Modelo de Drosophila para estudar a microbiota intestinal em comportamentos e doenças neurodegenerativas Parte 1

Abstrato:

Evidências crescentes indicam que a microbiota intestinal está ligada a vários processos fisiológicos e ao desenvolvimento de doenças em mamíferos; no entanto, os mecanismos subjacentes permaneceram inexplorados principalmente devido à complexidade do microbioma intestinal dos mamíferos. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é um modelo animal valioso para estudar as interações da microbiota intestinal-hospedeiro em aspectos translacionais.

Animais e memória são uma relação muito interessante. Da lealdade dos cães à inteligência dos ratos, as memórias dos animais têm sido objeto de admiração e curiosidade. Embora os animais variem na forma como se lembram, a sua memória dá credibilidade à conclusão de que os animais não só têm um forte instinto de autopreservação, mas também são capazes de aprender com as experiências, sugerindo que a memória é importante.

Em primeiro lugar, cães e gatos são os dois animais de estimação mais adequados para as pessoas manterem. Eles são todos muito inteligentes e têm ótimas lembranças. Eles podem se lembrar do cheiro e do som do proprietário e do ambiente, e também podem expressar emoções por meio de determinados comportamentos. O poder desta memória reflete-se na capacidade dos cães e gatos de encontrarem os seus donos perdidos. Mesmo que já tenha passado muito tempo desde que o dono saiu, enquanto houver lugares e cheiros que possam ser identificados, eles continuarão procurando.

Em segundo lugar, os ratos também são um dos animais com um QI particularmente elevado. A memória dos ratos é muito melhor do que se imaginava. Eles podem lembrar para onde estão indo, onde está sua comida e seu território, e também podem reconhecer e lembrar pessoas ou animais que representaram um perigo para eles. Experimentos de alguns pesquisadores descobriram que os ratos também reconhecem e respondem ao ambiente por meio de música e tons, o que mostra que a memória animal inclui inteligência sensorial, emocional e lógica.

Em geral, a memória dos animais trouxe muitas surpresas e descobertas às pessoas. Eles não apenas podem se proteger, mas também construir relacionamentos e confiança mais próximos com os humanos. Além disso, os animais inspiraram uma variedade de experiências e estudos que ajudaram os cientistas a compreender melhor a natureza e os mecanismos da memória. Então, vamos admirar a inteligência e a memória dos animais e maravilhar-nos com os seus cérebros inteligentes e flexíveis. Percebe-se que seja humano ou animal, a memória é muito importante. Cistanche pode melhorar significativamente a nossa memória porque Cistanche é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da carne picada vem de uma variedade de ingredientes ativos que ela contém, incluindo ácido carboxílico, polissacarídeos, flavonóides, etc. Esses ingredientes podem promover a saúde do cérebro por meio de vários canais.

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A disponibilidade de poderosas ferramentas e recursos genéticos na Drosophila permitiu aos cientistas desvendar os mecanismos pelos quais os micróbios intestinais afectam a aptidão, a saúde e o comportamento dos seus hospedeiros.

Os modelos de Drosophila têm sido amplamente utilizados não apenas para estudar comportamentos animais (ou seja, namoro, agressão, sono e aprendizagem e memória), mas também algumas doenças neurodegenerativas relacionadas ao homem (ou seja, doença de Alzheimer e doença de Parkinson) no passado. Esta revisão resume de forma abrangente o conhecimento atual da microbiota intestinal da Drosophila e seu impacto no comportamento das moscas, na fisiologia e nas doenças neurodegenerativas.
Palavras-chave:

Drosophila melanogaster; microbiota; eixo intestino-cérebro; comportamentos; aprendizagem e memória; doenças neurodegenerativas.

1. Introdução
A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é um importante animal experimental utilizado em estudos biomédicos. A mosca da fruta foi usada pela primeira vez como organismo experimental por Castle em 1901 e Morgan em 1909 para estudos genéticos. Como a Drosophila tem sido usada como organismo modelo há mais de um século, diversas técnicas foram desenvolvidas para abordar questões científicas específicas.

Drosophila tem uma vida útil relativamente curta e comportamentos complexos. A disponibilidade de ferramentas poderosas para manipulação genética em tecidos ou órgãos específicos permitiu aos cientistas estudar os mecanismos moleculares que regulam o comportamento da Drosophila, como a resposta adaptativa ao ambiente circundante, bem como inata (namoro, agressão, sono, etc.) [1 –3] e comportamentos aprendidos (memória olfativa e memória de namoro) [4–6].

Nos últimos 20 anos, Drosophila tem sido usada como um modelo in vivo ideal para o estudo de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA) e a doença de Parkinson (DP) [7,8]. As vias de sinalização proeminentes que regulam o crescimento e as funções neuronais em humanos são conservadas em Drosophila, permitindo a utilização deste organismo modelo para o estudo de doenças neurodegenerativas humanas.

Por exemplo, o modelo Drosophila de DA desenvolvido pela expressão ectopicamente da proteína A 42 humana no cérebro da mosca exibe sintomas clínicos associados a pacientes com DA, como comprometimento da memória de curto prazo dependente da idade, defeitos de aprendizagem, aumento da vigília e interrupção do sono [8 ,9]. Isto sugere que a Drosophila pode ser usada como um modelo in vivo ideal para a triagem de novos medicamentos para o tratamento da DA.

Evidências crescentes apoiam a noção de que uma microbiota intestinal bem equilibrada é essencial para a saúde humana [10,11]. Interferir na composição da microbiota intestinal pode afetar adversamente a saúde e a fisiologia do hospedeiro, levando a várias doenças neurológicas, como anormalidades comportamentais, doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos [12–14].

