PARTE Ⅰ: Análogo de ácido epoxieicosatrienoico direcionado ao rim, EET-F01, reduz a inflamação, estresse oxidativo e nefrotoxicidade induzida por cisplatina

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John D. Imig, Md Abdul Hye Khan & et al.

1. Introdução

A doença renal em pacientes com câncer e sobreviventes emergiu como um importante problema de saúde e continua a aumentar acentuadamente [1-3]. As terapias mais recentes contra o câncer aumentaram as taxas de cura e os tempos de sobrevida, mas anormalidades de fluidos e eletrólitos associadas à terapia e lesão renal aguda que progride para doença renal crônica são sequelas comuns [3-5]. Drogas anticancerígenas, inibidores da tirosina quinase do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFRI) e derivados da platina também podem causar lesão renal grave que compromete significativamente seu uso eficaz e seguro [3-5]. Existe uma necessidade clínica significativa de novas terapias para tratar e interromper eficazmente a doença renal em pacientes com câncer. Esta questão de saúde levou ao desenvolvimento, evolução e surgimento de uma subespecialidade, Onco Nefrologia [5]. Os tratamentos atuais apenas retardam a perda da função renal ou não trazem nenhum benefício [2,5,6]. Novas abordagens são urgentemente necessárias. Nossa pesquisa em andamento está atacando essa arena emergente do câncer e estamos focados no desenvolvimento de análogos do ácido epoxieicosatrienoico (EET) para proteger o rim da toxicidade associada à terapia do câncer.

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Os análogos de EET são baseados na fração farmacofórica de EETs e projetados com melhor solubilidade e resistência à auto-oxidação e metabolismo por epóxido hidrolase solúvel (sEH)[7,8]. Estudos anteriores demonstraram que os análogos sintéticos de EET são protetores dos rins em várias condições patológicas, como hipertensão,nefrotoxicidade, e nefrite lúpica [9-13]. Os análogos de EET diminuem o dano renal nesses estados patológicos por meio de atividades vasodilatadoras, diuréticas, anti-inflamatórias, antioxidantes e antiapoptóticas[10-13]. Esses estudos demonstraram claramente que uma abordagem baseada em EET combate o dano renal em situações patológicas de diferentes etiologias. Recentemente, foram feitas tentativas para desenvolver análogos de EET que possuam a propriedade única de atingir o rim. Uma nova forma de análogo de EET direcionado ao rim foi projetada e sintetizada conjugando o farmacoforo EET com ácido fólico.EET-F01). No presente estudo, investigamos a capacidade deEET-F01para atingir o rim quando comparado ao análogo EET, EET-A. EET-FO1 e EET-A foram comparados quanto à sua capacidade de diminuir a lesão renal induzida por cisplatina. Por fim, este estudo delineou ainda mais as ações anti-inflamatórias e antioxidantes protetoras dos rins deEET-F01.

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2. Resultados

2.1. EET-F01Alvos do tecido renal

Estruturas químicas para EET-A e EET-FO1 são fornecidas na Figura 1. Pureza para EET-A eEET-F01 was >95 por cento conforme determinado por RMN. No estudo agudo com animais, doses iguais em peso de EET-A eEET-F01foram administrados por via intravenosa por 6 h, seguido de coleta de plasma e tecido renal. Demonstramos um nível plasmático 5-mais alto deEET-F01comparado ao EET-A após 6-h administração contínua (Figura 1). Curiosamente, também demonstramos que após 6-h administração contínua, o conteúdo renal de EET-A era quase indetectável em comparação comEET-F01conteúdo no rim (Figura 1). Esses dados demonstram queEET-F01atinge o rim.

Figura 1. Comparação de plasma e rim EET-F01 e EET-A após administração iv por 6h.Painel superior: Estruturas químicas para EET-A eEET-F01. Painel esquerdo: Concentração plasmática de EET-FO1 e EET-A. Painel direito: Níveis renais deEET-F01e EET-A. Dados expressos como média±SEM, n=3/grupo.

2.2. EET-F01Protege contra a CisplatinaNefrotoxicidade

Em um conjunto separado de experimentos, grupos de ratos foram pré-tratados comEET-F01e EET-A durante dois dias antes da indução da nefropatia por cisplatina e depois tratados com os compostos de teste durante mais 5 dias. As ações protetoras dos rins deEET-F01e EET-A foram determinados a partir dos níveis de BUN, conteúdo urinário de NAG e níveis urinários de KIM-1.EET-F01foi tão eficaz quanto a EET-A na redução de BUN, NAG, KIM-1 e lesão histológica renal cinco dias após a indução de cisplatinanefrotoxicidade(Figura 2). Em seguida, o exame histológico foi realizado para avaliar melhor a nefrotoxicidade da cisplatina. A administração de cisplatina resultou em lesão tubular manifestada por vacuolação e descamação das células epiteliais renais, juntamente com formação de cilindros proteicos intra-tubulares graves nas regiões cortical e medular do rim. EET-A eEET-F01tratamento protegeu o rim da cisplatinanefrotoxicidadeem ratos (Figura 2).EET-F01foi eficaz em 20 mg/kg/d e em uma dose 10-vezes menor de 2 mg/kg/d, apesar de seu peso molecular quase 2x maior devido ao folato em comparação com EET-A. Esses dados demonstram claramente queEET-F01tem como alvo o rim e facilita uma dose mais baixa, mas ainda eficaz. Assim, desenvolvemos um análogo EET direcionado ao rim,EET-F01, que demonstra excelente potencial como terapêutico para doenças renais.

