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O equinacosídeo suprime a inibição do crescimento e a apoptose induzidas por dexametasona em células osteoblásticas MC3T3-E1

Mar 11, 2022

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrato.

Os glicocorticóides (GCs) são amplamente utilizados no tratamento de doenças crônicas. A administração prolongada e/ou overdose de GCs tem muitos efeitos colaterais na saúde humana, incluindo osteoporose induzida por GC (GIOP). Nesta investigação, o objetivo foi avaliar a influência queechinacoside de cistanche(ECH) exerce sobre células MC3T3-E1 osteoblásticas murinas tratadas com dexametasona. Descobrimos que ECH(echinacoside de cistanche) (5, 10, 20, and 40 mg/l) inhibited dexamethasone (1,000 nM)-suppressed cell viability as demonstrated by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The dose of 10 mg/l was selected for the following experiments because this dose had a better effect than the dose of 5 mg/l, and the doses >10 mg/l teve um efeito semelhante a esta dose. ECH(echinacoside de cistanche)(10 mg/l) ou pifitrina- (PFT-) (um inibidor de p53, 20 µM) suprimiu a apoptose de MC3T3-E1 induzida por dexametasona, conforme ilustrado pela análise de citometria de fluxo de marcação dupla de anexina V/iodeto de propídio (PI) . ECH(echinacoside de cistanche)ou o tratamento com PFT também aliviou a ação da dexametasona de inibir a expressão de Bcl-2, bem como a ação da dexametasona de estimular a expressão de p53 e Bax. Além disso, a superexpressão de p53 mediada por lentivírus reverteu os efeitos da ECH(echinacoside de cistanche)em células MC3T3-E1 tratadas com dexametasona, sugerindo que ECH(echinacoside de cistanche)induziu efeitos antiapoptóticos em osteoblastos tratados com dexametasona via via ap53-dependente. Em resumo, o ECH(echinacoside de cistanche)tem um efeito protetor contra a apoptose de células osteoblásticas induzida por dexametasona, sugerindo que ECH(echinacoside de cistanche)pode ter potencial para aplicação clínica no tratamento de GIOP.

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Introdução

Glicocorticóides(GCs) são frequentemente usados ​​para tratar um amplo espectro de doenças crônicas, incluindo inflamação, câncer e distúrbios autoimunes (1). No entanto, a administração prolongada e/ou overdose de GCs tem muitos efeitos colaterais, como hipertensão, hiperglicemia, glaucoma, osteonecrose e osteoporose (2-4). Está claro que o uso de GC aumenta a perda óssea e o risco de fratura (3-6). Os GCs podem induzir a apoptose de osteoblastos e prejudicar a função dessas células. Por exemplo, a dexametasona, um hormônio GC, pode regular a expressão de p53 em células osteoblásticas MC3T3-E1, causando apoptose celular (7,8). A apoptose de osteoblastos leva à diminuição da formação óssea. O uso oral de bifosfonatos (alendronato e risedronato) (9,10) foi introduzido para o tratamento da osteoporose induzida por GC (GIOP). No entanto, baixas taxas de adesão limitam a eficiência dos bisfosfonatos orais. Outros medicamentos também apresentam limitações, como administração inconveniente [ácido zoledrônico (11)] e alto custo [PTH 1-34 (teriparatida) (12,13)]. Consequentemente, há necessidade de desenvolvimento de novas opções de tratamento para GIOP.

Echinacoside de cistanche (ECH)é um glicosídeo feniletanoide isolado da medicina tradicional chinesaErvaCistanches(14). ECH(echinacoside de cistanche)tem efeitos protetores no sistema neuronal (15-20), fígado (21,22) e pulmão (23) através da promoção da proliferação celular e da inibição da resposta inflamatória, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e apoptose celular. Embora ECH(echinacoside de cistanche)também pode promover a regeneração óssea osteoblástica e tem extraordinária atividade antiosteoporótica nos modelos de ratos (24,25), não há registros existentes descrevendo os efeitos da ECH(echinacoside de cistanche)na apoptose de células osteoblásticas induzida por GC. Assim, investigamos a influência que ECH(echinacoside de cistanche)exerce sobre a apoptose de células osteoblásticas induzida por dexametasona e elucidou o mecanismo preliminar em células MC3T3-E1.


