O equinacosídeo impede a progressão maligna das células MCF -7 do câncer de mama ao modular a transdução do sinal AKR1B10/ERK

Resumo: Este estudo analisa o impactoequinacosida(ECH) na proliferação, metástase e resistência à adriamicina (ADR) decâncer de mama(BC) Células MCF{{0}} através da modulação do membro 10 da família aldo-ceto redutase 1 (AKR1B10)/via quinase regulada por sinal extracelular (ERK). A estrutura química do ECH foi primeiramente confirmada. Células MCF-7 foram tratadas com diferentes concentrações (0, 10, 20, 40 ug·mL-1 ) de ECH por 48 h. Western blotting foi usado para analisar a expressão de proteínas associadas à via AKR1B10/ERK e kit de contagem de células-8 (CCK-8) para determinar a viabilidade celular. Células MCF-7 foram coletadas e classificadas em grupo controle, grupo ECH, grupo ECH mais Ov-NC e grupo ECH mais OvAKR1B10. Em seguida, Western blotting foi empregado para analisar a expressão de proteínas associadas à via AKR1B10/ERK. O ensaio de CCK-8 e 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) foi usado para examinar a proliferação celular. A migração celular foi avaliada com ensaio de raspagem, ensaio transwell e Western blotting. Eventualmente, células MCF-7 foram tratadas com ADR por 48 h para induzir resistência a ADR. A viabilidade celular foi testada pelo ensaio CCK-8 e a apoptose celular foi estimada com base no ensaio TUNEL mediado por terminal deoxynucleoitidyl transferase e Western blotting. Com base no Banco de Dados de Proteínas (PDB) e no docking molecular, foi avaliada a afinidade de ligação de ECH a AKR1B10. Várias doses de ECH diminuíram a expressão de proteínas associadas à via AKR1B10/ERK de maneira dependente da dose e diminuíram a viabilidade celular em comparação com o grupo controle. Em comparação com o grupo controle, 40 ug·mL-1 ECH bloqueou a via AKR1B10/ERK em células MCF-7 e inibiu a proliferação, metástase e resistência ADR das células. Em comparação com o grupo ECH mais Ov -NC, o grupo ECH mais Ov-AKR1B10 mostrou a recuperação de alguns comportamentos biológicos das células MCF-7. A ECH também mirou no AKR1B10. ECH pode inibir a proliferação, metástase e resistência ADR de células BC bloqueando a via AKR1B10/ERK.

Palavras-chave:equinacosida; sinalização AKR1B10/ERK; câncer de mama; resistência a adriamicina

O câncer de mama (CM) é de longe a neoplasia maligna feminina mais comum, com uma idade média de diagnóstico de cerca de 60 anos [1]. A proporção de novos casos de BC na China representa 12,2% da proporção global, e a proporção de mortes por BC no mundo é de 9,6% [2]. Fatores genéticos e ambientais, como dieta rica em gordura, ingestão de álcool e atividade física insuficiente, são fatores de risco para câncer de mama [3-4]. Os tratamentos modernos ainda incluem cirurgia, radioterapia e terapia medicamentosa [1]. Drogas clínicas comuns incluem ciclofosfamida, 5-fluorouracil, pirarubicina, citrato de tamoxifeno, etc. grande desafio [6]. Ao mesmo tempo, como um tumor heterogêneo, o CM tem maior probabilidade de metastatizar para órgãos como ossos, pulmões, fígado e cérebro, o que torna o câncer de mama metastático incurável [7]. Cistanche é um material medicinal tradicional no meu país. Pertence à família das plantas e é conhecido como "ginseng do deserto"[8].Equinacosida(ECH) é um glicosídeo feniletanóide extraído de Cistanche deserticola. Estudos recentes têm enfatizado queequinacosidatem fortes propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e anticancerígenas. Por exemplo, ao inibir a via mTOR/STAT3, a ECH pode aliviar a resposta inflamatória e o estresse oxidativo na lesão hepática induzida por paracetamol [9]. Múltiplas evidências confirmaram que a ECH desempenha principalmente um papel supressor de tumor na CM, e seu mecanismo pode estar relacionado à regulação negativa da expressão de miR-4306 e miR-4508 [10] ou bloqueio de Wnt/ -catenina sinalização [11].

