Absorção enteral de citrato férrico depende da proteína de transporte de ferro Ferroportina

Abstrato

O citrato férrico é aprovado como um produto de reposição de ferro em pacientes com doença renal crônica não dialítica e anemia por deficiência de ferro. O ferro administrado por citrato férrico é absorvido entericamente, mas os mecanismos específicos envolvidos não foram avaliados, incluindo as possibilidades de absorção transcelular mediada por ferroportina convencional e/ou absorção paracelular mediada por citrato. Aqui, demonstramos pela primeira vez a eficácia do citrato férrico em modelos de alta hepcidina, incluindo camundongos knockout Tmprss6 (caracterizados por anemia por deficiência de ferro refratária ao ferro) com e sem doença renal crônica induzida por dieta de adenina. Em seguida, para avaliar se a absorção enteral de citrato férrico depende ou não da ferroportina, avaliamos os efeitos do citrato férrico em um modelo murino nocaute de ferroportina específico para enterócitos induzível por tamoxifeno (Villin-Cre-ERT2, Fpn flox/flox ). Neste modelo, a deleção da ferroportina foi eficiente, pois a injeção de tamoxifeno induziu uma diminuição 4000-vezes na expressão do mRNA da ferroportina duodenal, com proteína ferroportina indetectável em um Western blot de enterócitos duodenais, resultando em um fenótipo de anemia por deficiência de ferro grave. Em camundongos com deficiência de ferroportina, três semanas de suplementação dietética de citrato férrico a 1 por cento, uma dose que preveniu a deficiência de ferro em camundongos controle, não melhorou o status de ferro ou resgatou o fenótipo da anemia por deficiência de ferro. Repetimos o experimento de nocaute de ferroportina condicional no cenário de uremia, usando um modelo de nefropatia por adenina, onde três semanas de suplementação dietética de citrato férrico a 1 por cento falharam novamente em melhorar o status de ferro ou resgatar o fenótipo de anemia por deficiência de ferro. Assim, nossos dados sugerem que a absorção enteral de citrato férrico é dependente do transporte convencional de ferro nos enterócitos pela ferroportina e que, nesses modelos, não ocorre absorção paracelular significativa.

Palavras-chave

citrato férrico; ferroportina; hepcidina; ferro; anemia; doença renal crônica.

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Introdução

Auryxia (citrato férrico [FC]; Akebia Therapeutics, Inc., Cambridge, MA) é um novo composto aprovado para uso clínico como aglutinante de fosfato enteral em pacientes adultos com doença renal crônica (DRC) em diálise. Em estudos randomizados, controlados por placebo, conduzidos em pacientes com DRC não dependentes de diálise, a FC diminuiu significativamente as concentrações séricas de fosfato.1,2 Em estudos randomizados, controlados por ativo, conduzidos em pacientes com DRC dependentes de diálise, a FC produziu reduções semelhantes nas concentrações séricas de fosfato .3,4

Auryxia também é aprovado nos EUA para uso clínico como um produto de reposição de ferro em pacientes com DRC sem diálise com anemia por deficiência de ferro. Nos 4 ensaios clínicos randomizados acima mencionados, conduzidos em coortes de DRC não dependentes de diálise e dependentes de diálise, FC aumentou significativamente a saturação de transferrina sérica (TSAT).1–4 Assim, FC pode funcionar tanto como um aglutinante de fosfato enteral eficaz quanto como fonte de ferro enteral.

Notavelmente, a CF corrige uma deficiência de ferro no cenário de DRC e até mesmo doença renal em estágio terminal, pois esses são estados com altos níveis de hepcidina.5–8 A hepcidina é o principal hormônio regulador do ferro, ligando-se e inibindo a ferroportina, o único conhecido exportador celular de ferro.9 No cenário de altos níveis de hepcidina, a atividade da ferroportina - localizada na superfície basal dos enterócitos - é diminuída, inibindo assim a absorção de ferro dietético e medicinal do lúmen gastrointestinal 10.

Os mecanismos pelos quais a FC supera o bloqueio entérico de ferro induzido por níveis elevados de hepcidina e baixos níveis de ferroportina não são claros. Uma hipótese é que a porção citrato em FC quela íons de cálcio, levando à ruptura das junções intercelulares apertadas dos enterócitos, permitindo a absorção paracelular de ferro que é independente da via hepcidina-ferroportina. Um ponto interessante a ser observado é que compostos de citrato facilitam a absorção enteral paracelular de alumínio,11,12 levantando a possibilidade de que a absorção de ferro seja aumentada pelo mesmo mecanismo. Para avaliar se a absorção enteral de ferro associada a FC ocorre por via transcelular, dependente de ferroportina, versus uma via paracelular, independente de ferroportina, avaliamos a absorção enteral de FC em modelos murinos, com ou sem DRC, com atividade de ferroportina enterocitária baixa ou ausente.

