o uso pretendido não for permitido por regulamentação legal ou exceder o uso permitido, você precisará obter permissão diretamente do detentor dos direitos autorais.

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