Ingredientes Eficazes de Cistanche: Método de Separação e Purificação de Glicosídeos Feniletanoides

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Isolamento e Purificação de Glicosídeos Feniletanoides de Cistanche Deserticola por Cromatografia em Contracorrente de Alta Velocidade

Li a,b, Rong Tsao b,*, Raymond Yang b, Chunming Liu a,

J. Christopher Young b, Honghui Zhu b

a Departamento de Química, Changchun Normal University, Changchun 130032, China

b Guelph Food Research Centre, Agricultura e Agroalimentar Canadá, 93 Stone Road West, Guelph, Ontário, Canadá N1G 5C9

Recebido em 31 de maio de 2007; recebido em forma revisada em 16 de outubro de 2007; aceito em 29 de outubro de 2007

Abstrato:

Cincoglicosídeos feniletanoides(PhGs),echinacoside, cistanosídeo A, acteosideo, isoacteosideo e 20-acetilacteosideo, foram isolados e purificados a partir deCistanche deserticolapela primeira vez por cromatografia em contracorrente de alta velocidade (HSCCC) usando dois sistemas bifásicos, um consistindo de acetato de etila-etanol-água (5:0.5:4,5, v/v/v) e outro de acetato de etila–n-butanol–etanol-água ({{10}}.5:0.5:0.1:1, v/v/v/v). Um total de 28,5 mg de echinacoside, 18,4 mg decistanosídeo A, 14,6 mg deacteósido, 30,1 mg de isoacteoside e 25,2 mg de 20-acetilacteoside foram purificados a partir de 1412 mg do extrato de n-butanol deCistanche deserticola, cada um com mais de 92,5 por cento de pureza conforme determinado por HPLC. As estruturas foram identificadas por seu tempo de retenção, UV, LC-ESI-MS no modo de íons negativos e confirmadas por experimentos de RMN. O padrão de fragmentação LC-ESI-MSn característico dos cinco compostos é discutido e considerado uma ferramenta muito específica e útil para a identificação estrutural de PhGs desta importante planta medicinal.

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Palavras-chave:Cistanche deserticola; Feniletanoide;Echinacoside; Cistanosídeo A;Acteosídeo; isoacteoside; 20-Acetillacteosídeo; HSCCC; LC–ESI-MS; RMN

1. Introdução

Cistanche deserticolaYC Ma é um fitoterápico chinês bem conhecido e tem sido amplamente utilizado em preparações tradicionais semelhantes aos ingredientes alimentares funcionais ou suplementos alimentares de hoje (Wong, Li, Cheng e Chen, 2006). Os principais constituintes bioativos em C. deserticola sãofeniletanoideglicosídeos (PhGs), incluindoechinacoside, acteoside, isoacteoside, 20-acetilacteoside ecistanosídeo A(Kobayashi, Karasawa, & Miyase, 1984; Kobayashi et ai., 1987). Os PhGs são amplamente distribuídos no reino vegetal e têm sido amplamente estudados por suas várias funções biológicas, como hepatoprotetora (Xiong et al., 1998), atividade anti-inflamatória, antinociceptiva (Schapoval et al., 1998) e atividade antioxidante (Cheng , Wei, Guo, Ni e Liu, 2005; He, Lau, Xu, Li e But, 2000; Li, Wang e Wang, 1997; Li, Wang, Zheng, Liu e Jia, 1993; Wang, Jiang , Wu, & Wang, 2001; Xiong, Kadota, Tani, & Namba, 1996), melhora da função sexual (Xie & Wu, 1993; Zong, He, Wu, & Chen, 1996) e efeito sedativo (Lu, 1998) .