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MÉTODOS

1. Experimentos com ratos

Os experimentos foram conduzidos pelas diretrizes da Divisão de Medicina Animal de Laboratório da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA), e os protocolos do estudo foram aprovados pelo Escritório de Supervisão de Pesquisa Animal da UCLA. Os camundongos foram alojados na UCLA, em gaiolas padrão com cama de lascas de madeira que foi trocada duas vezes por semana. As salas dos alojamentos dos animais tinham temperatura e umidade controladas, com um ciclo de luz de 12-horas. Primeiro avaliamos os efeitos da FC em camundongos nocaute para serina protease transmembrana 6 (Tmprss6), um modelo caracterizado por altos níveis de hepcidina, baixa atividade de ferroportina e anemia ferropriva refratária ao ferro resultante,13 tanto sem como com a adição de adenina na dieta -induzida por DRC, que aumenta ainda mais os níveis de hepcidina.14 Para inibir completamente a atividade da ferroportina enteral, avaliamos os efeitos da FC em um modelo nocaute de ferroportina (FPN) induzível por tamoxifeno (FPN) (Villin-Cre-ERT2, Fpnflox/flox). Finalmente, avaliamos os efeitos da FC em um modelo Villin-Cre-ERT2, Fpnflox/flox com DRC induzida por dieta com adenina.

2. Camundongos knockout Tmprss6

Camundongos knockout Tmprss6 em um fundo genético C57BL/6 foram gentilmente cedidos pela Dra. Jodie Babitt (Massachusetts General Hospital). Primeiro avaliamos os efeitos do FC em camundongos nocauteados para Tmprss6 e irmãos de ninhada de tipo selvagem (WT) sem DRC. Camundongos com idades entre 4 e 7 semanas foram alimentados com dietas de ferro de 50 ppm sem adenina (Envigo, Hackensack, NJ), com ou sem 0,1 por cento FC (Akebia Therapeutics, Inc.), por 3 semanas , e então foram sacrificados. Em seguida, avaliamos os efeitos do FC em camundongos knockout Tmprss6 e irmãos de ninhada WT com CKD. Camundongos com 8–12 semanas de idade foram alimentados com dietas de ferro de 50 ppm com 0,2 por cento de adenina (Envigo) para induzir CKD,15–17 por 6 semanas. Nas últimas 3 semanas das dietas, 00,1 por cento FC (Akebia Therapeutics, Inc.) foi adicionado para um grupo e não adicionado para outro. Essa dose de FC em camundongos corresponde a uma dose típica de FC em humanos adultos; em um ser humano adulto, 2 comprimidos de Auryxia tomados três vezes ao dia (6.000 mg FC) contêm uma dose cumulativa diária de ferro férrico de 1.260 mg, uma quantidade equivalente a aproximadamente um terço do ferro corporal total. Em camundongos, aproximadamente um terço do ferro total do corpo é equivalente a ~ 0,8 mg de ferro férrico diariamente, ou ~ 4 mg de FC diariamente, o que, dado o consumo diário de alimentos murinos de ~ 4 g, corresponde a ração contendo 0,1 por cento de FC. Nesses experimentos, cada grupo continha aproximadamente metade de machos e metade de fêmeas. Após o sacrifício, coletamos sangue total, soro, fígado e enterócitos duodenais. Para isolar os enterócitos duodenais, a seção proximal do duodeno (~ 2 cm) foi aberta longitudinalmente e transferida para uma solução gelada de ácido etilenodiamina tetraacético. A solução foi agitada em vórtex para facilitar o desprendimento celular e as células dispersas foram coletadas por filtração.

