Aprimorando a proteômica de cima para baixo do tecido cerebral com FAIMS Parte 4

Também identificamos numerosos fragmentos derivados de isoformas de splicing não canônico de tauproteína conhecidas por serem expressas no cérebro humano.83 Resumidamente, as isoformas de tau são definidas pelo número de inserções N-terminais devido ao splicing alternativo do éxon 2 e/ou 3 (referido como 0N, 1N e 2N) e o número de repetições de ligação aos microtúbulos devido ao splicing alternativo do éxon 10 (referido como 3R ou 4R).84

A proteína tau é uma proteína importante nas células neuronais, que desempenha um papel muito importante na manutenção da estrutura e função normais das células neuronais. Estudos demonstraram que a proteína tau está intimamente relacionada à memória e sua expressão anormal pode levar ao declínio cognitivo e até mesmo ao prejuízo cognitivo.

Os cientistas fizeram muitas pesquisas sobre a relação entre a proteína tau e a memória. Segundo a pesquisa, a proteína tau pode ajudar a regular a estabilidade das fibras nervosas, promovendo assim a transmissão de informações e a formação de memória entre as células neuronais. Porém, uma vez que a proteína tau é anormal, como o acúmulo de proteínas, levará à ruptura das fibras nervosas e à morte de um grande número de células neuronais, o que afetará a formação e manutenção da memória e até mesmo levará ao comprometimento da memória. Portanto, manter a expressão e função normais da proteína tau é muito importante para manter a saúde da memória.

Estudos recentes também descobriram que os nutrientes contidos em alguns alimentos e bebidas também são benéficos para manter a função normal da proteína tau. Por exemplo, antioxidantes, ácidos graxos ômega-3 e vegetais e frutas ricos em cafeína podem ajudar a regular a expressão e a função da proteína tau, que ajuda a melhorar a memória e a função cognitiva.

Portanto, devemos estar atentos à manutenção de bons hábitos de vida, controle da alimentação, redução do estresse, etc., para manter a expressão e função normais da proteína tau. Ao mesmo tempo, manter bons hábitos de estudo e praticar exercícios moderados também pode ajudar a promover a transmissão de informações e a formação de memória entre as células neuronais. Acredito que desde que prestemos atenção em manter um estilo de vida saudável, podemos ter uma memória saudável e aproveitar melhor a vida. Isso mostra que precisamos melhorar nossa memória. Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia do Cistanche vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc.

Clique em conhecer 10 maneiras de melhorar a memória

Também vale a pena notar que fragmentos endógenos de tau são um achado comum no tecido cerebral humano e no líquido cefalorraquidiano, e a fragmentação diferencial de tau pode desempenhar um papel na progressão da DA.85,86

Observamos vários fragmentos que poderiam distinguir inequivocamente {{0}}N e 1N tau (Figuras 10A, S7 e S8). O fato de observarmos altas contagens espectrais para 0N (86 PrSMs) e 1N (91 PrSMs), mas não observarmos nenhum PrSMs para 2N, está alinhado com imunotransferência quantitativa anterior que descobriu que 0N e 1N são as formas dominantes e fazem ∼ 91% do tau total, enquanto 2N compreendia apenas ∼9%.87

Sobre a atribuição inequívoca das repetições de ligação aos microtúbulos, observamos espectros que também poderiam ser atribuídos a 3R (Figuras 10A e S9) e 4R tau (Figuras 10A e S10).

A inferência parcimoniosa permitiu-nos concluir que o braintau é representado principalmente pela mistura de variantes de emenda 1N3R (Tau-B) seguida por variantes de emenda 0N4R (Tau-D), o que está de acordo com observações anteriores.87,88

Embora outras isoformas de splice também tivessem fragmentos únicos, o baixo número de correspondências espectrais (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Surpreendentemente, os terminais N dos fragmentos contendo o domínio R predominante são uma continuação dos terminais C dos fragmentos contendo o domínio N predominante, ou em outras palavras, eles parecem ser fragmentos ligados produzidos a partir de um possível evento de clivagem proteolítica (referido como local nº 1 na Figura 10A). Além disso, os terminais C das proteoformas contendo os domínios 3R e 4R compartilham o mesmo local de clivagem (referido como local #2 na Figura 10A), embora as próprias sequências sejam diferentes devido à variação de splice do éxon 10.