Devido às bioatividades significativas acima, grandes quantidades de compostos puros são urgentemente necessárias como padrões de referência e para vários estudos in vitro e in vivo relacionados ao uso de medicamentos tradicionais chineses. Métodos eficazes para o isolamento, purificação e caracterização estrutural de PhGs, portanto, tornam-se necessários. No entanto, esse trabalho geralmente requer o uso de várias etapas cromatográficas para limpeza e isolamento da amostra (Gross, Lahloub, Anklin, Schulten, & Sticher, 1988; Nishimura, Sasaki, Inagaki, Chin & Mitsuhashi, 1991; Ravn, Nishibe , Sasahara, & Li, 1990; Shoyama, Matsumoto, & Nishioka, 1987), o que geralmente resulta em baixas taxas de recuperação devido a adsorções irreversíveis de PhGs no suporte sólido durante a separação (Lei et al., 2001). Em contraste, a cromatografia em contracorrente de alta velocidade (HSCCC) tornou-se uma alternativa eficaz às técnicas cromatográficas convencionais para a separação de alguns PhGs de extratos vegetais (Lei et al., 2001; Li et al., 2005). Lei et ai. separados com sucessoacteósidoe 20-acetilacteoside de Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck usando HSCCC (Lei et al., 2001). Os autores deste artigo relataram anteriormente a separação deacteósidoe isoacteoside de Plantago psyllium L. por HSCCC (Li et al., 2005). No entanto, nenhum relatório foi publicado sobre a separação e purificação de múltiplos PhGs deCistanche deserticolausando HSCCC. Devido à falta de padrões, métodos LC-MS foram desenvolvidos e usados ​​como uma poderosa ferramenta analítica para caracterização e identificação rápida de alguns PhGs em extratos de plantas (Li et al., 2005; Wang et al., 2000).

Neste artigo, relatamos um método HSCCC desenvolvido para a preparação de echinacoside,cistanosídeo A, acteoside, isoacteoside e 20-acetilacteoside deCistanche deserticola. A caracterização e análise dos cinco PhGs separados foram realizadas pelo uso de LC acoplado com espectrometria de massa ESI em linha e experimentos de RMN. O tempo de retenção, peso molecular e os íons de fragmentos característicos dos cinco PhGs são apresentados e discutidos neste artigo. As estruturas dos cinco PhGs identificados nesta investigação são mostradas na Fig. 1.

echinacosideem cistache

2. Experimental

2.1. Produtos químicos e reagentes

Acteosídeofoi adquirido da Sigma–Aldrich (Oak-Ville, ON), echinacoside foi adquirido da ChromaDex (Santa Ana, CA). Isoacteoside foi isolado de P. psyllium L. (Li et al., 2005).Cistanche deserticolafoi adquirido da Loja Medicinal TongRenTang de Pequim (China). Todos os solventes eram de grau HPLC e adquiridos a Caledon Laboratories Ltd. (Georgetown, ON).

2.2. Preparação de amostra

Cistanche deserticola(20 g) foi extraído cinco vezes à temperatura ambiente durante 12 h cada com 100 mL de etanol aquoso a 80 por cento. A cada vez a mistura de extração foi filtrada através de um papel filtro Whatman No.1 (Whatman International Ltd., Maidstone, Inglaterra). O filtrado combinado foi concentrado para 100 mL in vacuo a < 40="" graus.="" a="" solução="" aquosa="" resultante="" foi="" desengordurada="" duas="" vezes,="" cada="" uma="" com="" 100="" ml="" de="" hexano,="" e="" então="" extraída="" sucessivamente="" por="" cinco="" vezes,="" cada="" uma="" com="" 100="" ml="" de="" n-butanol.="" as="" camadas="" de="" n-butanol="" foram="" combinadas="" e="" concentradas="" até="" à="" secura="" em="" vácuo="" a=""><40 graus,="" o="" que="" rendeu="" 2,2="" g="" de="" extracto="" de="" n-butanol.="" o="" extrato="" foi="" armazenado="" a="" -20="" grau="" antes="" da="" separação="" do="">

2.3. Procedimento de separação HSCCC

O HSCCC preparativo foi realizado em uma cromatografia em contracorrente de alta velocidade Modelo CCC{{0}} (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland, EUA). Este aparelho possuía três bobinas preparativas, conectadas em série (volume total, 325 mL). A velocidade de rotação do aparelho pode ser regulada entre 0 e 2000 rpm. O sistema HSCCC foi equipado com uma bomba HPLC (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland, EUA), um detector UV Modelo 450 (Alltech, EUA), um gravador de leito plano Modelo L 120 E (Linseis Inc., Princeton Jct, EUA), um coletor de frações (Advantec MFS Inc., EUA) e uma válvula de injeção de amostra com um loop de amostra 10-mL.

