Efeitos dos glieosídeos de Cistanche na aprendizagem da cognição e na plasticidade sináptica em ratos modelo de privação de sono

RESUMO

Objectivo:'Explorar se oglicosídeos de cistanchepode melhorar oaprendizagem e função cognitiva da privação de sonomodelos de ratos porregulando a plasticidade sináptica. Métodos: Cinquenta ratos Wistar machos foram divididos aleatoriamente em grupo controle branco (Controle), grupo controle plataforma (PC), grupo modelo (Modelo),glicosídeos do grupo cistanche(GCs) e grupo estazolam (Est). O modelo de privação de sono de ratos foi preparado por um método modificado de ambiente aquático multiplataforma. Labirinto aquático de Morris e teste de campo aberto foram usados ​​para detectar ratosfunção cognitiva espacial ae mudanças emocionais. A coloração de Nissl foi usada para observar as alterações namorfologia e quantidade de células nervosasna área CAl do hipocampo de ratos. Western blot e R'T - PCl foram utilizados para detectar os níveis de expressão de sinaptofisina (SYN), substância densa da membrana pós-sináptica 95 (PSD - 95) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Resultados: Os resultados do labirinto aquático de Morris mostraram que, em comparação com o grupo controle, oaprendizagem e capacidade cognitivade ratos no grupo Modelo diminuiu significativamente (P<0. 05 ), and thefunção de aprendizagem e memória de ratosfoi melhorado o tratamento de GCs ( P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Conclusão: Glicosídeos de cistanchepode afetar a plasticidade sináptica, regulando a expressão de marcadores relacionados à sináptica, melhorando assim o aprendizado e a função cognitiva de ratos modelo de privação de sono.

PALAVRAS-CHAVEGlicosídeos de cistanche; Hipocampo; Privação de sono; Aprendizagem e memória; Ansiedade; Plasticidade sináptica

GLICOSÍDEOS DE CISTANCHE DE ALTO NÍVEL PARA VENDA

Distúrbio do sono (SD)é umdistúrbio funcional do sonocausada por uma série de fatores complexos como insônia, sonhos frequentes e despertar fácil. A incidência de MS tem aumentado gradualmente nos últimos anos. Estudos relacionados relataram que SD pode causardoenças cardiovasculares, disfunção metabólica, doenças imunológicase doenças degenerativas do sistema nervoso central, como a doença de Alzheimer [1]. SD pode causar danos oxidativos aos neurônios do hipocampo, causar disfunção cognitiva e produzir alterações de humor, como ansiedade e depressão [2]. Cistanche deserticola é um precioso material medicinal chinês que pode ser usado como remédio e alimento. Tem os efeitos de tonificar os rins e reabastecer o qi, umedecer os intestinos, promover os movimentos intestinais e fortalecer o yang. O extrato principal de Cistanche deserticola, glicosídeos de cistanche (GCs), tem efeitos antioxidantes, antiapoptóticos, protetores do fígado e neuroprotetores [3]. Nossa pesquisa anterior descobriu que os GCs podem melhorar o aprendizado e a função cognitiva de camundongos SAMP8, desempenhando um papel antioxidante e antiapoptótico [4]. Estudos relacionados mostraram que a disfunção cognitiva causada pela SD está intimamente relacionada à plasticidade sináptica [5]. No entanto, existem poucos relatos sobre o mecanismo pelo qual os GCs regulam a plasticidade sináptica e melhoram o comprometimento da aprendizagem e da memória e o declínio cognitivo em ratos induzidos pela privação de sono. Portanto este estudo tem como objetivo explorar se os GCs afetam a plasticidade sináptica regulando a expressão de marcadores relacionados à sináptica melhorando assim a aprendizagem e a função cognitiva de ratos no modelo de privação de sono e fornecendo novas idéias e planos de tratamento para o tratamento da aprendizagem e comprometimento cognitivo causado por distúrbios do sono com GCs.

1 Materiais e Métodos

1. 1 Animais experimentais

Ratos Wistar machos com idade de 6 a 8 semanas, pesando 280 a 300 g, foram adquiridos de Beijing Sibeifu, com licença de produção animal [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Todos os animais foram mantidos no Centro de Experimentação Animal do Baotou Medical College sob as seguintes condições: temperatura (24 ± 1) grau, umidade de 50% a 55%, 12 horas de luz e 12 horas de escuro, e sem restrições de comida e água. Este experimento foi aprovado pelo comitê de ética escolar [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)].