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Figura 2. A lesão renal induzida pela cisplatina é reduzida pelos tratamentos EET-F01 e EET-A.Painel esquerdo: nitrogênio ureico no sangue (BUN), painel do meio: N-acetil- -(D)-glicosaminidase (NAG) urinário), painel direito: molécula de lesão renal-1 (KIM-1) em ratos administrados com cisplatina tratados com veículo, EET-FO1 ou EET-A. Painel inferior: Fotomicrografias representativas de coloração de ácido periódico de Schiff (PAS) mostrando vacuolação e descamação das células epiteliais renais, juntamente com formação de molde tubular proteico intra-tubular grave nas seções renais de diferentes grupos experimentais.*p<0.05 vs.="" control-vehicle="" group;t=""><0.05 vs.="" cisplatin-vehicle="" group.data="" expressed="" as="" mean="" ±sem,="" n="">

2.3. EET-F01 e EET-A reduzem a inflamação renal e o estresse de oxidação em cisplatinaNefrotoxicidade

Os níveis de expressão renal de IL-6 e TNFo mRNA revelaram um aumento de 4 a 5-vezes na indução de cisplatinanefrotoxicidade. EET-F01e o tratamento com EET-A reduziu os genes inflamatórios renais IL-6 e TNF em 30-50 por cento em cisplatinanefrotoxicidade(Figura 3). A expressão renal aumentada dos genes marcadores oxidativos NADPH oxidase subunidades p47phox, p67phox, gp91phox e NOX4 é observada em ratos administrados com cisplatina. Os níveis de TBARS no tecido renal foram aumentados durante a indução de cisplatinanefrotoxicidade. Esses aumentos induzidos por cisplatina no estresse oxidativo foram atenuados60-100 por cento porEET-F01e tratamento com EET-A (Figuras 4 e 5). Esses dados demonstram que o alvo renalEET-F01é tão eficaz quanto a EET-A na redução da inflamação e do estresse oxidativo em cisplatinanefrotoxicidade.

Figura 3. A inflamação renal na nefrotoxicidade da cisplatina é reduzida pelos tratamentos com EET-F01 e EET-A.Análise de RT-PCR para expressões de mRNA de IL-6(painel esquerdo) e TNF (painel direito).*p<0.05 vs.="" control-vehicle="" group;=""><0.05 vs.="" cisplatin-vehicle="" group.="" data="" expressed="" as="" mean±sem,="" n="">

2.4. EET-A não aumenta o crescimento do tumor

O uso de análogos de EET pode promover metástase de câncer quando administrado por longos períodos de tempo [14,15]. Embora a abordagem terapêutica atual administre análogos de EET por um curto período de tempo para prevenirnefrotoxicidade, avaliamos os efeitos a longo prazo da EET-A no crescimento tumoral de uma linhagem de células de câncer de mama humano, MBA-MB-231, em camundongos atímicos. O volume e o peso do tumor aumentaram na mesma taxa em camundongos tratados com veículo ou EET-A durante um período de três semanas (Figura 6). A avaliação histológica dos tumores não demonstrou quaisquer alterações na hiperplasia ou proliferação celular em camundongos tratados com EET-A. Estes dados demonstram que EET-A não aumenta o crescimento tumoral.

Figura 4. O estresse oxidativo renal na nefrotoxicidade da cisplatina é reduzido pelos tratamentos EET-F01 e EET-A.Análise de RT-PCR para expressões de mRNA de (a)p47phox, (b)p67phox, (c)gp91phox, (d) NOX4.*p<0.05 vs.control-vehicle=""><0.05 vs.="" cisplatin-vehicle="" group.="" data="" expressed="" as="" mean="" ±="" sem,="" n="">	Figura 5. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico renal (TBARS) na nefrotoxicidade da cisplatina são reduzidas pelos tratamentos EET-F01 e EET-A.*p<0.05 vs.control-vehicle=""><0.05 vs.="" cisplatin-vehicle="" group.="" data="" expressed="" as="" mean="" ±="" sem,="" n="">

Figura 6. O crescimento tumoral de uma linhagem de células de câncer de mama humano, MBA-MB-231, em camundongos atímicos não é alterado pelo tratamento com EET-A.Painel esquerdo: volume do tumor, painel direito: peso do tumor em camundongos com tumor MBA-MB-231 tratados com veículo (controle) ou EET-A. Painel inferior: Fotomicrografias representativas da coloração de ácido periódico de Schiff (PAS) mostrando hiperplasia tumoral semelhante e proliferação em tumores de mama humanos. Dados expressos como média± SEM, n=5 camundongos e n=10 tumores/grupo.

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