Eficácia e mecanismo de extrato de Herba Cistanches no tratamento da disfunção reprodutiva em ratos com deficiência de rim-yang com base na metabolômica

ResumoEste estudo investiga oEfeito protetor reprodutivoeMecanismo potencial do extrato de Herba Cistanches(CHE) em um modelo de rato deDeficiência de rim-yanginduzido por adenina. Os ratos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos: normal, modelo, Che de baixa dose (0. mg · kg -1 · d -1). Os ratos receberam adenina (200 mg · kg -1 · d -1) por gavagem nos primeiros 14 dias para induzir a deficiência de rim yang, enquanto recebem simultaneamente o tratamento medicamentoso. Após 14 dias, a modelagem foi descontinuada, mas o tratamento medicamentoso continuou por 49 dias. O conteúdo dos componentes no CHE foi analisado por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). O modelo de deficiência de rim induzido por adenina foi avaliado através da caracterização dos sintomas e medição dos níveis de testosterona (t) usando um kit de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os danos patológicos ao testículo e epidídimo foram avaliados com base no peso úmido e na realização de coloração com hematoxilina-eosina (HE). A densidade e a motilidade dos espermatozóides foram medidos usando análise de esperma auxiliada por computador (CASA), e a viabilidade dos espermatozóides foi avaliada usando kits de coloração de esperma ao vivo/morto, e a morfologia dos espermatozóides foi avaliada usando coloração com eosina, determinando assim a qualidade dos espermatozóides de ratos. Metabolomi CS foi usado para analisar alterações nos metabólitos séricos, enriquecendo as vias metabólicas relacionadas e explorar o mecanismo de CHE na melhoria dos danos na função reprodutiva em ratos comSíndrome de deficiência de rim-yang. Comparado ao grupo normal, o grupo modelo exibiu significativosintomas de deficiência de rim-yang, níveis t reduzidos, diminuição dos pesos úmidos testiculares e epididimais e danos patológicos significativos ao testículo e epidídimo. A densidade do esperma, motilidade e viabilidade, com uma taxa aumentada de anormalidades de espermatozóides. Por outro lado, os ratos tratados com CHE apresentaram melhorias acentuadas nos sintomas de deficiência de rim-yang, níveis de T restauraram, aliviaram danos patológicos ao testículo e epidídimo e melhoraram vários parâmetros de esperma. Os resultados da metabolômica revelaram 286 metabólitos diferenciais entre os grupos normais e modelo (191 regulados e 95 desregulados). Setenta e cinco metabólitos diferenciais foram identificados entre o modelo e os grupos CHE de baixa dose (21 regulados e 54 desregulados). Um total de 24 metabólitos diferenciais comuns foram identificados nos três grupos, com 22 desses metabólitos exibindo tendências opostas de regulação entre os dois grupos de comparação. Esses metabólitos estavam envolvidos principalmente no metabolismo do ácido linoléico, no metabolismo lipídico éter e na biossíntese de ácido pantotênico e coenzima, além de metabólitos, incluindo 13- hidroperoxilinoleico (13-} hpode), lisófusfatilcolina. O CHE pode melhorar os sintomas de deficiência de rim-yang em ratos, aliviar os danos nos órgãos reprodutivos e aumentar a qualidade dos espermatozóides. A regulação do metabolismo lipídico pode ser um mecanismo potencial através do qual o CHE melhora a função reprodutiva em ratos comDeficiência de rim-yang. Os potenciais compostos bioativos de Che incluemequinacosídeo, verbascoSídeo, Salidroside, Betaína e Cistanoside A.

 

Palavras -chave Cistanches Herba Extract; Deficiência de rim-yang; oligasthenospermia; adenina; metabolome; Metabolismo lipídico

 

 

Os clientes viajamsobre Cistanche para melhorar a função reprodutiva

 

 

 