Ainda mais surpreendente, todos esses locais de clivagem estão dentro de três motivos hexapeptídicos bem descritos.89-95 A Figura 10B demonstra todos os fragmentos únicos que identificamos em nossos conjuntos de dados que poderiam ser mapeados para a isoforma tau 1N3R, bem como a localização da clivagem. sites.

O local de clivagem nº 1 encontra-se na segunda região rica em prolina da tau, que divide a sequência hexapeptídica KVAVVR e fornece um dos locais de ligação mais fortes para microtúbulos (Figura 10B).89–91 O local de clivagem nº 2 encontra-se nos motivos hexapeptídicos 3R e 4R VQIVYK e VQIINK, que demonstraram impulsionar a agregação de tau (Figura 10B).92–95

Curiosamente, muitos dos fragmentos, como mostrado na Figura 10B, começam ou terminam na proximidade destes dois locais de clivagem. Cada um desses motivos hexapeptídeos é conhecido por formar uma estrutura -, muitas vezes na forma de grampos - que fundamentam a agregação envolvida em várias doenças neurodegenerativas.89,93,96 Curiosamente, essas observações destacam a possibilidade de uma via de degradação proteolítica compartilhada entre as isoformas de tau que é capaz de interromper suas regiões de propagação de agregação.25,85,86

Por último, encontramos inúmeras correspondências espectrais para A que só poderiam ser observadas exclusivamente usando FAIMS.

Estas proteoformas A, que normalmente requerem técnicas especiais de fracionamento ou manuseio para melhorar a recuperação devido às suas propriedades hidrofóbicas e propensas à agregação,9,16,97,98 foram observadas intactas usando FAIMS na faixa de -40 a -50 CV.

Isso inclui os canônicos A 1–42 e A 1–40 (Figura 11A, B, respectivamente), bem como várias formas truncadas no terminal N (especificamente A 2–42 e A 4–42, Figura 11C, D).

Vale a pena notar que as proteoformas A com várias clivagens N e C-terminais são notoriamente difíceis de identificar em análises bottom-up devido à extrema hidrofobicidade dos produtos trípticos, o que destaca uma vantagem da análise de proteínas intactas.

Acreditamos que a metodologia FAIMS-TDP oferece uma maneira robusta de obter a identificação intacta dessas proteoformas A, permitindo uma fácil determinação das diferentes combinações de produtos de clivagem N e C-terminais existentes.

CONCLUSÕES

Descrevemos como a separação de fase reversa nano-LC de uma amostra altamente complexa contendo proteínas, em uma ampla faixa de massa, pode se beneficiar da implementação do fracionamento em fase gasosa através de FAIMS no contexto da espectrometria de massa de cima para baixo.

Foi demonstrado que o FAIMS impacta a transmissão de proteoformas por tamanho e/ou carga, reduzindo a complexidade do MS1 e permitindo maior profundidade de cobertura do proteoma.

FAIMS em um único CV (-50) permitiu a identificação de 1833 ± 17 proteoformas únicas em média, mais que o dobro em comparação com sem FAIMS (754 ± 35). A adição de FAIMS não resultou numa deterioração da reprodutibilidade da quantificação e permaneceu perto de 20% RSD, o que é comparável com abordagens bottom-up sem rótulo.

Observou-se que a diminuição do CV de FAIMS aumenta a massa molecular das espécies de íons transmitidas ao instrumento (MW médio de ∼5 kDa a -50 CV vs ∼15 kDa a -20 CV), e a modulação de CV também foi observada para influenciar a transmissão de o envelope de estado de carga de uma proteoforma diferencialmente.

Também definimos combinações ótimas de CVs que poderiam produzir o maior máximo teórico de proteoformas/genes ou cobertura de sequência de proteoma. Em comparação com os três conjuntos de dados "No FAIMS", o passo CV externo em -50, -40 e -30 V poderia mais que dobrar o número de proteoformas únicas, genes únicos e cobertura de sequência proteômica.