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Materiais e métodos

Cultivo do células. O Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China) forneceu as células osteoblásticas murinas MC3T3-E1. O crescimento das células ocorreu em meio essencial mínimo (-MEM) (Hyclone; GE Healthcare, Logan, UT, EUA) contendo 10 por cento de soro fetal bovino (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Grand Island, NY, EUA ) e penicilina/estreptomicina (Beijing Solar Science and Technology Co., Ltd., Pequim, China). A manutenção das células foi realizada em um ambiente com 95% de ar e 5% de dióxido de carbono a uma temperatura de 37°C.

oProduçãodolentivírussuperexpressando p53. Para criar o construto de expressão de p53, a região da sequência codificadora de proteína (CDS) do gene p53 murino foi sintetizada e inserida emEcoRI/BamLocais de restrição HI do vetor de expressão lentiviral pLVX-puro (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, EUA) por Genewiz, Inc. (Pequim, China). A construção foi verificada por sequenciação de DNA. As células 293T (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, China) foram transfectadas com uma mistura de plasmídeos, incluindo plasmídeos de empacotamento viral e plasmídeo de expressão de p53 (pLVX-p53) ou plasmídeo de controle (pLVX) via Lipofectamine 2000 (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc., Carlsbad, CA, EUA) com base nas instruções do fabricante. O sobrenadante viral foi coletado 48 h após a transfecção e usado para infectar células MC3T3-E1. A avaliação da expressão de p53 foi realizada 48 h após a infecção viral.

Quantitativopolimerasecorrentereação(qPCR). Usamos o reagente TRIzol (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc.) para separar o RNA total e as células MC3T3-E1, e o kit RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante para transcrição reversa do RNA total. O nível de mRNA de p53 foi detectado via qPCR no ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems: Thermo Fisher Scientific, Inc., Foster City, CA, EUA). Os primers foram os seguintes: 5'-CCC CTGTCATCTTTTGTCCCT-3' e 5'-AGCTGGCAGAAT AGCTTATTGAG-3' para p53, 5'-CTGCCCAGAACATCA TCC-3' e 5'-CTCAGATGCCTGCTTCAC{{ 18}}' para GAPDH.

Em seguida, avaliamos os níveis de mRNA de p53 através do 2-Método ΔΔCT (26) com GAPDH como controle interno.

Manchas ocidentais. A lise das células MC3T3-E1 ocorreu em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação com inibidores de protease (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), e a centrifugação dos lisados ​​continuou por 15 min a uma temperatura de 4˚C a 9.600 xg para que a precipitação possa ser removida. Posteriormente, avaliou-se a quantidade de proteína com o kit de ensaio BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Uma quantidade igual de proteína foi adicionada a 10 ou 15 por cento de SDS-PAGE e transferida para uma membrana de nitrocelulose (EMD Millipore, Bradford, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado e sondadas com anticorpos primários. Após a lavagem 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), a incubação das membranas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (1:1,{16}}; cat no. A0208; Beyotime Institute of Biotechnology, Xangai, China) foi conduzida . Realizamos testes de Western blotting por meio de um kit de quimioluminescência aprimorada (ECL) (EMD Millipore). GAPDH foi usado como padrão interno. As fontes de anticorpos primários foram as seguintes: Bax (Sc-493) e Bcl-2 (Sc-492) ambos da Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EUA); p53 (nº 2524) e GAPDH (nº 5174) ambos da Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EUA).

Experimental agrupamento. Para determinar a dose adequada de dexametasona, o tratamento de células MC3T3-E1 foi realizado com uma série de quantidades de dexametasona (0, 1, 10, 100 e 1,000 nM; Sigma -Aldrich; Merck KGaA, St. Louis, MO, EUA). Às 48 h após a incubação das células, os ensaios do Cell Counting Kit-8 (CCK-8) foram realizados para detectar a proliferação celular.

Para selecionar a dose apropriada de ECH(echinacoside de cistanche), o tratamento de células MC3T3-E1 foi realizado com 1,000 nM de dexametasona e várias doses de ECH (0, 2,5, 5, 10, 20 e 40 mg/l; Xangai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China). As células cultivadas em condições normais (simuladas) serviram como controle. O ensaio CCK-8 foi realizado após 48 h de cultura.

Para todos os outros experimentos, as células MC3T3-E1 foram divididas em cinco grupos: grupo 1 (simulado), as células foram cultivadas em condições normais; grupo 2, as células foram transduzidas com lentivírus pLVX; grupo 3, células cultivadas com 10 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche); grupo 4, células com 20 µM de pifitrina- (PFT-; Selleck Chemicals, Houston, TX, EUA); grupo 5, células transduzidas com lentivírus pLVX-p53 e tratadas com 10 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche). As células nos grupos 2-5 foram tratadas com 1,000 nM dexametasona. A apoptose celular e a expressão de proteínas foram medidas após 48 h de cultura.