Uma mistura de acetato de etila-etanol-água (5:0.5:4,5, v/v/v) foi agitada vigorosamente em um funil de separação e deixada em repouso e separada à temperatura ambiente. As duas fases foram utilizadas no HSCCC após atingirem o equilíbrio. Toda a coluna enrolada foi primeiro preenchida com a camada superior, que serve como fase estacionária. A camada inferior (fase móvel) foi então bombeada para a extremidade da coluna a uma taxa de fluxo de 1,5 mL/min. A velocidade de rotação foi definida em 1050 rpm. Uma amostra (ca. 230 mg de cada vez) dissolvida em 8 ml da mistura de acetato de etila-etanol-água (5:0,5:4,5, v/v/v) foi carregada na válvula de injeção após o sistema atingir hidrodinâmica equilíbrio. Este sistema de solvente bifásico foi selecionado com base no coeficiente de partição (K), que foi 0,87, 1,11 e 1,32 paraacteósido, isoacteoside e 20 acetilacteoside, respectivamente. O valor K foi a razão das concentrações nas camadas superior e inferior do mesmo composto conforme determinado por HPLC (Fig. 2). O efluente da saída da coluna foi monitorado continuamente por um detector de UV a 254 nm e coletado em tubos de ensaio com um coletor de frações ajustado em 4 min para cada tubo.

2.4. Condições de LC

auto-amostrador estático e um detector de arranjo de fotodiodos (DAD) foram usados ​​para a análise de PhGs no extrato de n-butanol deCistanche deserticolae frações coletadas da separação de HSCCC. A separação foi realizada em uma coluna Phenomenex ODS-C18 (250 × 4,6 mm, 5 lm) com uma coluna de guarda C18. A fase móvel binária consistia em acetonitrila (solvente A) e água contendo 2% de ácido acético (solvente B). Todos os solventes foram filtrados em

{{0}}.45 lm antes de usar. A taxa de fluxo foi mantida constante em 1.0 mL/min para um tempo total de execução de 25 min. O sistema foi executado com um programa de gradiente: 0–20 min: 90% B a 60% B; 20–22 min: 60% B a 0% B; e 22–25 min, 0 por cento B a 90 por cento B. O volume de injeção da amostra foi de 10 l. Os picos de interesse foram monitorados a 320 nm por um detector DAD.

2.5. Experimentos LC-ESI-MS

Os experimentos de LC-MS foram realizados usando um espectrômetro de massa de armadilha de íons Finnigan LCQ DECA (Thermo Finnigan, San Jose, CA, EUA) equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI). As amostras foram analisadas na mesma condição cromatográfica. Um modelo negativo foi usado para a coleta de dados. As taxas de fluxo de gás de revestimento e auxiliar foram fixadas em 96 e 7 (unidade arbitrária), respectivamente. A voltagem capilar foi ajustada em 29 V e sua temperatura foi controlada em 350 graus. A voltagem da lente de entrada foi fixada em 40 V e a amplitude de RF multipolar foi ajustada em 540 V. A voltagem da agulha ESI foi controlada em 4,5 kV. O deslocamento da lente do tubo foi de 16 V, o deslocamento da lente multipolo 1 foi de 8,20 V e o deslocamento da lente multipolo 2 foi de 10,5 V. A voltagem do multiplicador de elétrons foi ajustada em 980 V para detecção de íons.

2.6. RMN para Identificação

Os espectros de RMN foram registrados em um espectrômetro Bruker Avance-600 (Bruker BioSpin Ltd., Milton, Canadá). Apenas os compostos 2 e 5 (nenhum padrão disponível) foram submetidos a experimentos de RMN. As amostras foram dissolvidas em CD3OD.

3 Resultados e discussão

3.1. Separação HSCCC

O extrato de n-butanol deCistanche deserticolae as frações correspondentes a cada pico isolado por HSCCC foram analisadas por HPLC, e os resultados são apresentados na Fig. 2. Cinco compostos principais (picos 1-5) foram separados e detectados com tempos de retenção de 9,2 min, 10,7 min, 12,3 min ,

13,3 min e 16,2 min, respectivamente.