Aldo-ceto redutase 1B10 (AKR1B10), um membro da superfamília aldo-ceto redutase, pode converter substâncias tóxicas em substâncias não tóxicas através de reações redox e produzir álcoois correspondentes, exercendo assim um efeito protetor nas células hospedeiras [12]. Estudos sugerem que AKR1B10 é expresso principalmente em tecidos humanos normais, como cólon e intestino delgado [13]. Mais estudos revelaram que o AKR1B10 atua principalmente como um oncogene no câncer de mama e pode se tornar um potencial biomarcador de câncer de mama [14-16]. Como um membro chave da família MAPK, proteínas quinases reguladas extracelulares (ERKs) controlam vários processos celulares evolutivamente conservados em metazoários, e a desregulação de ERK pode levar a várias doenças [17]. LI J et al [18] revelou que AKR1B10 pode promover a progressão do câncer de mama ativando a sinalização ERK. Mais interessante, o site SwissTargetPrediction previu o AKR1B10 como um alvo potencial da echinacea. No entanto, não se sabe se a ECH está envolvida na progressão do câncer de mama mediando a sinalização AKR1B10/ERK.

Este estudo se concentrou em explorar os efeitos específicos da ECH no fenótipo das células malignas BC e elucidar a relação entre ECH e a via AKR1B10/ERK em células BC.

1 material

Linha celular epitelial de mama humana normal MCF-10A e linha celular de câncer de mama humano MCF-7 foram fornecidas pelo Cell Resource Center dos Institutos de Ciências Biológicas de Xangai, Academia Chinesa de Ciências; Células MCF-7 resistentes a ADR foram adquiridas da Shanghai Huzhen Industrial Co., Ltd. Meio DMEM/F1 (lote número PM150310), soro de cavalo (lote número 164215) e soro bovino fetal (lote número 164210) foram adquiridos da Wuhan Proceeds Life Technology Co., Ltd.; ECH (lote número 07668) foi adquirido da Sigma-Aldrich, EUA; ADR (lote número KGA8181) foi adquirido de Jiangsu Kaiji Biotechnology Co., Ltd.; A solução de lise RIPA (lote número R0020) foi adquirida da Beijing Soleibao Technology Co., Ltd.; O reagente quantitativo de proteína BCA (lote número CX0013S) foi adquirido da Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.; O reagente CCK-8 (lote número C0037) foi adquirido da Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.; O reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (lote número 11668019) foi adquirido da Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.

Os plasmídeos Ov-AKR1B10 e Ov-NC foram fornecidos por Chongqing Youbao Biotechnology Co., Ltd.; O reagente EdU (lote número C00003) e o kit TUNEL (lote número C11026-1) foram adquiridos da Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd.; DAPI (número de lote 40727ES10) foi adquirido de Guangzhou Ribo Biotechnology Co., Ltd. de Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.; Matrigel (Lote No. 354230) e câmara transwell (Lote No. 3450) foram adquiridos da Corning Company, EUA; Paraformaldeído (Lote No. 158127), Crystal Violet (Lote No. C0775) e solução Triton X-100 (Lote No. T8787) foram fornecidos pela Sigma Company nos Estados Unidos; coelho AKR1B10 (número do lote ab192865), ERK1/2 fosforilado (p-ERK1/2, número do lote ab278538), ERK1/2 (número do lote ab184699), E-caderina (E-caderina, Lote ab212059), N-caderina (N -caderina, lote ab76011), Snail (lote ab216347), linfoma de células B-2 (Bcl-2, lote ab182858), Bcl-2 proteína X relacionada (Bcl-2- anticorpo associado X, Bax, número de lote ab182733) e anticorpo secundário de cabra anti-coelho marcado com HPR (número de lote ab6702) foram adquiridos da Abcam, EUA; O kit de luminescência ECL (lote número SL1350) foi adquirido da Beijing Cool Lamb Technology Co., Ltd. O software Image-Pro Plus foi adquirido da Media Cybernetics, EUA; O microscópio de fluorescência Leica DM1000 e o microscópio invertido Leica DM ILLED foram adquiridos da Leica Microsystems, Alemanha; O software SPSS 22.0 foi adquirido da IBM, EUA.