Célulaensaio de proliferação.Semeamos células MC3T3-E1 em 96-placas de poços em 3x103células/poço e as cultivaram em condições normais durante a noite. As células foram tratadas como indicado. Após 48 h de cultura, o ensaio CCK8 (Signalway Antibody LLC, College Park, MD, EUA) foi então realizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o meio de cultura em cada poço foi substituído por 100 µl de solução de CCK-8 a 10 por cento no meio. Após incubar as células por uma duração de 1 h a uma temperatura de 37˚C, avaliamos a absorbância em um comprimento de onda de 450 nm com um leitor de microplacas. A viabilidade celular relativa (porcentagem) com conexões para poços de controle foi calculada.

Célulaavaliação de apoptose. Usamos o kit de apoptose de células Anexina V-FITC (Beyotime Institute of Biotechnology) para quantificar células que estão em apoptose precoce seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, a coleta de células tratadas foi realizada via tripsinização. As células foram lavadas via PBS e ressuspensas com tampão de ligação de anexina. A incubação das células foi realizada via Anexina V-FITC por uma duração de 15 minutos a uma temperatura de 4°C seguida de incubação com iodeto de propídio (PI) por 5 minutos a 4°C. As células do quadrante inferior direito (positivas para anexina V-FITC e negativas para PI) foram consideradas ativamente em apoptose precoce.

Estatísticaanálise. Os dados são as médias ± SD para todos os três experimentos independentes. O teste de comparações múltiplas de Tukey e a análise de variância unidirecional foram realizados para analisar as diferenças entre os grupos por meio do software GraphPad Prism (versão 6.0; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

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Resultados

Estabelecimentodoa dose adequadadodexametasona.Para determinar a dose adequada de dexametasona, as células MC3T3-E1 foram expostas a quantidades crescentes de dexametasona (0, 1, 10, 100 e 1,000 nM) por 48 h . Conforme mostrado na Fig. 1, a viabilidade celular relativa foi determinada pelo ensaio CCK{11}} foi aumentada em células tratadas com baixas concentrações de dexametasona (1 e 10 nM) e significativamente reduzida em células expostas a altas concentrações de dexametasona (100 e 1,000 nM).

Establishment of the suitable dose of DEX. Concentrations of 0, 1, 10, 100 or 1,000 nM of DEX were added to MC3T3-E1 cells for 48 h, and CCK-8 was then performed

A redução mais significativa foi observada nas células com 1,000 nM de dexametasona. Assim, 1,000 nM de dexametasona foi selecionado nos ensaios subsequentes.

Efeito da ECH(echinacoside de cistanche)na inibição do crescimento celular induzida pela dexametasona. Em seguida, exploramos o efeito da ECH(echinacoside de cistanche)na inibição do crescimento celular induzida pela dexametasona. O tratamento das células MC3T3-E1 foi realizado com 1,000 nM de dexametasona e várias doses de ECH(echinacoside de cistanche)(0, 2,5, 5, 10, 20 e 40 mg/l; Fig. 2). Às 48 h pós-tratamento, a adição de ECH(echinacoside de cistanche)em doses de 5, 10, 20 e 40 mg/l diminuíram notavelmente o dano celular induzido pela dexametasona. ECH(echinacoside de cistanche)na dose de 10 mg/l tem um efeito mais óbvio do que na dose de 5 mg/l. A viabilidade celular foi semelhante em células tratadas com 10, 20 e 40 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche). Portanto, 10 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche)foi usado nos seguintes experimentos.