Uma separação HSCCC bem sucedida depende em grande parte de um sistema solvente de duas fases adequado que forneça um coeficiente de partição ideal (K) em torno de 1 para o composto desejado. Tal sistema bifásico também deve produzir um tempo de acomodação razoavelmente curto (Chen, Games, & Jones, 2003; Foucault & Chevolot, 1998; Oka, Oka, & Ito, 1991). Em nosso experimento, selecionamos quatro séries de sistemas de solventes de acordo com a solubilidade dos compostos alvo emCistanche deserticola. HPLC foi usado para medir a concentração em cada fase, a partir da qual os valores de K dos compostos alvo foram calculados. Dois sistemas, acetato de etila–n-butanol–etanol-água (4:0.6:0.6:5, v/v/v/v) e acetato de etila–água (1: 1, v/v), foram usados ​​anteriormente no HSCCC para separaracteósidoe 20-acetilacteoside de C. salsa,acteósido, e isoacteoside de P. Psyllium, respectivamente (Lei et al., 2001; Li et al., 2005). Embora o primeiro sistema tenha tido um tempo de sedimentação relativamente curto, ele teve um desempenho ruim na separação dos PhGs deCistanche deserticola, devido aos baixos valores de K para os compostos 1 e 2, e altos valores de K para os compostos 3-5. Os valores de K foram muito baixos para os compostos 1-4 no segundo sistema, mas muito altos para o composto 5 (Tabela 1). Um sistema modificado contendo acetato de etila-etanol-água (5:{{10}}.5:4,5, v/v/v), deu um valor K ideal para os compostos 3-5 em 0,87, 1,11, e 1,32, respectivamente, e resultou na boa separação desses três compostos (Fig. 3A e B). Esse sistema, no entanto, produziu

um valor K muito pequeno para os compostos 1 e 2, fazendo com que os dois compostos co-eluam perto da frente do solvente (fração 1 na Fig. 3A). Uma modificação adicional no sistema (acetato de etila–n-butanol–etanol-água (0.5:0.5:0.1:1, v/v/v/ v) elevou os valores de K para o composto 1 e 2 para 0.52 e 0.92, respectivamente, e levou à separação completa (Fig. 3C). A Fig. 3A mostra a separação HSCCC de um amostra contendo 230 mg do extrato de n-butanol deCistanche deserticolausando acetato de etil-etanol-água (5:0.5:4,5, v/v/v). As frações que foram confirmadas por HPLC para conter apenas os compostos 3, 4 ou 5 foram combinadas separadamente, e aquelas contendo os compostos 3 e 4 foram reunidas, liofilizadas e ressubmetidas ao HSCCC para posterior separação (Fig. 3B). A separação HSCCC em duas etapas descrita acima rendeu um total de 14,6 mg, 30,1 mg e 25,2 mg de compostos 3-5 de 1412 mg de extrato de n-butanol. A Fig. 3C mostra a separação HSCCC de uma amostra contendo os compostos 1 e 2 (fração 1 na primeira separação) usando acetato de etila-n-butanol-etanol-água (0.5:0.5 :0,1:1, v/v/v/v). Obteve-se um total de 28,5 e 18,4 mg dos compostos 1 e 2. As purezas cromatográficas dos compostos liofilizados 1–5 foram superiores a 92,5 por cento, que foram usados ​​diretamente para análises LC-ESI-MS e NMR.

3.2. Identificação estrutural por LC-ESI-MS e NMR

A identificação provisória dos compostos 1, 3 e 4 foi alcançada por tempos de retenção congruentes e dados espectrais de UV com os do echinacoside autêntico,acteósido, e isoacteoside (Fig. 2). Os compostos 2 e 5 eram desconhecidos, no entanto, os espectros UV de todos os cinco compostos eram muito semelhantes, indicando características estruturais semelhantes.