2 métodos

2.1 Cultura Celular e Manuseio

Células MCF{{0}}A foram cultivadas em DMEM/F12 contendo 5 por cento de soro de cavalo, 20 ng·mL-1 fator de crescimento epidérmico, 0,5 ug·mL-1 cortisol, 10 ng ·mL-1 insulina, 100 ng·mL-1 meio de cultura da toxina da cólera; Células MCF-7 e MCF-7/ADR foram

Cultivado em meio DMEM/F12 com 10 por cento de FBS. Todos os meios foram suplementados com anticorpo duplo a 1 por cento e armazenados a 37 graus em uma atmosfera umidificada com 5 por cento de CO2. Posteriormente, células MCF-7 foram intervencionadas com ECH em diferentes concentrações (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) por 48 h; e 1,0 mg·L-1 ADR foi aplicado para manter a resistência às drogas das células MCF-7/ADR. sexo. 2.2 Método de Western blot A proteína nas células MCF-7 foi extraída por lisado RIPA e a concentração de proteína foi determinada pelo reagente BCA. Proteínas separadas por 10 por cento SDS-PAGE foram transferidas usando membrana PVDF; após bloqueio com 5 por cento de leite desnatado por 2 h em temperatura ambiente, a membrana foi /10 000), E-caderina (1/10 000), N-caderina (1/5 000) , Snail (1/1 000), Bcl-2 (1/1 000), Bax (1/1 000) O anticorpo primário foi incubado durante a noite a 4 graus, seguido de a adição de anticorpo secundário de cabra anti-coelho marcado com HPR (1/2 000) por 1 h em temperatura ambiente. A proteína alvo foi detectada pela adição do kit de luminescência ECL, e a abundância da proteína foi analisada pelo software Image-Pro Plus.

Rico em Echinacoside Cistanche Coffee para o tratamento do câncer de mama

2.3 Ensaio CCK-8 para viabilidade celular

Células MCF{{0}}A e MCF-7 foram semeadas em 96-placas de poços para cultura (5×103 células/poço), e após 24 h , diferentes concentrações (0, 10, 20, 40 ug·mL-1) de ECH foram aplicadas Após a intervenção, 48 horas depois, eles foram tratados com fração de volume de 10% do reagente CCK-8 e a viabilidade foi detectada 2 horas depois. A fim de explorar ainda mais o efeito da ECH na viabilidade de células MCF-7, células MCF-7 transfectadas ou não transfectadas foram cultivadas por 24 h e diferentes concentrações (0, 10, 20, 40 ug· mL-1) de ECH foram usados ​​para intervenção. , uma fração de volume de 10% do reagente CCK-8 foi adicionada em 24, 48 e 72 h, respectivamente, e o método de detecção de viabilidade celular foi o mesmo que o anterior. Para explorar o efeito da ECH na resistência à doxorrubicina de células MCF-7, as células resistentes a MCF-7/ADR foram co-cultivadas com ECH por 48 h e, em seguida, a solução de trabalho CCK-8 foi adicionado para detectar a viabilidade celular.