Superexpressão de p53 pela construção de lentivírus. A dexametasona pode regular positivamente a p53, induzindo assim a apoptose dos osteoblastos (8). Para estudar os efeitos da ECH(echinacoside de cistanche) on dexamethasone-induced p53 expression, we constructed a lentivirus encoding p53 (pLVX-p53) and transduced the virus into MC3T3-E1 cells. The expression of p53 was analyzed at 48 h after transduction. Fig. 3 shows that p53 mRNA and protein levels were increased to >2 vezes em células transduzidas com pLVX-p53-em comparação com células com vírus de controle (pLVX). p53 estava envolvido no efeito de ECH(echinacoside de cistanche) na apoptose induzida por dexametasona. As células MC3T3-E1 foram tratadas com Plavix ou pLVX-p53, 10 mg/l de ECH(echinacoside de cistanche), 20 µM de PFT- (um inibidor de p53) e 1,000 nM de dexametasona, e então a apoptose celular foi medida através do kit de apoptose Anexina V-FITC. Como mostrado na Fig. 4A, o tratamento com dexametasona induziu notavelmente a apoptose celular em comparação com as células cultivadas em condições normais (simulação). ECH(echinacoside de cistanche) e o tratamento com PFT protegeram significativamente as células MC3T3‑E1 contra a apoptose induzida por dexametasona. Além disso, a superexpressão de p53 reverteu os efeitos protetores de ECH(echinacoside de cistanche).

Bcl-2 e Bax, como importantes reguladores de apoptose, são conhecidos por serem regulados por p53 (27). Western blotting indicou que as alterações da expressão da proteína p53 e Bax eram consistentes com as alterações da apoptose celular, enquanto a expressão de Bcl-2 mudou na direção oposta (Fig. 4B e C). Notavelmente, os níveis de proteína de p53 foram significativamente suprimidos por ECH(echinacoside de cistanche)e PFT- tratamento em células que superexpressam p53 e tratadas com dexametasona (Fig. 4C). Esses dados sugerem que a ECH(echinacoside de cistanche)pode exercer efeitos protetores na apoptose induzida por dexametasona através da inibição da expressão de p53.

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Efeitos do cistanche echinacoside

Discussão

A função anti-apoptose da ECH(echinacoside de cistanche)foi descrito no modelo de lesão hepática aguda induzida por D-galactosamina (D-GalN) e lipopolissacarídeo (LPS) e em células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) induzidas por fator de necrose tumoral ou 1-metil{{6 }}fenilpiridínioião (MPP mais ) (17,22,28). Foi relatado que o tratamento com dexametasona pode inibir a proliferação e induzir a apoptose de células MC3T3-E1 (8,29). No estudo atual, a viabilidade celular relativa foi significativamente reduzida em células expostas a altas concentrações de dexametasona (100 e 1,{10}} nM), o que foi consistente com um estudo anterior (8). O tratamento adicional com ECH (5-40 mg/l) inibiu notavelmente a viabilidade celular suprimida com dexametasona. Além disso, a exposição à dexametasona (1,000 nM) estimulou a apoptose das células MC3T3-E1, que o tratamento com ECH restringiu de forma significativa. O relatório deu uma primeira descrição de como a ECH é protegida contra a apoptose de células osteoblásticas induzida por dexametasona e sugeriu que a ECH pode ter potencial para aplicação clínica em GIOP.

Além disso, tentamos explorar o mecanismo preliminar dos efeitos protetores da ECH(echinacoside de cistanche). A dexametasona pode aumentar a transcrição de p53, induzindo assim a apoptose dos osteoblastos e a parada do ciclo celular (8). p53 é regulado negativamente por ECH em células SH-SY5Y (28). Aqui, PFT- (um inibidor de p53) teve efeitos protetores semelhantes a ECH, enquanto a superexpressão de p53 reverteu os efeitos protetores de ECH. As alterações da expressão da proteína p53 em diferentes condições estiveram de acordo com as alterações da apoptose celular. Estes resultados indicam que a ECH pode exercer efeitos protetores na apoptose de células osteoblásticas induzidas por dexametasona através da inibição da expressão de p53. As proteínas da família Bcl-2, como Bcl-2 e Bax, podem alterar a permeabilidade da membrana mitocondrial, ativar caspases efetoras e causar apoptose celular (30). É bem conhecido que p53 pode regular Bcl-2 e Bax (27). Aqui, o tratamento com PFT- ou ECH(echinacoside de cistanche) atenuou os efeitos inibitórios da dexametasona sobre os níveis da proteína anti-apoptose Bcl-2, bem como os efeitos estimulatórios da dexametasona sobre os níveis da proteína pró-apoptose Bax, enquanto a superexpressão de p53 reverteu os efeitos da ECH. Esses resultados demonstraram ainda o envolvimento da p53 na função protetora da ECH.

Em resumo, demonstramos que ECH(echinacoside de cistanche)tem um efeito protetor promissor na apoptose de células osteoblásticas induzida por dexametasona, sugerindo que a ECH pode ter potencial para aplicação clínica no tratamento de GIOP.

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Efeitos do echinacoside de cistanche

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