3. Camundongos nocaute de ferroportina específicos para enterócitos não-CKD

Camundongos knockout para ferroportina (FPN) específicos para enterócitos, induzíveis por tamoxifeno, foram gerados pela criação de camundongos Villin-Cre-ERT2 com camundongos Fpnflox/flox, ambos com antecedentes genéticos C57BL/6. Camundongos Villin-Cre-ERT2 foram gentilmente cedidos pelo Dr. Peter Tontonoz (UCLA). Para caracterizar este modelo, avaliamos camundongos Fpnflox/flox, com ou sem VillinCre-ERT2, com ou sem indução de tamoxifeno (0.075 mg/g de peso corporal, injetado ip uma vez ao dia por 4 dias consecutivos dias; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para avaliar os efeitos da FC neste modelo, usamos camundongos Villin-Cre-ERT2, Fpnflox/flox com 6–8 semanas de idade que receberam injeção ip com veículo de óleo de girassol (grupo não induzido) ou tamoxifeno (0,075 mg/g de peso corporal; grupo induzido) uma vez ao dia por 4 dias consecutivos. Os camundongos foram mantidos com dietas de 50 ppm de ferro (Envigo) e depois sacrificados 7 semanas após a injeção. Alguns dos camundongos induzidos por tamoxifeno tiveram 1 por cento de CF adicionado às suas dietas durante as 3 semanas imediatamente antes do sacrifício. Nesses experimentos, 1 por cento de FC - uma dose suprafisiológica - foi escolhido para não perder um efeito secundário à dosagem insuficiente de FC. Para demonstrar a eficácia desta dose, realizamos um experimento de controle positivo separado no qual avaliamos se 3 semanas de suplementação dietética de FC a 1 por cento podem resgatar o fenótipo da anemia por deficiência de ferro em camundongos Villin-Cre-ERT2 não induzidos, Fpnflox/flox alimentados com um dieta pobre em ferro (4 ppm) (Envigo). Nos experimentos de nocaute de ferroportina específicos para enterócitos não CKD, cada grupo continha machos e fêmeas. Após o sacrifício, coletamos sangue total, soro, fígado, enterócitos duodenais e duodeno total para coloração de ferro. Os enterócitos duodenais foram isolados como descrito acima. Para a coloração de ferro duodenal, as amostras duodenais proximais foram fixadas em formalina e depois embebidas em blocos de parafina a partir dos quais as lâminas foram criadas. Os cortes desparafinizados foram corados com azul da Prússia de Perls para ferro não-heme e contracorados com vermelho rápido nuclear. O grau de coloração de ferro enterócito duodenal foi avaliado em uma escala semi-quantitativa por um revisor cego (SN).

4. Camundongos nocaute de ferroportina específica de enterócito CKD

Para repetir o experimento acima no cenário de CKD, camundongos machos Villin-Cre-ERT2, Fpnflox/flox com 6 semanas de idade foram iniciados em dietas de 0,2 por cento de adenina (Envigo) para induzir CKD. Dadas as diferenças de gênero no modelo de DRC de roedores induzida por dieta com adenina (fêmeas são mais resistentes aos efeitos da adenina dietética),18 apenas camundongos machos foram usados. Na idade de 8 semanas, os camundongos foram injetados ip, conforme descrito acima, com veículo de óleo de girassol ou tamoxifeno. Na idade de 12 semanas, após 6 semanas da dieta de adenina, os camundongos foram mudados para dietas padrão, sem adenina, 50 ppm de ferro com ou sem 1 por cento de FC adicionado. Os camundongos foram sacrificados com 15 semanas de idade, 7 semanas após a injeção e após 3 semanas de tratamento com ou sem FC. Sangue total, para medição de hemoglobina e glóbulos vermelhos, foi coletado quando os camundongos tinham 8 semanas (no momento da injeção), 12 semanas (no início das dietas com ou sem FC) e 15 semanas (no sacrifício). O soro, para medição de nitrogênio ureico e ferro, foi coletado quando os camundongos tinham 12 e 15 semanas de idade. Os enterócitos do fígado e do duodeno foram coletados, conforme descrito acima, no sacrifício.

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5. Análises de sangue

As contagens sanguíneas completas foram medidas pelo processador automatizado Hemavet 950 (Drew Scientific, Oxford, CT). Métodos colorimétricos foram usados ​​para testar o nitrogênio ureico sérico (BioAssay Systems, Hayward, CA) e o ferro sérico (Genzyme, Cambridge, MA). Ensaios internos de imunoabsorção enzimática (ELISA) foram usados ​​para medir os níveis séricos de hepcidina, conforme descrito anteriormente.19 Um kit ELISA disponível comercialmente foi usado para medir a eritropoietina sérica (R&D Systems, Minneapolis, MN).