Para investigar ainda mais as estruturas desses cinco compostos, experimentos LC-ESI-MSn foram tentados e os resultados são mostrados na Fig. 4 e Tabela 2. Os compostos relacionados aos picos (1-5) na Fig. 2 exibiram íons moleculares desprotonados intensos [MH]— em m/z 785, 799, 623, 623 e 665, respectivamente, no modo negativo. Íons diméricos [2M H]- também foram observados para os picos 1-4 na Fig. 2. Estes confirmaram os pesos moleculares dos picos 1-5 como 786, 800, 624, 624 e 666, respectivamente. Os dados LC-MSN (Tabela 2) forneceram informações estruturais altamente úteis para os cinco PhGs, como a perda neutra de

a Procedimento experimental: aproximadamente 1 mg de cada amostra foi pesado em um tubo de ensaio de 10 mL no qual foi adicionado 1 mL de cada fase do sistema solvente bifásico pré-equilibrado. O tubo de ensaio foi tampado e agitado vigorosamente por 1 min, e deixado em repouso até que se separasse completamente. Uma alíquota de 100 lL de cada camada foi retirada e evaporada separadamente até a secura in vacuo a<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

a fração cafeoíla (162), a fração glicose (162), a fração ramnose (146), um radical CH2 (14) e o grupo COCH2 (42).

O LC-ESI-MS do pico 1 é mostrado na Fig. 4A. O íon molecular desprotonado [MH]— em m/z 785 com uma alta abundância e um íon molecular desprotonado dimérico

íon [2M H]— em m/z 1571 foi observado no modo negativo, sugestivo de um peso molecular de 786, que era o mesmo do echinacoside. Investigações adicionais no experimento LC-MS2 dos íons m/z 785 renderam um íon filho principal em m/z 623 (Fig. 4B) produzido diretamente de m/z 785 pela perda de uma fração cafeoil ou uma fração hexose como [M 162 H]—. O espectro LC-MS3 de m/z 623 exibiu dois íons principais em m/z 477 e 461, e dois íons menores em m/z 315 e 179 (Fig. 3C, Tabela 2). As diferenças de massa entre m/z 623 e os íons fragmentos m/z 477 e 461 foram 146 e 162, respectivamente, correspondendo à perda de uma unidade de ramnose e uma porção de glicose ou uma porção cafe-feel [M 162 H]—. Os íons m/z 623 também perderam uma porção cafeoil e uma porção ramnose para produzir os íons m/z 315. O íon em m/z 179 foi produzido a partir da clivagem da porção cafeoíla, com a carga negativa permanecendo por parte da porção cafeoíla. O experimento LC-ESI-MSN no echinacoside autêntico mostrou o mesmo padrão de fragmentação. O pico 1 foi, portanto, confirmado como echinacoside.

Para o pico 2, o LC-ESI-MS mostrou m/z 799 como o íon molecular desprotonado [MH]— e m/z 1599 como seu íon dimérico, sugerindo uma massa molecular de 800. Durante os experimentos MS2, o m/z 799 íons formaram três filhas

íons em m/z 637, 623 e 475 (Tabela 1). O íon em m/z 637 foi produzido diretamente a partir do íon parental de m/z 799 novamente devido à perda neutra do cafeoil [M—162—H]— ou uma porção de glicose [M—162—H]—. O íon em m/z 623 resultou da perda de um radical CH2. O íon em m/z 475 foi formado a partir da perda neutra tanto da porção cafeoíla [M 162 H] - quanto da porção glicose do íon parental. O experimento MS3 em m/z 637 produziu três íons em m/z 619, 491 e 475, correspondendo às perdas de uma água, uma unidade de ramnose e uma porção de glicose, respectivamente. O íon filho m/z 623 produziu m/z 461 e 315 no estudo MS3, que seguiu as mesmas vias de fragmentação do echinacoside, conforme discutido acima. Os dados LC-ESI-MSN suportaram uma identificação provisória para o pico 2 comocistanosídeo A.

Experimentos LC-ESI-MS também foram conduzidos para picos

3 e 4 (tR 12,49 e 13,46 min na Fig. 2). Ambos os picos mostraram o mesmo [MH]— íon em m/z 623 e dímero em m/z 1247 no modo negativo (Tabela 1), indicando que são possivelmente isômeros com o mesmo peso molecular de

