Parte 1 Efeitos de Cistanche Deserticola Phenylethanoside na expressão de proteína -amilóide no hipocampo de camundongos transgênicos APP/PS1

Parte 1 Os ingredientes eficazes de Cistanche: o efeito terapêutico de glicosídeos de álcool fenetílico total e verbascosides na doença de Alzheimer

Para mais informações: Ali.ma@wecistanche.com

JU Bo-wei1 ,YANG Jian-hua2 ,HU Jun-ping3*

1 O Quinto Hospital afiliado da Universidade Médica de Xinjiang, Urumqi 830000, China;

2 O primeiro Hospital afiliado da Universidade Médica de Xinjiang, Urumqi 830054, China;

3 Escola de Farmácia, Universidade Médica de Xinjiang, Urumqi 830011, China

Abstrato:

Para estudar o efeito do feniletanóide Cistanche deserticola na expressão da proteína -amilóide no hipocampo de camundongos com doença de Alzheimer,60 6- camundongos AD transgênicos duplos APP/PS1 com meses de idade foram divididos aleatoriamente em grupos modelo, grupo donepezil ( 0． 65 mg/kg), as dosagens altas, médias e baixas deglicosídeos totaisde Cistanche deserticola (250,125 62． 5 mg/kg) e acteosídeo (125 mg/kg) receberam medicamentos e água destilada por 3 meses． Aos 9 meses de idade, o labirinto aquático de Morris e os testes de esquiva passiva foram usados ​​para determinar as deficiências de aprendizado e memória, as lesões hipocampais de camundongos foram observadas por coloração HE e as expressões de A 1-42 e A {{ 7}} proteínas no hipocampo de camundongos foram testadas pelo método imuno-histoquímico e pelo método Western-blot．Cistanche deserticola feniletanoidepode melhorar significativamente a capacidade de aprendizado e memória e o dano dos neurônios do hipocampo em camundongos transgênicos duplos APP/PS1． Comparado com o grupo modelo, o número de A 1-42, A 1-40 células positivas no hipocampo CA1 doCistanche deserticolagrupo e o grupo controle diminuiu significativamente, e os resultados do Western-blot mostraram que a expressão da proteína A 1-42, A 1-40 no hipocampo de Cistanche deserticola em cada grupo de dose e no grupo de intervenção foi significativamente menor do que no grupo modelo． O glicosídeo de Cistanche deserticola pode proteger os neurônios e antagonizar a DA ao regular negativamente a expressão da proteína A 1-42, A 1-40 no cérebro do hipocampo de camundongos． Neste estudo, o feniletanoide foi identificado como a principal substância efetiva paraCistanche deserticolapara exercer sua atividade anti-AD que fornece suporte teórico para seu desenvolvimento como uma nova droga contra AD．

Palavras-chave:Cistanche deserticola; feniletanoide;Doença de Alzheimer; camundongos transgênicos duplos APP/PS1; -proteína amilóide

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doença de Alzheimeré uma doença degenerativa do sistema nervoso central caracterizada por perda progressiva de memória e disfunção cognitiva. Atualmente, a bem reconhecida hipótese da cascata da proteína -amilóide (A ) acredita que os metabólitos normais A 1-42 e A 1-40 monômeros em condições fisiológicas não são neurotóxicos, mas quando encontram mediadores exógenos de APP, eles causar anormalidades. Após a deposição, o A 1-42 acumulado forma oligômeros A solúveis (ADDLs), que impedem que os monômeros produzam atividade protetora e causem degeneração neuronal, perda de sinapses e danos nos axônios e, finalmente, causam apoptose neuronal no cérebro para causar demência , portanto, investigar a expressão de seus alvos-chave A 1-42 e A 1-40 proteína no cérebro é de grande importância para a pesquisa sobre a prevenção e tratamento deGlicosídeos feniletanoides Cistancheem anúncio. Ao mesmo tempo, estudar o exame histopatológico do hipocampo das lesões características no cérebro de modelos animais de DA pode refletir verdadeiramente a melhora das drogas sobre as lesões no cérebro do ponto de vista macroscópico.