1. 2 Principais reagentes e instrumentos

Os glicosídeos totais de Cistanche deserticola foram adquiridos da Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (número do lote: KSM20220609011); Os comprimidos de Estazolam foram adquiridos ao CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (número de lote: 044220343); tampão de carga de proteína (P1015), tampão de lise RIPA (R0010), solução quimioluminescente (PE0010), etc. foram todos adquiridos de Beijing Solebao; anticorpo de substância de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) (AB192757), anticorpo de sinaptofisina (SYN) (ab32127), adquirido da Abcam, EUA; fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (48503-2), -actina (52901), adquirido da SAB, EUA; anticorpo secundário IgG anti-coelho de cabra (SA00001-20), adquirido da Proteintech, EUA; melatonina de rato (MT), kit ELISA (MM-0657R1), adquirido da Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. Fatiador de parafina (Leica, Alemanha); microscópio óptico (Leica, Alemanha); Labirinto aquático de Morris, caixa de teste de campo aberto (Shanghai Xinruan); instrumento de eletroforese vertical

(Empresa Liuyi de Pequim); agitador de descoloração (Beijing Liuyi Company); sistema de análise de imagens de proteínas (Shanghai Tanon Technology); instrumento de PCR quantitativo de fluorescência (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Métodos experimentais

1. 3. 1 Agrupamento de animais e administração de medicamentos

50 ratos Wistar machos foram divididos aleatoriamente em grupo controle branco (grupo controle), grupo controle plataforma (controle plataforma, grupo PC), grupo modelo (grupo modelo), glicosídeos totais do grupo Cistanche deserticola (grupo GCs , 50 mg/kg) e grupo estazola (grupo Est, 0,54 mg/kg), com 10 ratos em cada grupo. O grupo Controle e o grupo PC receberam solução salina a 0,9% por gavagem. Todos os grupos foram gavados às 7h todos os dias após o início da modelagem, e a gavagem durou 21 dias.

1. 3. 2. Preparação do modelo animal de privação de sono

O modelo de privação de sono foi estabelecido usando o método de ambiente aquático multiplataforma modificado [6]. O equipamento experimental foi um tanque retangular de resina de polietileno com dimensões de 130 cm x 50 cm x 45 cm. Uma pequena plataforma com 5 cm de diâmetro e 20 cm de altura foi colocada na caixa d'água. A plataforma do grupo PC tinha diâmetro de 10 cm e altura de 20 cm. O tanque de água foi enchido com água até uma profundidade de cerca de 18 cm e a temperatura da água foi mantida em (20 ± 1) graus. Uma semana antes do início do experimento, os ratos foram colocados na caixa de privação de sono todos os dias durante 60 minutos para se familiarizarem com o ambiente. Após o estabelecimento do modelo, exceto o grupo Controle, os ratos de cada grupo foram colocados na pequena plataforma no horário das 8h às 20h todos os dias para privação de sono por 21 dias consecutivos. Todos os ratos foram autorizados a comer e beber livremente e a movimentar-se livremente na plataforma, com 12 horas de luz e escuridão alternadas todos os dias.

1.3.3 Experimento do labirinto aquático de Morris

O labirinto aquático de Morris foi dividido em 4 áreas, preenchidas com água, e a plataforma foi colocada no 4º quadrante. A superfície da água estava cerca de 2 cm acima da plataforma. Melanina comestível de qualidade alimentar foi adicionada à água e a temperatura da água foi mantida em (25 ± 1) graus. (1) Experimento de navegação de posicionamento: O centro de cada área foi selecionado e os ratos foram suavemente colocados na água. Eles foram autorizados a explorar livremente. O tempo que os ratos levaram para encontrar a plataforma alvo em 60 segundos foi registrado. Os ratos que não encontraram a plataforma foram guiados até a plataforma e permaneceram por 20 segundos. O treinamento continuou por 5 dias. (2) Teste de exploração espacial: No 6º dia, a plataforma foi retirada e os ratos foram colocados na água a partir do centro do 2º quadrante contra a parede. Foram registrados o número de vezes que os ratos passaram pela plataforma em 120 segundos e o tempo que permaneceram no 4º quadrante.