624, o mesmo queacteósidoe isoacteósido. Os espectros MS2 dos íons [MH]— também mostraram um mesmo íon filho de m/z 461, que indicou a perda da porção cafeoíla do íon parental m/z 623 (Tabela 1). Espectros de MS3 semelhantes foram obtidos para os dois compostos. Para o pico 3, o espectro MS3 do íon em m/z 461 formou três íons em m/z 315, 161 e 135. O m/z 315 é formado após a perda de ramnose como discutido anteriormente. O íon m/z 161 foi produzido a partir da clivagem da porção cafeoíla, seguida por uma perda adicional de uma água; a carga permaneceu por parte da porção cafeoíla. O íon em m/z 135 [aglicona 18 H] – surgiu da clivagem da ligação glicosídica na posição C1 com uma perda adicional de uma água, deixando a carga por parte da porção aglicona. O espectro MS3 do pico 4 seguiu a mesma via de fragmentação do pico 3, exceto pelo íon ausente em m/z 135. O íon molecular e os padrões de fragmentação desses dois compostos são consistentes com os dados da literatura sobreacteósidoe isoacteoside (Wang et al., 2000), embora um íon adicional m/z 153 tenha sido encontrado e

designado como [aglicona H]— por Wang et al. (Wang et al., 2000). Este íon pode ter sido instável e perdido água para dar m/z 135 em nosso experimento. Com base nos dados MS e nos tempos de retenção congruentes dos picos 3 e 4 com os padrões, eles são, portanto, identificados comoacteósidoe isoacteósido, respectivamente.

Os dados LC-ESI-MS do pico 5 são mostrados na Tabela 2. Um íon molecular desprotonado [MH]— (m/z 665) foi o único íon encontrado no modo negativo, implicando uma massa molecular de 666. Três íons filhos foram observados a m/z 623, 503 e 461 na experiência MS2 (Tabela 2). Os íons filhos em m/z 623 e 503 foram formados diretamente do íon pai pela perda de um grupo COCH2 e uma porção cafeoil, respectivamente. O íon em m/z 461 veio da perda tanto do cafeoil quanto da fração COCH2 [M 162 42 H] — do íon pai. No experimento MS, m/z 623 produziu m/z 461, e m/z 503 rendeu três íons em m/z 485, 461 e 315. O espectro MS3 do íon filho m/z 461 deu dois íons em 443 e 315. Ao comparar o padrão de fragmentação LC-MSN do pico 5 com outros compostos relatados neste estudo e com outros relatados (Li et al., 2005; Wang et al., 2000), concluímos que o pico 5 estava estruturalmente altamente relacionado para acteosídeo com a única diferença sendo a unidade COCH3 na posição R3. Uma identidade provisória foi, portanto, dada ao pico 5 como 20-acetilacteoside (Fig. 1).

As estruturas dos dois compostos provisoriamente identificados, pico 2 (como cistanosídeo A) e pico 5 (como 20-acetil-acteoside) foram confirmadas de suas estruturas por 1H RMN. Os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento de todos os prótons nos compostos 2 e 5, conforme mostrado na Tabela 3., combinados com os dados de NMR relatados paracistanosídeo Ae 20-acetilacteoside, respectivamente (Kobayashi et al., 1984, 1987). Experimentos de RMN 2D (correlação COSY, ROESY e CH de longo alcance) também foram conduzidos no presente estudo e confirmaram ainda mais a identificação (dados não mostrados).

feniletanoideglicosídeos em cistanche

4. Conclusões

No presente trabalho, HSCCC foi usado com sucesso para o isolamento e purificação de echinacoside,cistanosídeo A, acteoside, isoacteoside e 20-acetilacteoside do extrato de n-butanol de C. deserticola. É, portanto, um meio comprovado para a separação semipreparativa de bioativos. Enquanto isso, as estruturas dos cinco PhGs em Cistanche deserticola foram investigadas por meio de LC-ESI-MSN; foram encontrados alguns traços característicos dos PhGs, o que nos permitiu determinar os grupos funcionais nas estruturas. O método LC-ESI-MSN é, portanto, uma ferramenta poderosa para a identificação rápida defeniletanoidese seus glicosídeosCistanche deserticolaextratos, especialmente quando comprovados por dados de RMN.

Reconhecimento

Os autores gostariam de agradecer a Jun Gu do Centro de Ressonância Magnética Nuclear da Universidade de Guelph, Ontário, Canadá, por sua assistência em experimentos de RMN. Este projeto foi parcialmente apoiado por financiamento da Província de Jilin, China (nº 20060904).

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