2.4 Transfecção de plasmídeo

Células MCF-7 foram semeadas e cultivadas em placas de 6-poços (5×104/poço). Quando as células atingiram 60 por cento ~ 70 por cento de confluência, Ov-AKR1B10 e Ov-NC foram transitoriamente transfectados em estrita conformidade com as instruções do reagente de transfecção Lipofectamine 2000. As células de cada grupo foram transfectadas e a transfecção foi concluída após 48 h.

2.5 Coloração de EdU para detectar a proliferação celular

Depois que as células MCF{{0}} foram tratadas com ECH e transfectadas com plasmídeos, 20 µmol·L-1 EdU foram adicionados a cada poço e incubados a 37 graus por 2 h. Posteriormente, as células foram fixadas e permeabilizadas com 4 por cento de paraformaldeído e 0,5 por cento de Triton X-100, respectivamente. Finalmente, as células EdU-positivas coradas com DAPI foram detectadas em um microscópio de fluorescência.

2.6 Ensaio de cicatrização de feridas para detectar a migração celular

Células MCF{{0}} na fase logarítmica de crescimento foram adicionadas a 6-placas de poços e, quando as células atingiram 90 por cento de confluência, use uma ponta de pipeta estéril de 200 µL para fazer uma faixa e lavar 3 vezes com PBS. A largura da ferida foi medida em 0 e 48 h sob um microscópio invertido, e o número de células transferidas foi determinado.

2.7 Ensaio Transwell para detectar invasão celular

As células MCF-7 tratadas com ECH e transfectadas com plasmídeo foram semeadas na câmara superior de um transwell contendo Matrigel, e 500 µL de meio DMEM contendo 10 por cento de FBS foram adicionados à câmara inferior do transwell. Após 24 h, as células da superfície foram limpas com cotonetes e as células foram fixadas e coradas com paraformaldeído e cristal violeta, respectivamente, e as células invasivas foram contadas ao microscópio.

2.8 Coloração TUNEL para detectar apoptose

Após intervenção com 15 µmol L-1 ADR, células MCF-7/ADR tratadas com ECH e transfectadas com plasmídeo foram semeadas em placas de poços 96-e fixadas com paraformaldeído a 4 por cento e {{ 8}},5 por cento Triton X-100 Após o tratamento de permeabilização, a solução de detecção TUNEL foi adicionada e a reação foi realizada a 37 graus por 45 min sob a orientação das instruções do kit, e os núcleos das células DAPI foram corados . Cinco campos visuais foram selecionados aleatoriamente para observar a apoptose celular sob um microscópio de fluorescência.

2.9 Ancoragem molecular

A estrutura tridimensional da proteína AKR1B10 (PDB ID: 1ZUA) foi obtida do banco de dados PDB (https://www.rcsb.org/). Use o software PyMOL 2.2.0 para remover a água dos ingredientes ativos e remover os ligantes originais irrelevantes, depois converta a estrutura química do ECH no formato mol2 pelo software OpenBabel 2.2.1 (http://openbabel.org/wiki) e, finalmente, use o Autodock 4.2 realiza o encaixe molecular e seleciona a pose com a menor energia livre (-10.8 kcal·mol-1) para visualização.

2.10 Análise estatística

Neste estudo, o software SPSS 22.0 foi usado para analisar e processar os dados experimentais e expressos como média ± desvio padrão (x ± s). A análise de variância unidirecional foi usada para comparação entre os grupos. quando P<0.05, the difference was statistically significant.

3. Resultados

3.1 ECH inibe a sinalização de AKR1B10/ERK em células MCF-7 Primeiro, os resultados de Western blotting revelaram que, com o aumento da dose de exposição a ECH, os níveis de proteína de AKR1B10 e pERK1/2/ERK1/2 em MCF{{11 }} células diminuíram, e a tendência de queda foi dependente da dose P<0.001) (Fig. 1). It can be speculated that ECH may participate in the malignant progression of BC by regulating AKR1B10/ERK signaling.