1.3. 4 Experimento de campo aberto

Foi utilizada uma caixa experimental de 100 cm x 100 cm x 50 cm, e o fundo da caixa foi dividido em 9 grades. Cada grupo de ratos foi colocado previamente na sala experimental de campo aberto para se adaptar ao ambiente interno por 60 min. No início do experimento, os ratos de teste foram colocados nos cantos fixos da caixa experimental de campo aberto, e o número de tempos de pé, distância de movimento e tempo estático dos ratos dentro de 5 min foram registrados usando software de análise comportamental . O ambiente foi obrigado a permanecer silencioso durante o experimento, e o dispositivo experimental foi limpo com água limpa e álcool, respectivamente, entre dois experimentos, para evitar que o cheiro do rato anterior afetasse o julgamento do comportamento do rato seguinte.

1. 3. 5 Ensaio imunoenzimático (ELISA)

Detecção dos níveis séricos de MT em ratos Os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal e 5 mL de sangue foram coletados da aorta abdominal. Após esperar 30 minutos em temperatura ambiente, o sangue foi centrifugado para obtenção do soro. 40 μL de diluente de amostra foram adicionados a cada poço e, em seguida, 10 μL da amostra a ser testada foram adicionados. Após selar com o filme de vedação, incubar a 37 graus por 30 min. Lave 5 vezes, adicione 50 μL de solução de rotulagem enzimática e incube a 37 graus por 30 minutos após selar com o filme de vedação. Lave 5 vezes e, em seguida, adicione a solução reveladora de cor e a solução de interrupção da reação. O valor de DO de cada poço foi medido pelo instrumento de marcação enzimática a um comprimento de onda de 450 nm.

１. ３. ６ Coloração de Nissl

Três ratos foram retirados de cada grupo e o tecido cerebral foi removido por decapitação. O tecido cerebral foi fixado com solução de polimetilmetacrilato a 4%, e o tecido foi desidratado, imerso em solução de cera e embebido, e o tecido foi fatiado por métodos convencionais. As fatias foram mantidas com espessura de 5 μm, enxaguadas com PBS, coradas com 0. 1% de azul de toluidina para 0. 5 h, diferenciado com álcool 95%, desidratado com álcool 100%, transparente com xileno e selado com goma neutra. As alterações na morfologia e no número de neurônios na região CA1 do hipocampo de rato foram observadas ao microscópio e imagens foram coletadas.

１. ３. 7 Experiência de Western Blot

Quatro ratos foram selecionados de cada grupo e o hipocampo foi isolado por decapitação. O tecido do hipocampo foi misturado com tampão de lise RIP A em ambiente de banho de gelo e centrifugado para obter o sobrenadante. A concentração proteica foi detectada pelo método BCA. 20 ug de proteína foram adicionados com tampão de carga de proteína para eletroforese. Após a conclusão da eletroforese de proteínas, a membrana foi transferida a fluxo constante de 300 mA, bloqueada com leite em pó desnatado a 5%, o anticorpo primário foi incubado a 4 graus durante a noite e o anticorpo secundário foi incubado à temperatura ambiente por 2 h. Após a utilização da solução de desenvolvimento de cor, o sistema de análise de imagens por quimioluminescência foi utilizado para análise estatística das bandas proteicas.

1.3.8 Experimento RT-PCR

Três ratos foram selecionados de cada grupo para preparar homogeneizado de tecido do hipocampo. O RNA total no fluido tecidual foi extraído pelo método Trizol e a concentração foi medida. Um kit de síntese de cDNA em jejum foi utilizado para transcrição reversa, e uma reação de amplificação quantitativa de fluorescência foi usada para detectar o nível de expressão relativo do mRNA da proteína relacionada à sináptica usando um kit quantitativo de fluorescência. Os resultados foram analisados ​​usando 2-ΔΔCt, e as sequências de primers são mostradas na Tabela 1.

1.4 Métodos estatísticos

Os resultados dos dados que obedeceram à distribuição normal foram expressos como média ± desvio padrão (x ± s), e a análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism 9.5. A análise de variância de fator único foi usada para comparação entre múltiplas amostras, e P <{3}},05 indicou que a diferença era estatisticamente significativa.