Síndrome de deficiência de Yang rimé um tipo de síndrome do frio da deficiência causada pela deficiência de yang nos rins, falha na função de aquecimento e falha da transformação de Qi. A medicina moderna acredita que é uma doença metabólica causada por distúrbios neuroendócrinos, incluindo o eixo hipotalâmico-hipófise-gonadal (HPG). Pacientes clínicos do sexo masculino geralmente mostram sintomas como menor libido, baixo volume de sêmen, baixa motilidade espermática e lombalgia. Sintomas graves podem levar a infertilidade e defeitos congênitos [1]. O aquecimento do yang rim é o método central de tratamento da medicina tradicional chinesa para a infertilidade masculina causada pela deficiência de rim yang [2]. Cistanche Deserticola é o caule carnudo seco com folhas escamosas da planta deserticola ycma da família Orobanchaceae. Tem o efeito de tonificar o rim yang e beneficiar a essência e o sangue. É frequentemente usado para tratar a deficiência, impotência e infertilidade dos rins Yang [3]. De acordo com as estatísticas, o deserticola de Cistanche também é o medicamento mais usado nas prescrições de tonificação para rins e fortalecimento de yang ao longo dos tempos [4]. Estudos farmacológicos modernos confirmaram que extratos como glicosídeos totais e oligossacarídeos do deserticola de Cistanche podem regular a homeostase do eixo HPG e do eixo hipotálamo-hemisário-adrenal em ratos com deficiência de yang rim [5]. O extrato de Cistanche Deserticola também pode melhorar a espermatogênese e a disfunção sexual em ratos com deficiência de rim yang [6-7]. No entanto, os mecanismos potenciais desses efeitos terapêuticos não foram explorados em profundidade. A metabolômica combina dinamicamente as alterações de metabólitos com os processos biológicos de maneira geral, revelando a natureza metabólica dos processos fisiológicos e de doenças e os mecanismos farmacodinâmicos dos medicamentos. Essa característica holística e dinâmica é consistente com o conceito de medicina tradicional chinesa [8]. Portanto, este estudo utilizou a tecnologia metabolômica para explorar a eficácia e o mecanismo do extrato de deserticola de cistanche sobre danos à função reprodutiva em ratos com deficiência de rim yang causada pela adenina e para explicar a conotação científica moderna de deserticola de cistanche em Yang tonificante.

1 materiais

1.1 Animais

50 grau SPF 9- ratos SD masculinos da semana, pesando 330-340 g, foram adquiridos da Pequim Huafukang Biotechnology Co., Ltd., número da licença SCXK (Pequim) 2019-0008. Os animais foram mantidos na sala de animais SPF do centro de animais experimentais do Instituto de Materia Chinesa Medica, Academia de Ciências Médicas Chinesas, com iluminação circadiana natural, umidade e temperatura constantes e dieta e atividade livres. O experimento animal aprovou a revisão ética do bem -estar animal experimental do Instituto de Materia Chinesa Medica, Academia de Ciências Médicas Chinesas (Número de aprovação ética 2021B166).

 

1.2 drogas

As fatias de cistanche deserticola foram adquiridas da Pequim Tongrentang (loja de Chongwenmen), número de lote 1806016 e foram identificadas por Zhu Jingjing, um pesquisador do Instituto de Materia Medica, da China da Cincha, como a Cisters Medical Sciences, como os flechos secos com folhas de escala de escala, Pesar 500 g de cistanche deserticola e adicionar
10 vezes a quantidade de etanol a 70% para extrato de refluxo por 2,5 h, filtrar, adicionar 8 vezes a quantidade de etanol a 70% ao extrato de resíduo e refluxo por 2,5 h, filtrar, combinar os dois filtrados e reduzir a pressão para secar o extrato combinado em pó. O rendimento de pó seco é de 47%e armazenar -o em estado seco.

1.3 Reagentes

Echinacosídeo, verbascosídeo, salidrosídeo, betaína, cistancheside A, tubulosídeo A e ácido cafeico foram adquiridos da Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd., com números em lote Jot -10172, {{}}},},}, Jot {}}, 1},}}, Jot, Jot -10172 {{}}},},},}, Jot {}}},}}, Jot {}}},},}},}},},},}},}, jot {}}, 1}}, jot {}}, 1}}, jot {}}, 1}},}, jot. JOT -11356, Jot11627 e Jot -10196, respectivamente; A acetonitrila de grau cromatográfico, metanol de grau cromatográfico e ácido fosfórico de grau analítico foram adquiridos da Chengdu Zhongjinlong Technology Development Co., Ltd., com números de lote SIGMA-WXBF1922V, SIGMA-WXBF2452V e 20240220222202020, respectivamente; A adenina foi comprada da Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., com o número do lote S18009; A L-carnitina (LC) foi adquirida da Shenyang No. 1 Pharmaceutical Co., Ltd., com o lote número 210372;
Os kits de atividade celular de calceína/PI e detecção de citotoxicidade foram adquiridos da Pequim Biolab Technology Co., Ltd., número do lote HR0444; A testosterona (T) Kit de ensaio imunossorvente (ELISA) foi adquirida da Wuhan Elaruite Biotechnology Co., Ltd., número do lote E-El -0155} c; A água de amônia foi adquirida da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., lote número 10002108; A solução de coloração de hematoxilina-eosina (HE) foi adquirida da Pequim Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., número do lote BSBA -4025.