A medicina tradicional chinesa no meu país acredita queCistanche, uma medicina tradicional chinesa que nutre o rim e nutre a essência, tem efeitos antienvelhecimento, antienvelhecimento e melhora a memória. Um grande número de estudos preliminares confirmou que o totalglicosídeos feniletanoides de Cistanche e Acteoside, o monômero representativo de glicosídeos de álcool fenetílico, exibem efeitos antagônicos óbvios sobre AD nos modelos in vivo ou in vitro de AD construídos por métodos tradicionais e têm certa prevenção e tratamento da neurodegeneração. O potencial das doenças sexuais. No entanto, a aplicação do modelo transgênico duplo APP/PS1 de Cistanche Acteoside não tem sido utilizada para realizar pesquisas sobre prevenção e tratamento da DA sob a perspectiva do -amilóide.

Em resumo, este estudo é baseado na hipótese clássica da patogênese da DA—Uma hipótese de reação em cascata, com a ajuda de um modelo animal de DA ideal e confiável, camundongos transgênicos duplos APP/PS1 como plataforma de pesquisa in vivo, usando labirinto aquático de Morris e HE método de coloração, Western-blot, imuno-histoquímica, e outros métodos técnicos avançados, sob as perspectivas do comportamento animal, histopatologia e biologia molecular A fim de encontrar novos alvos para a prevenção e tratamento da DA, ele fornecerá uma referência para o estudo de o mecanismo de ação específico dos glicosídeos feniletanoides Cistanche na prevenção e tratamento da DA.

1. Reagentes e instrumentos

1.1 Reagente

Glicosídeos feniletanoides Cistanche tubulosa(feito pelo próprio grupo de pesquisa, o conteúdo de glicosídeos feniletanoides é de 87,6 por cento);Acteosídeo; dióxido de titânio; kit de coloração HE; goma neutra; kit de preparação de gel SDS-PAGE; kit de quantificação de proteína BCA; Um 1-40; Um 1-42; -actina; IgG anti-cabra de coelho marcada com fosfase alcalina (H mais L); 4 × tampão de carregamento de proteína Contém -mercaptoetanol; 10 × TBST; membrana PVDF; SDS; Tris; glicina; leite em pó desnatado; Kit BCIP/NBT; anticorpo secundário; Entre 20.

1.2 Animais

60 6-camundongos modelo AD transgênico duplo APP/PS1 com meses de idade

E 10 camundongos de ninhada negativa, machos e fêmeas, peso corporal 20 ± 10 g, os animais comem e bebem livremente durante o experimento.

1.3 Aparelho

MT-100 Labirinto aquático de Morris; gerador de imagens em gel; doença RM2016

Micrótomo; máquina de gelo SIM-F124; electroforese em gel e equipamento de membrana de transferência; leitor de microplacas de comprimento de onda completo; incubadora de temperatura constante de CO2; refrigerador de 4 graus e -20 graus; 67120 instrumento de água ultrapura

; Balança eletrônica TP-114; centrífuga de alta velocidade refrigerada de baixa temperatura; DVKW-D-2 display digital aquecimento elétrico banho-maria com temperatura constante; disruptor celular ultrassônico; WD-9405Um agitador descolorante; tensão constante ajustável e fonte de alimentação de corrente constante; Microscópio invertido fluorescente DM4000.