Também vale a pena salientar que o nosso trabalho explorou apenas uma faixa de CV relativamente pequena que consideramos mais adequada à nossa abordagem TDP usando uma amostra complexa. Como o FAIMS pode ser facilmente adaptado a outros métodos, análises MS1 de baixa resolução com analisadores Orbitrap podem melhorar a identificação de proteoformas maiores dentro da faixa de CV que testamos, bem como além de -20 V, onde proteoformas maiores provavelmente seriam observadas.

Também pode-se imaginar que a futura instrumentação do analisador de massa que melhore a aquisição de proteoformas maiores e seja compatível com FAIMS possa se beneficiar da exploração de CVs abaixo de -20, estendendo-se até a faixa de tensão positiva.

Nosso fluxo de trabalho TDP nos permitiu identificar e caracterizar proteoformas únicas derivadas de genes com funções conhecidas em doenças neurodegenerativas.

Isso incluiu a determinação da composição de um deslocamento de massa desconhecido presente próximo ao domínio de ligação ao ferro da -sinucleína, que foi usado para identificar as localizações de potenciais domínios de ligação ao ferro em - e também na sinucleína. PARK7 também foi modificado com um grupo succinil em seu sítio ativo, resíduo Cys.

Fomos capazes de distinguir inequivocamente fragmentos de tau correspondentes às isoformas variantes de splice 0N, 1N, 3R e 4R individualmente e descrever novos locais de clivagem proteolítica localizados dentro ou perto de várias repetições hexapeptídeos de semeadura de agregação.

Finalmente, o FAIMS permitiu a identificação de várias proteoformas A intactas, incluindo a A 1–42 propensa à agregação, sem a necessidade de técnicas complexas de fracionamento ou purificação.

Em resumo, acreditamos que a adição do FAIMS para descobrir o TDP fornecerá um método robusto e reprodutível para aumentar o proteoma disponível para detecção e caracterização.

Material Suplementar

Consulte a versão Web no PubMed Central para material suplementar.

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer a Tao Liu e Richard Smith pelos seus conselhos e discussões úteis.

Este trabalho foi apoiado por U01 AG061356 (PLDJ) e R01 AG015819 (DAB). Uma parte da pesquisa foi realizada usando EMSL (grid.436923.9), um mecanismo de usuário do DOE Office of Science patrocinado pelo programa de Pesquisa Biológica e Ambiental. Os recursos gráficos abstratos e de imagem na Figura 1 foram criados usando Biorender.com.

REFERÊNCIAS

(1). Nicols E; Szoeke CEI; Vollset SE; Abbasi N; Abd Allah F; Abdela J; Aichour MTE; AkinyemiRO; Alahdab F; Asgedom SW; Awathi A; Barker-Collo SL; Baune BT; Béjot Y; Belachew AB; Bennet DA; Biadgo B; Bijani A; Bin Sayeed MS; Brayne C; Carpinteiro DO; Carvalho F; Catalá-López F; Cerin E; Choi J-YJ; Droga AK; Degefa MG; Djalalinia S; Dubey M; Duken EE; Edvardsson D; Endres M; Eskandarieh S; Faro A; Farzadfar F; Fereshtehnejad SM; Fernandes E; Filipe I; Fischer F; Gebre AK; Geremew D; Ghasemi-Kasman M; Gnedovskaya EV; GuptaR; Hachinski V; TB de Hagos; Hamidi S; Hankey GJ; Haro JM; Feno SI; Irvani SSN; Jha RP;Jonas JB; Kalani R; Karch A; Kasaeian A; Khader YS; Khalil IA; Khan EA; Khanna T; Khoja TAM; Khubchandani J; Kisa A; Kissimova-Skarbek K; Kivimäki M; Koyanagi A; KrohnKJ; Logroscino G; Lorkowski S; Majdan M; Malekzadeh R; März W; Massano J; MengistuG; Meretoja A; Mohammadi M; Mohammadi-Khanaposhtani M; Mokdad AH; Mondello S;Moradi G; Nagel G; Naghavi M; Naik G; Nguyen LH; Nguyen TH; Nirayo YL; Nixon MR; Ofori-Asenso R; Ogbo FA; Olagunju AT; Owolabi MO; Panda-Jonas S; Passos VM d. A.;Pereira DM; Pinilla-Monsalve GD; Piradov MA; Lagoa CD; Pouschi H; Qorbani M; Radfar A;Reiner RC; RobinsonSR; Roshandel G; Rostami A; Russo TC; Sachdev PS; Safári H; SafiriS; Sahathevan R; Salimi Y; Satpatia M; Sawhney M; Saylan M; Sepanlou SG; ShafieesabetA; Shaikh MA; MA do Saara; Shigematsu M; Shiri R; Shiue I; Silva JP; Smith M; SobhaniS; Stein DJ; Tabarés-Seisdedos R; Tovani-Palone MR; Tran BX; Tran TT; Tsegay AT; UllahI; Venketassubramaniano N; Vlassov V; Wang YP; Weiss J; Westerman R; Wijeratne T; WyperGMA; Yano Y; Yimer EM; Yonemoto N; Yousefifard M; Zaidi Z; Zare Z; Vos T; Feigin VL;Murray CJL Carga global, regional e nacional da doença de Alzheimer e outras demências, 1990–2016: uma análise sistemática para o Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [PubMed: 30497964]