 

2.2 Análise de componentes químicos do extrato de Cistanche Deserticola

2.2.1 Preparação da solução estoque de referência

Precisely weigh 10.41 mg of salidroside, 11.19 mg of echinacoside, 10.86 mg of cistancheside A, 10.19 mg of tubuloside A, 10.28 mg of verbascoside, and 10.67 mg of caffeic acid into 25 mL volumetric flasks, add 50% methanol to dissolve and dilute to scale, shake well to obter.

 

2.2.2 Preparação da solução de referência mista

Precisamente pipeta 1 ml de solução de estoque de referência Salidrosídeo, 5 ml de equinacósido, 2 ml de cistancheside A, 100 μl de tubulosídeo A, 350 μl de verbascofósido e 100 μl de ácido cafeico no mesmo volumétrico de 25 ml de retenção. Pesar com precisão 12,24 mg de betaína em um balão volumétrico de 10 ml, adicione 50% de metanol para se dissolver e diluir à marca, agitar bem e obter a solução de referência de betaína.

2.2.3 Preparação da solução de teste

Pesar com precisão 310,14 mg da amostra de teste em um balão volumétrico de 25 ml, adicione água para dissolver e diluir à marca, agitar bem e filtrar.

 

2.2.4 Condições cromatográficas
Método de detecção de betaína: coluna Xamida (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); fase móvel Acetonitrile-Water (80:20); temperatura da coluna 30 graus; Taxa de fluxo 1 ml · min -1; Volume de injeção 10 μl.
Outras condições de detecção de componentes: Kromasil 100-5- coluna C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); Acetonitrila de fase móvel (A)

e {{0}}. 1% Solução de ácido fosfórico (b); temperatura da coluna 30 graus; Taxa de fluxo 1 ml · min -1; Volume de injeção 10 μl, eluição do gradiente (0 ~ 10 min, 10%a; 10 ~ 20 min, 10%~ 15%a; 20 ~ 25 min, 15%a; 25 ~ 40 min, 15%~ 22%a).

 

2.3 Detecção de índice

2.3.1 parâmetros dinâmicos de espermatozóides epididimais

A cavidade abdominal do rato foi dissecada para expor seu epidídimo esquerdo. A cauda epididimal esquerda foi rapidamente cortada e colocada em 2 ml de meio de cultura DMEM sem vermelho fenol pré-aquecido em um banho de água de 37 graus. Foi cortado em pedaços com uma tesoura oftalmológica, agitada levemente e colocada em um banho de água de 37 graus para incubação por 10 minutos para permitir que todos os espermatozóides nadem do epidídimo e preparassem a suspensão espermática. 10 μl de suspensão de espermatozóides foram descartados em um slide de contagem de espermatozóides, e a técnica da CASA foi usada para observar e registrar a densidade espermática, velocidade média do caminho (VAP), velocidade curvilínea (VCL), linearidade (LIN), WOBBLE (WOB), direita (STR) e frequência transversal (BCF).

 

2.3.2 Motilidade de espermatozóides e taxa de deformidade

Pipeta 20 μl de suspensão de esperma recém-preparada em um iodeto de propídio pré-preparado (PI) (diluído 3 000} vezes) e calcein-am (diluído 200 vezes) solução de coloração mista, incubado em um banho de água de 37 graus por 30 min e observar um microscópio de fluorescência de fluorescência. Conte o número total de espermatozóides sobreviventes e espermatozóides de transição em cada 200 espermatozóides em diferentes campos de vista. Esperma ao vivo: A cabeça do esperma, o corpo e a cauda são todos fluorescentes verdes e a atividade do esperma pode ser vista sob o microscópio. Esperma de transição: a cabeça do esperma é fluorescente vermelha e o corpo é obviamente fluorescente verde. Neste momento, o esperma está no período de transição da morte. Esperma morto: Somente a cabeça do esperma é fluorescente vermelha e todo o corpo não tem fluorescência verde.
Pegue 100 μl de suspensão de espermatozóides e coloque -o em banho -maria de 60 graus para inativação por 10 min, depois desenhe 5 μl e solte -o na lâmina, espalhe -o uniformemente e seque -o, conserte -o com metanol, manchá -lo com corante eosina, enxágue com água corrente, deixe -o secar e secar, faça -o transparente com xileno e sedrar e sedrar -se com a água subterrânea e secar e secar. Conte o número de espermatozóides anormais em cada 200 espermatozóides em diferentes campos sob um microscópio e calcule a razão.