2. Método

2.1 Agrupamento e administração de animais

De acordo com SPSS18. 0 Números aleatórios gerados por software estatístico, 1156 Natural Products Research, and Development Vol. Camundongos modelo 31AD foram divididos aleatoriamente em grupo modelo e grupo donepezil (infusão diária)

A dose gástrica é 0. 65 mg/kg), glicosídeos totais de álcool fenetílico Cistanche (PhGs) grupos de dose alta, média e baixa (doses diárias de gavagem são 250, 125, 62,5 mg/kg, respectivamente), grupo de intervenção Cistanche verbascoside (125 mg/kg) kg ), 10 por grupo. Aos 6 meses de idade, os camundongos receberam tratamento de gavagem intragástrica de acordo com os grupos, e os camundongos foram administrados por via intragástrica uma vez ao dia durante 3 meses consecutivos. O grupo normal consistiu de camundongos não transgênicos na mesma ninhada. O grupo modelo e o grupo normal receberam um volume igual de água destilada por gavagem.

2.2 Experiência do labirinto aquático de Morris

O labirinto aquático clássico de Morris foi usado para testar a aprendizagem espacial e as habilidades de memória dos camundongos. No primeiro e segundo dias, treine os camundongos para se familiarizar com a posição da plataforma e pratique a localização da plataforma. Do 3º ao 5º dia, será realizado o teste formal para observar a situação dos camundongos em cada grupo procurando a plataforma após o treinamento. No 6º dia, a plataforma será removida e os camundongos serão observados.

Pista de natação. Durante o experimento, a câmera registrará simultaneamente o tempo gasto pelo mouse procurando a plataforma (ou seja, latência de fuga) e a distância da pista de natação. Se o mouse não encontrar uma plataforma dentro do intervalo de tempo definido (geralmente definido para 60 s ou 120 s, este experimento usa 60 s), a latência de escape do mouse é registrada como o valor definido e a equipe permanecerá ligada a plataforma por alguns segundos (10 s é usado neste experimento) para ajudar a aprofundar a memória da plataforma. Após o experimento, registre o tempo de natação dos camundongos desde a entrada na água até encontrar a plataforma. No último dia do experimento, a plataforma foi removida, e o conteúdo a ser gravado durante o tempo definido incluiu principalmente o número de vezes que o mouse cruzou a plataforma, o tempo de permanência do quadrante alvo, etc., e a estratégia de busca de cada animal experimental foram analisados.

2.3 Extração de tecido cerebral e inclusão em parafina

Após a administração, os camundongos foram pesados ​​e anestesiados com hidrato de cloral a 10%. Coloque o mouse anestesiado na mesa de operação para fixar os membros. Após perfusão e fixação de paraformaldeído a 4 por cento, os animais foram sacrificados, o cerebelo e outro tecido cerebral extra foram removidos e todo o cerebelo e o cérebro foram removidos ao longo da extremidade do hemisfério cerebral.

A metade frontal da coroa central. Fixe em paraformaldeído 4% por 24 horas, lave com água ultrapura por 10 minutos e, em seguida, coloque 30% de etanol (1 h) → 40% de etanol (1 h) → 50% de etanol (1 h) → 75% de etanol (1 h)) → 90 por cento de etanol (1 h) → 95 por cento de etanol (1 h) → etanol anidro I (1 h) → etanol anidro II (1 h) → xileno I (15 min) → xileno II (15 min). Após serem imersos em parafina por 2 horas, os tecidos foram incorporados em cortes coronais contínuos na área CA1 do hipocampo do cérebro do camundongo. Depois de secar em um forno a 60 graus por 48 h, armazene em temperatura ambiente.

2.4 coloração HE

Asse as fatias selecionadas em cada grupo em forno a 60 graus por 40 minutos e, em seguida, coloque-as em xileno I (5 min) → xileno II (10 min) → etanol absoluto (5 s) → 95 por cento etanol I (5 s) → 95 por cento de etanol II (5 s) → 80 por cento de etanol (5 s) → água destilada

Segundo, use o kit de coloração HE para manchar e montar as lâminas com goma neutra.