6. Concentrações quantitativas de ferro no fígado

Os fígados colhidos foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a -80 graus. Pequenos pedaços de fígado (~100 mg) foram pesados ​​e homogeneizados. Uma solução de precipitação de proteína (0,53 N HCl e 5,3 por cento de ácido tricloroacético em água bidestilada) foi adicionada e as amostras foram fervidas e centrifugadas. As concentrações de ferro nos sobrenadantes foram medidas por um ensaio colorimétrico (Genzyme), depois normalizadas para os pesos das amostras originais para produzir as concentrações de ferro nos tecidos.

7. Reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa em tempo real

Os enterócitos duodenais foram homogeneizados em Trizol (Invitrogen, Waltham, MA) e o RNA foi isolado de acordo com o protocolo do fabricante. Realizamos transcrição reversa quantitativa (RT)-PCR usando o kit iScript RT-PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) e primers específicos para Fpn de camundongo (avanço: 5'-ATGGGAACTGTGGCCTTCAC-3'; reverso: 5' -TCCAGGCATGAATACGGAGA-3'). Usamos as seguintes condições de PCR: desnaturação inicial a 95 graus por 2 minutos, seguida de 40 ciclos de desnaturação a 94 graus por 30 segundos, anelamento a 58 graus por 30 segundos, extensão a 72 graus por 1 minuto e extensão final a 72 graus grau por 10 minutos. A expressão gênica foi normalizada para hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Hprt) (avanço: 5'-CTGGTTAAGCAGTACAGCCCCAA-3'; reverso: 5'-CAGGAGGTCCTTTTCACCAGC-3') e cada amostra de RNA foi analisada em duplicata . A expressão gênica de dobra relativa foi calculada usando o método delta-delta Ct.

8. Western blotting

Para a detecção da proteína ferritina no Western blot, o anticorpo primário usado foi FTH1 anti-camundongo de coelho (D1D4; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), em uma concentração de 1:10,000, e o anticorpo secundário usado foi IgG anti-coelho de cabra (Cell Signaling Technology), na concentração de 1:5000. Para detecção de ferroportina em Western blot, o anticorpo primário usado foi FPN anti-rato de rato (1C7; Amgen, Thousand Oaks, CA), a uma concentração de 1:3300, e o anticorpo secundário usado foi IgG anti-rato de coelho (ab102213; Abcam, Cambridge, MA), a uma concentração de 1:5000. Para o controle de carga de proteína de actina, anticorpo anti-actina de camundongo (A3854; Sigma-Aldrich), em uma concentração de 1:50.000, foi usado. Um sinal quimioluminescente foi detectado usando o ChemiDoc XRS plus System com o software Image Lab (Bio-Rad).

9. Análise estatística

A criação da figura e a análise estatística foram realizadas usando Graph-Pad Prism 9.2.0 (San Diego, CA). Os dados do camundongo são apresentados como médias ± DPs, e testes t foram usados ​​para comparar as médias dos grupos. Para dados não distribuídos normalmente, a transformação de log foi aplicada antes da análise estatística. Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Cápsulas Cistanche

DISCUSSÃO

Em estudos clínicos, demonstrou-se que a CF corrige a deficiência de ferro em pacientes com DRC e doença renal terminal, que são estados com altos níveis de hepcidina.5–8 No cenário de altas concentrações circulantes de hepcidina, a atividade enteral da ferroportina é diminuída, gerando um bloqueio mucoso mediado por hepcidina à absorção enteral de ferro.9 Os mecanismos pelos quais a FC pode superar esse bloqueio absortivo enteral são desconhecidos. Uma hipótese é que a porção citrato afrouxa as junções intercelulares, facilitando a absorção enteral de ferro paracelular e independente de ferroportina. Testamos essa hipótese avaliando a eficácia da CF em modelos de alta hepcidina/baixo teor de ferroportina - com e sem DRC - nos quais a via transcelular de absorção de ferro é quase ablacionada ou completamente bloqueada.

Em nosso primeiro modelo, camundongos knockout Tmprss6 sem DRC, nos quais os níveis de hepcidina são levemente elevados, o FC melhorou o status de ferro e aumentou as concentrações de hemoglobina. Da mesma forma, em nossos modelos knockout de WT e Tmprss6 com DRC, nos quais os níveis de hepcidina são acentuadamente elevados, FC aumentou a contagem de glóbulos vermelhos e a hemoglobina. Esses dados demonstram a eficácia da CF em estados com altos níveis de hepcidina e são consistentes com o que foi observado em estudos clínicos de CF; no entanto, esses modelos não sugerem quais são os mecanismos pelos quais FC supera o bloqueio da hepcidina mucosa.