(2). Beireuther K; Masters CL Proteína precursora de amilóide (APP) e beta amilóide na etiologia da doença de Alzheimer: relações precursor-produto no distúrbio da função neuronal.Brain Pathol. 1991, 1, 241–251. [PubMed: 1669714]

(3). HardyJ; Doença de Higgins G. Alzheimer: a hipótese da cascata amilóide. Ciência 1992, 256.184–185. [PubMed: 1566067]

(4). Proteína Goedert M. Tau e a patologia neurofibrilar da doença de Alzheimer. Tendências Neurosci.1993, 16, 460–465. [PubMed: 7507619]

(5). Iqbal K; Liu F; Gong CX Tau e doenças neurodegenerativas: a história até agora. Nat. Rev. Neurol.2016, 12, 15–27. [PubMed: 26635213]

(6). Musiek ES; Holtzman DM Três dimensões da hipótese amilóide: tempo, espaço e 'alas'. Nat. Neurosci. 2015, 18, 800–806. [PubMed: 26007213]

(7). Propagação de Takeda S. Tau como alvo diagnóstico e terapêutico para demência: potenciais e perguntas não respondidas. Frente. Neurosci. 2019, 13, 1274. [PubMed: 31920473]

(8). Gregorich ZR; Ge Y. Proteômica de cima para baixo na saúde e na doença: desafios e oportunidades.Proteômica 2014, 14, 1195–1210. [PubMed: 24723472]

(9). Zakharova NV; Bugrova AE; Kononikhin AS; Indeykina, Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente. MI; Popov IA; Nikolaev EN Análise por espectrometria de massa da diversidade de peptídeos Abeta: dificuldades e perspectivas futuras para a descoberta de biomarcadores de DA. Especialista Rev.Proteômica 2018, 15, 773–775. [PubMed: 30253669]

(10). Grasso G. A espectrometria de massa é uma arma multifacetada a ser usada na batalha contra a doença de Alzheimer: peptídeos beta amilóides e muito mais. Espectro de Massa. Rev. 2019, 38, 34–48.[PubMed: 29905953]

(11). Andreev vice-presidente; Petyuk VA; Cervejeiro HM; Karpievitch YV; Xie F; Clarke J; Acampamento D; Smith RD;Lieberman AP; Albino RL; Nawaz Z; El Hokayem J; Myers AJ Proteômica quantitativa por LC-MS sem rótulo da doença de Alzheimer e cérebros humanos normalmente envelhecidos. J. Proteoma Res. 2012, 11.3053–3067. [PubMed: 22559202]

(12). ZhangQ; Mac; Engrenagem M; Wang PG; Queixo LS; Li L. Proteômica integrada e análise de rede identificam centros de proteínas e alterações de rede na doença de Alzheimer. ActaNeuropatol. Comum. 2018, 6, 19. [PubMed: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com