2.5 Coloração imuno-histoquímica

As seções preparadas foram submetidas a coloração imuno-histoquímica de acordo com as etapas padrão de desparafinação, recuperação de antígeno, bloqueio de catalase endógena, bloqueio de soro, incubação de anticorpo primário, incubação de anticorpo secundário, desenvolvimento de cor DAB, desidratação e montagem. Escolha 6 fatias adequadas para cada grupo, observe a finura do neurônio sob o microscópio eletrônico

Morfologia celular, coloração e contagem do número de células positivas do hipocampo usando o software Image J.

2.6 Análise de Western blot da expressão de proteínas

Aspirar o sobrenadante do tecido para determinar o teor de proteína extraída do hipocampo do tecido cerebral de acordo com o método de quantificação de proteína BCA. Misture com tampão de carregamento de proteína 4x na proporção de 4:1, aqueça a 95 graus por 10 min, resfrie naturalmente e armazene na geladeira a -20 graus . Prepare o gel SDS-PAGE, adicione a solução de eletroforese e, em seguida, adicione o grupo normal, o grupo de intervenção medicamentosa e outras histonas em sequência e adicione o marcador de proteína nos orifícios do gel em ambos os lados. Pare a eletroforese no banho de gelo até o fundo do gel de separação. Após o equilíbrio do líquido da membrana de transferência, corte a membrana de PVDF e o papel de filtro de acordo com o tamanho da cola. Na pinça de transferência, siga os passos da esteira de fibra preta → 3 camadas de papel filtro → gel → membrana PVDF → 3 camadas de papel filtro → esteira de fibra preta para montar. Após a remoção das bolhas, transfira a membrana a uma pressão constante de 80 V. Após a transferência do filme, o leite desnatado é selado por 2 h. O anticorpo diluído é adicionado à membrana correspondente e incubado à noite. Após incubar o anticorpo secundário por 2 h, adicione solução de revelação de cor BCIP/NBT até que a cor se desenvolva. O gerador de imagens em gel BIO-RAD tira fotos. Use o software Image J para analisar quantitativamente a banda de proteína alvo e use IOD para indicar a força relativa da banda de proteína. O resultado é expresso como a razão entre o valor da densidade óptica integrada da proteína alvo e a proteína de controle -actina. O resultado é expresso como (ID da proteína alvo/ID de referência interna) × 100 por cento.

2.7 Análise estatística de dados

Use SPSS18. 0 Realize análises estatísticas dos dados. Os dados são representados por (x± s ). A comparação de dados entre os grupos utiliza o teste e análise One-Way ANOVA, e as comparações múltiplas entre os dados utilizam o teste LSD-t (menor diferença significativa, LSD). ), com P<0. 05="" or="" p=""><0. 01="" means="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

3 Resultados experimentais

3.1 Resultados da detecção do labirinto aquático de Morris

À medida que o tempo de treinamento continua a aumentar, o tempo para cada grupo de camundongos alcançar a plataforma (latência de escape) é significativamente reduzido. O primeiro e segundo dias são o tempo de treinamento. No terceiro dia, a latência de escape do grupo modelo foi significativamente maior do que a do grupo controle normal (P<0.01); the="" fourth="" and="" fifth="" days="" were="" compared="" with="" the="" normal="" control.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" escape="" latency="" of="" the="" mice="" in="" the="" donepezil="" group="" was="" significantly="" shorter="" than="" that="" of="" the="" model="" group="" (p=""><0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" glycosides="" of="">cistacheálcool fenetílico Em cada grupo de dose eActeosídeosgrupo, à medida que a dose aumentou, a latência de escape dos camundongos foi significativamente encurtada, com diferenças significativas (P<0.05) (see="" table="">

No 6º dia do experimento do labirinto aquático, a plataforma foi removida para um experimento de exploração espacial, e o número de vezes que cada grupo de camundongos cruzou a posição da plataforma em 60 s foi registrado. Pode-se observar pelos resultados que o número de vezes de travessia da plataforma no grupo modelo dentro do tempo definido foi significativamente reduzido em comparação com o grupo normal (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" total="" glucoside="" groups="" and="" mullein="" the="" number="" of="" times="" of="" crossing="" the="" platform="" in="" the="" glycoside="" group="" was="" significantly="" increased="" (p=""><0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 2).="" the="" above="" research="" results="" all="" suggest="" that="">Glicosídeos feniletanoides Cistanchepode melhorar significativamente a capacidade de aprendizagem e memória de camundongos AD transgênicos duplos APP/PS1, e tem uma certa dependência da dose.