 

2.3.3 Coloração patológica de epididimis e testículo

Após a fixação em paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente por 48 h, epididimis e tecidos de testículos foram colocados em caixas de incorporação, desidratadas com etanol graduado, incorporadas em parafina e fatiado. Após o deswax e a hidratação, a coloração dele foi realizada, e mudanças patológicas de testículos e tecidos epididimis foram observados sob um microscópio óptico para determinar o grau de lesões na estrutura de túbulos seminíferos testiculares, lesões no lúmen epididimal e densidade de espermatozóides.

 

2.3.4 Conteúdo sérico t

Após a coleta de sangue orbital, ficou à temperatura ambiente por 2,5 h, centrifugado em 3 000 r · min -1 por 20 min, e o sobrenadante foi levado para detectar o nível de soro t de acordo com as instruções do kit T.

 

2.4 Análise de metabolômica

2.4.1 Preparação de amostra sérica

No dia da amostragem, os ratos foram anestesiados e o sangue total foi coletado através da aorta abdominal. O sangue foi mantido à temperatura ambiente por 2,5 h e centrifugado em 3 000 r · min -1 para 2 0 min. O sobrenadante foi dividido em 2 ml de tubos de centrífuga com números correspondentes e armazenado em -80 grau. Descurado em 4 graus Antes do teste, o vórtice mistura as amostras, transfere com precisão 5 0 μl de amostras de soro para tubos EP 0,5 ml, adicione 300 μl de 20% de acetonitrila-metanol de extrato padrão interno, mixagem de vórtice, então minúsculo a 4 graus {{}}}} Sobrenadante e coloque -o em outro tubo EP limpo de 0,5 ml, deixe -o ficar em -20 grau por 30 min e depois centrífuga a 4 graus, 12 000 r · min -1 por 3 min, tome 180 μl de supernata a injeção.

 

2.4.2 Condições cromatográficas

Aquisição de águas UPLC HSS T3 C18 coluna (2,1 mm × 1 0 0 mm, 1,8 μm). As fases móveis foram 0. 1% de ácido fórmico na água (a) e solução de ácido fórmico-ácido a 0,1% (b), com eluição de gradiente (0-11} min, 5% -90}% b; 11-12} min, 90% b; {14}}}} 11-12}, minim, 90% b; B; 12. 1-14 min, 5% b). A temperatura da coluna foi de 40 graus e a taxa de fluxo foi de 0,40 ml · min -1.

 

2.4.3 Condições de espectrometria de massa

A fonte de íons de electropulverização foi digitalizada em modos de íons positivos e negativos. O gás pulverizador foi de 50 psi (1 psi 16.895 kPa), o gás de aquecimento auxiliar foi de 60 psi, o gás de cortina era de 35 psi e a temperatura da fonte de íons foi de 550 graus. No modo de íons positivo, a tensão de ionização foi 5 500 V, o modo de alta sensibilidade foi adotado, a tensão de deslocamento foi de 60 V e a energia de colisão foi de 30 V. No modo de íons negativo, a tensão de ionização era {} {{10} v, a deslocamento da volta {{11 {} {} {{}}} v, a deslocamento da volta. O modo de varredura de sensibilidade de dados semi-quantitativos foi adotado.

 

2.4.4 Processamento e análise de dados

Os dados brutos da detecção de LC-MS foram convertidos em formato MZML pelo software Proteowizard, e o pacote de software XCMS foi usado para correção de pico de extração, alinhamento e tempo de retenção. A análise de regressão do vetor de suporte (SVR) foi usada para corrigir a área de pico e os picos com taxa ausente superior a 5 0}% foram filtrados. Os picos após a triagem foram integrados à biblioteca pública, o banco de dados construído pela Wuhan Metwell Biotechnology Co., Ltd. e pelo algoritmo MetDNA para identificar as informações estruturais dos metabólitos. Posteriormente, o pacote R foi usado para realizar análises estatísticas univariadas e análise estatística multivariada usando o método de teste t de Student e a análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA), respectivamente. As condições diferenciais de triagem de metabolito foram definidas como importância variável na projeção (VIP)> 1, teste bilateral p <0. e o CPD obtido _ ID foi inserido no site do Metabo Analyst 6.0
(https://www.metaboanalyst.ca/) para análise de enriquecimento. O P do teste hipergeométrico foi usado para identificar as principais vias com enriquecimento significativo.

 

2.5 Análise estatística

𝑥̅ ± s foi expresso como média ± desvio padrão (𝑥̅ ± s) e a análise de variância unidirecional foi usada para comparar dados entre vários grupos. P<0.05 was considered statistically significant.