Fig.1 Efeito deequinacosidana transdução de sinal AKR1B10/ERK em células MCF-7 (x̄  s, n=3)

3.2 A superexpressão de AKR1B10 reverteu o efeito inibitório de ECH na proliferação celular MCF-7

Os dados experimentais de CCK{{0}} mostraram que, em comparação com células MCF-10A normais, a exposição a diferentes concentrações de ECH (0, 10, 20, 40 ug·mL{{6} }) resultou em uma diminuição dependente da concentração na atividade das células cancerígenas MCF-7 (P< 0.05), and when the mass concentration of ECH was 40 μg·mL-1, the cell activity decreased most significantly, so 40 μg·mL-1 ECH was used for subsequent experiments. To further verify whether ECH regulates BC development by regulating AKR1B10/ERK signaling, MCF-7 cells were first transfected with the Ov-AKR1B10 plasmid. After transfection of Ov-AKR1B10, the expression level of AKR1B10 was significantly increased (P<0.001). Western blotting results showed that transfection of Ov-AKR1B10 plasmid induced ECH exposure-induced reduced AKR1B10 and p-ERK1/2 protein levels again increased (P<0.001). In addition, the experimental data of CCK-8 and EdU demonstrated that the inhibitory effect of ECH treatment on the proliferation of MCF-7 cells could be alleviated by the up-regulation of AKR1B10 (P<0.05) (Fig. 2). Thus, overexpression of AKR1B10 rescued the inhibitory effect of ECH on the proliferative capacity of BC cells.

Fig.2 Efeito do equinosídeo na proliferação de células MCF-7 regulando a expressão de AKR1B10 (coloração de fluorescência, ×200; x̄  s, n=3)

3.3 A superexpressão de AKR1B10 reverteu o efeito inibitório de ECH na migração celular MCF-7 Da mesma forma, em comparação com o grupo controle, a administração de ECH resultou em uma diminuição significativa no número de migração celular e invasão (P<0.001); In contrast, increased expression of AKR1B10 resulted in enhanced cell migration and invasion (P<0.05). In addition, compared with the control group, the protein levels of N-cadherin and Snail were significantly decreased after ECH treatment, while the level of E-cadherin was significantly increased (P<0.001); The protein levels of cadherin and Snail increased, while the level of E-cadherin decreased (P<0.001) (Fig. 3). In conclusion, up-regulation of AKR1B10 expression rescued the inhibitory effect of ECH administration on BC cell migration and invasion.

Fig.4 Efeito do equinosídeo na resistência ADR de células MCF-7 regulando a expressão de AKR1B10 (coloração de fluorescência, ×200; x̄  s, n=3)

4. Discussão

O câncer de mama refere-se à proliferação descontrolada de células epiteliais mamárias sob a ação de diversos fatores carcinogênicos, sendo também a principal causa de morte por câncer em mulheres [1]. A metástase tumoral é uma das características mais ameaçadoras dos tumores e também é a causa raiz da cura a longo prazo dos tumores [19]. A quimioterapia é um método comum para o tratamento clínico do câncer de mama [20]. Com o progresso contínuo e a atualização dos métodos e conceitos de tratamento do câncer de mama, o prognóstico do câncer de mama melhorou significativamente [20]. No entanto, o surgimento de resistência aos medicamentos limita muito a eficácia clínica dos medicamentos [21]. Estudos descobriram que cerca de 90% dos pacientes com câncer de mama metastático e 50% dos pacientes com câncer de mama avançado desenvolverão resistência aos medicamentos [22]. ADR é um antibiótico antraciclina que é amplamente utilizado no tratamento clínico de câncer de mama metastático ou recorrente por atuar na estrutura química do DNA e pode efetivamente reduzir a taxa de recorrência e mortalidade de pacientes com câncer de mama [23]. Portanto, este estudo se concentrou na proliferação, metástase e resistência ADR de células BC, de modo a descobrir profundamente o mecanismo regulador da progressão BC e procurar potenciais alvos moleculares para intervenção.