3.2 Resultados de observação de coloração de tecido patológico

Os resultados mostram que os neurônios na área CA1 do hipocampo no grupo normal estão dispostos de forma ordenada e firme, distribuídos de forma mais uniforme, com camadas claras, e o núcleo celular do corpo vertebral é maior e a forma é aproximadamente redonda. No entanto, a área CA1 do hipocampo dos camundongos do grupo modelo foi danificada, resultando em mudanças óbvias nas células neuronais e na morfologia, o arranjo era solto e caótico, não havia hierarquia óbvia, as conexões entre as células estavam soltas e alguns núcleos apareceu picnose e apoptose, tornando a coloração mais profunda. As células CA1 hipocampais das diferentes doses deCistanche fenetanolosídeogrupo de intervenção, grupo donepezil e grupo de intervenção verbascoside todos melhoraram em graus variados. As células neuronais picnóticas e profundamente coradas foram significativamente reduzidas em comparação com o grupo modelo, mas as maiores ainda podem ser vistas no espaço intercelular (ver Figura 1).

3.3 Resultados do experimento de imuno-histoquímica

Após tratamento com glicosídeos de álcool fenetílico Cistanche, uma seção de tecido cerebral de camundongo transgênico duplo APP/PS1 de nove meses de idade foi retirada e a área CA1 do hipocampo foi submetida a coloração imuno-histoquímica A 1-40. Os resultados mostraram que as células positivas eram em sua maioria circulares no campo visual. A maioria das membranas celulares são amarelo-acastanhadas. Comparado com o grupo normal, o número de células A 1-40 positivas na área CA1 do hipocampo do grupo modelo aumentou significativamente (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" phenethyl="" alcohol="" glycosides="" of="">Cistanche tubulosafoi alto. O número de células positivas no grupo de dose média e no grupo glicosídeo Acteoside foi significativamente reduzido (P<0.01), the="" donepezil="" group,="" and="" the="">Glicosídeos feniletanoides CistancheDose baixa.

O número de células A 1-40 positivas no grupo de dose foi significativamente reduzido (P<0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 3,="" figure="">

Após a intervenção dos glicosídeos feniletanoides Cistanche, os tecidos cerebrais de camundongos transgênicos duplos APP/PS1 de 9-meses de idade foram retirados e a área CA1 do hipocampo foi corada com coloração imuno-histoquímica A 1-42. Os resultados mostraram: Comparado com o grupo modelo,Glicosídeos feniletanoides CistancheO número de células positivas em cada grupo de dose de glicosídeos e grupo glicosídeo Acteoside foi reduzido significativamente, com uma diferença significativa (P<>

3.4 Resultados do teste Western-blot

O método Western-blot foi usado para detectar a expressão das proteínas A 1-40 e A 1-42 no hipocampo de camundongos. Os resultados mostraram que a expressão proteica de A 1-40 e A 1-42 no hipocampo do grupo modelo foi significativamente aumentada em comparação com o grupo normal, e houve uma diferença significativa (P < {{="" 6}}.="" 05).="" as="" expressões="" proteicas="" do="" hipocampo="" a="" 1-40="" e="" a="" 1-42="" em="" camundongos="" do="" grupo="" de="" intervenção="">Glicosídeo feniletanoide Cistancheeverbascosidegrupo de intervenção foram significativamente regulados negativamente em comparação com camundongos no grupo modelo (P<0.01), and="" there="" was="" a="" significant="" difference="" (p=""><0.01). 01),="" see="" figure="">