Nesses modelos, nos quais a ferroportina permanece intacta, o FC pode ser absorvido por uma via paracelular, desviando do eixo hepcidina-ferroportina, ou pode ser absorvido por uma via transcelular, utilizando a ferroportina. Para avaliar a dependência da FC da ferroportina enteral, utilizamos um modelo murino knockout de ferroportina induzível e específico para enterócitos. Este modelo é altamente eficaz na depleção quase completa da proteína ferroportina do enterócito, resultando em absorção enteral de ferro drasticamente reduzida e anemia por deficiência de ferro grave, um fenótipo que pode ser resgatado pela administração parenteral de ferro.26 Neste modelo, qualquer bypass substancial da ferroportina canônica A via dependente seria prontamente detectável.

Em nosso modelo não-CKD, na ausência de ferroportina de enterócito, uma dose de FC que foi eficaz em camundongos WT não melhorou o status de ferro ou resgatou o fenótipo de anemia por deficiência de ferro. Pequenos aumentos na contagem de glóbulos vermelhos e hemoglobina não foram estatisticamente significativos, sugerindo que a absorção entérica de FC é predominantemente dependente de ferroportina e argumentando contra a extensa absorção paracelular. No contexto da DRC, os fatores associados à uremia podem potencialmente aumentar a permeabilidade intestinal,24 possivelmente afrouxando as junções estreitas intercelulares e facilitando algum grau de absorção paracelular do FC. No entanto, em nosso modelo de DRC, FC melhorou significativamente o status de ferro na presença de ferroportina enterocitária, mas não na sua ausência. Esses dados sugerem que, mesmo no cenário de DRC, a absorção entérica de FC é predominantemente mediada pelo transporte de ferroportina e não por possíveis vias paracelulares. Nos camundongos com DRC não induzida, o tratamento com FC aumentou a proteína ferroportina duodenal, apesar da menor expressão de mRNA de ferroportina duodenal, consistente com um mecanismo estabelecido pelo qual o acúmulo intracelular de ferro desencadeia a desrepressão mediada por IRP da tradução ferroportina,21–23 facilitando assim a absorção celular de ferro e entrega à circulação.

Realizamos 2 experimentos CKD. As concentrações médias terminais de nitrogênio ureico e hemoglobina no soro foram semelhantes entre o grupo de dieta controle WT CKD do primeiro experimento e o grupo CKD não induzido e não tratado do segundo experimento. No entanto, no primeiro experimento CKD, os camundongos WT tratados com FC tiveram um aumento significativo na hemoglobina, mas no segundo experimento CKD, os camundongos não induzidos tratados com FC não tiveram um aumento significativo na hemoglobina. A razão pela qual a FC não aumentou significativamente a hemoglobina nos camundongos não induzidos, apesar de melhorar claramente o status de ferro, não é clara; no entanto, possíveis fatores contribuintes incluem a etiologia multifatorial da anemia CKD, os pequenos tamanhos de amostra de camundongos não induzidos e a flebotomia repetida neste experimento. Uma limitação adicional do estudo é que usamos modelos de camundongos cuja traduzibilidade para humanos não é certa. Além disso, embora robusta, a evidência para a falta de absorção paracelular significativa de FC é indireta.

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Em resumo, em nossos modelos de alto nível de hepcidina, observamos efeitos benéficos da CF sobre o ferro e os parâmetros eritrocitários, sugerindo absorção de ferro enteral eficaz, apesar dos altos níveis de hepcidina. Para avaliar se a FC pode ignorar o bloqueio da hepcidina na mucosa via potencial absorção paracelular facilitada por citrato, avaliamos um modelo induzível de nocaute de ferroportina específico para enterócitos, na presença ou ausência de função renal prejudicada. Nesses modelos, a FC não resgatou o fenótipo da anemia por deficiência de ferro, demonstrando que a absorção enteral da FC é predominantemente dependente da ferroportina e sugerindo que as vias paracelulares provavelmente não constituem as principais vias de absorção fisiológica da FC.

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Mark R. Hanudel1, Brian Czaya2, Shirley Wong2, Maxime Rappaport1, Shweta Namjoshi1, Kristine Chua2, Grace Jung2, Victoria Gabayan2, Bo Qiao2, Elizabeta Nemeth2, Tomas Ganz2

1. Departamento de Pediatria, Escola de Medicina David Geffen da UCLA, Los Angeles, Califórnia, EUA

2. Departamento de Medicina, Escola de Medicina David Geffen da UCLA, Los Angeles, Califórnia, EUA