Echinacea é um composto feniletanóide derivado dos rizomas de ervas naturais Cistanche deserticola e Echinacea purpurea. Possui vários efeitos farmacológicos, como antioxidante, antidepressivo, anti-inflamatório, antiviral, antitumoral e antibacteriano [24-25]. Estudos recentes relataram que a ECH pode inibir a proliferação, metástase e angiogênese de células de câncer de ovário por meio da regulação da via PI3K/Akt [26]; A ECH pode exercer sua atividade anticancerígena no câncer de fígado ativando a via TGF-1/Smad [27]. A ECH pode impedir o crescimento do tumor BC por inativar a via de sinalização Wnt/-catenina [11]. Neste estudo, o AKR1B10 foi inicialmente previsto como um alvo potencial da ECH pela SwissTargetPrediction. Portanto, os autores especulam que a ECH pode participar da progressão da doença BC regulando as vias de sinalização relacionadas ao AKR1B{11}}. Até agora, descobriu-se que o AKR1B10 é aumentado em expressão em vários tipos de câncer e desempenha um papel na promoção do câncer [28]. Além disso, AKR1B10 pode agravar o desenvolvimento de câncer de bexiga, adenocarcinoma de pulmão e BC ao ativar a sinalização ERK [18, 29-30]. A expressão ectópica de AKR1B10 em células de câncer de mama promove a fosforilação de ERK 1/2 para ativar a via de sinalização de ERK [18]. A via de sinalização ERK promove a degradação da matriz extracelular ativando MMPs, especialmente MMP2, promovendo assim a invasão de células tumorais e metástases tumorais [31-33]. Os resultados deste experimento também mostraram que a expressão de proteínas relacionadas à via AKR1B10/ERK diminuiu de maneira dose-dependente após o tratamento com diferentes concentrações de ECH, indicando que a ECH pode participar do mecanismo de regulação do BC por inibir o AKR1B10/ERK caminho. Além disso, a exposição ao ECH também resultou em vários graus de redução na viabilidade das células BC. Para provar ainda mais este ponto, este estudo transfectou o plasmídeo de superexpressão AKR1B10 em células MCF-7 BC e descobriu que os efeitos inibitórios do tratamento com ECH na via AKR1B10/ERK e proliferação celular, migração e invasão e transição epitelial-mesenquimal foram superexpressos por AKR1B10 resgatado. Além disso, em células resistentes a MCF-7/ADR, a exposição a ECH resultou em diminuição de IC50 e aumento no número de células apoptóticas; enquanto a superexpressão de AKR1B10 neste cenário aumentou novamente o IC50 e reduziu a produção de células apoptóticas. No final do experimento, a relação de direcionamento entre ECH e AKR1B10 também foi totalmente verificada. Os resultados experimentais acima mostram que,

A superexpressão de AKR1B10 atinge um efeito antagônico no desenvolvimento de BC suprimido por ECH.

Em conclusão, a administração de ECH pode atenuar a proliferação, migração, invasão, resistência a EMT e ADR de células BC, e o mecanismo pode estar relacionado ao direcionamento de AKR1B10 e inibição da via de sinalização AKR1B10/ERK. Este estudo inicialmente esclareceu o mecanismo potencial de ECH em BC, e forneceu valiosa base experimental e suporte teórico para a aplicação de ECH em drogas anti-BC. No entanto, ainda existem algumas deficiências neste estudo. Primeiro, este experimento não envolveu a análise do impacto da ECH na taxa de sobrevida e prognóstico de pacientes com BC; em segundo lugar, este estudo carecia de experimentos in vivo com animais para verificar ainda mais o papel da ECH no crescimento de tumores BC. Em estudos futuros, o significado clínico da ECH no tratamento do câncer de mama será mais explorado.

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