Estudos mostraram que as bactérias intestinais podem produzir vários neurotransmissores, incluindo dopamina, ácido gama-aminobutírico (GABA) e serotonina [15]. Além disso, o crosstalk bidirecional entre o intestino e o sistema nervoso central (SNC) é mediado pela microbiota intestinal [16,17]. Estudos recentes indicaram que alterações na composição da microbiota intestinal estão relacionadas a certas doenças neurológicas [18–20].

No entanto, o mecanismo detalhado de como as bactérias intestinais regulam a progressão da doença, influenciando a comunicação ao longo do eixo intestino-cérebro, requer uma investigação mais aprofundada.

Nos últimos 20 anos, a maioria dos estudos da microbiota intestinal empregou modelos de roedores para investigar o papel do eixo microbiota-intestino-cérebro. No entanto, o organismo versátil, Drosophila, é um poderoso modelo de investigação que permite aos cientistas investigar os mecanismos pelos quais os micróbios intestinais afectam as funções cerebrais (Figura 1a,b). Os micróbios podem ser marcados geneticamente com uma proteína fluorescente, assim, sua distribuição no trato digestivo da Drosophila pode ser visualizada (Figura 1c) [21,22].

Figura 1. Comparação dos tratos digestivos humano e Drosophila. (a) Trato digestivo de humanos e Drosophila. As regiões funcionais do trato digestivo em Drosophila e em humanos são semelhantes e incluem o esôfago, intestino médio anterior e posterior (intestino delgado), intestino grosso (intestino posterior) e estômago (colheita). (b) Sub-regiões do trato digestivo da Drosophila representando o intestino anterior, o intestino médio e o intestino posterior.

Foregut contém colheita e proventrículo. O intestino médio é ainda dividido em regiões R1-R5. (c) Lactobacillus marcado com GFP foi alimentado com Drosophila adulta e imagens confocais mostram a distribuição de Lactobacillus (verde) em diferentes regiões do trato digestivo. As imagens ampliadas das regiões de corte, R2, R4 e R5 são mostradas em c1 a c4. A amostra foi imunocorada com um anticorpo anti-integrina-PS (vermelho). Barra de escala, 500 μm.

2. Comportamentos inatos da Drosophila
Acredita-se que os comportamentos inatos sejam programados no cérebro do animal e geneticamente codificados, e não requerem experiência prévia para serem executados adequadamente. Os comportamentos inatos são altamente adaptáveis ​​ao estado interno dos animais e ao ambiente externo, o que permite aos animais modificar seus comportamentos de acordo com as diferentes condições ambientais [23].

Drosophila é um excelente modelo animal para estudar os mecanismos moleculares dos comportamentos inatos humanos, uma vez que existem algumas semelhanças nos fenótipos comportamentais entre moscas e humanos. Em Drosophila, uma variedade de comportamentos inatos foram estudados, como comportamento de acasalamento, comportamento agressivo, atividade sono/locomotora e comportamento relacionado à temperatura [3,24–28].

Além disso, o genoma da Drosophila é cerca de 60% homólogo ao dos humanos e aproximadamente 75% dos genes relacionados a doenças humanas também possuem homólogos em moscas [29]. Por exemplo, no comportamento do sono, a sinalização da dopamina regula a vigília não apenas em Drosophila, mas também em humanos [30]. Aqui, apresentamos alguns comportamentos inatos cruciais da Drosophila e discutimos sua relação com a microbiota intestinal (Tabela 1).

2.1. Microbiota intestinal e comportamento de acasalamento

O comportamento de acasalamento em Drosophila macho inclui uma série de etapas: progressão em direção à fêmea (orientação), perseguir a fêmea (seguir), tocar o abdômen da fêmea (bater), extensão unilateral da asa e vibração (cantar), lamber a genitália da fêmea, agarrar para as costas da fêmea (tentativa de cópula) e cópula final [3,26]. Uma mosca macho tenta acasalar com uma fêmea virgem e a medição do entusiasmo sexual da mosca macho pela fêmea é chamada de índice de cortejo (CI).

IC é o tempo gasto pelo macho da Drosophila no namoro dividido pelo tempo total do experimento. O conhecido circuito neural que regula o comportamento de acasalamento é composto de neurônios que expressam infrutíferos (fru). Os neurônios que expressam fru, incluindo aferentes sensoriais primários e interneurônios centrais, como os neurônios do cluster P1 que desencadeiam o namoro, podem formar a porção central do circuito de namoro masculino (50).

Pelo menos três estudos relataram que a microbiota intestinal não afeta o comportamento de cortejo em Drosophila [33,35,51]; no entanto, deve-se notar que cada estudo utilizou diferentes moscas do tipo selvagem e empregou diferentes métodos para gerar moscas livres de germes.

Contrariamente a estes estudos, Heys et al. mostraram que a microbiota intestinal neutraliza a estratégia de exogamia masculina, alterando a sinalização sexual feminina, o que leva à redução da transferência de espermatozoides de moscas machos [31]. A exogamia em Drosophila aumenta a diversidade genética na prole, melhora a defesa imunológica e pode ser afetada pela microbiota do hospedeiro [31,52].

Um estudo anterior mostrou que em 1- e 3-dia pós-acasalamento, o padrão de expressão gênica no tecido da cabeça da mosca é alterado, o que afeta o comportamento da mosca, incluindo comportamento alimentar, metabolismo e produção de ovos (pós -comportamento de acasalamento) [53]. Delbare et al. realizaram uma análise de RNA-seq em larga escala de moscas axênicas / convencionais virgens e acasaladas e relataram que, em fêmeas acasaladas, os transcritos envolvidos na regulação da reprodução e das funções neuronais são diferencialmente abundantes, dependendo da microbiota das fêmeas (32).

Além disso, o estado da microbiota do macho afetou a fecundidade tanto nas fêmeas convencionais como nas axênicas; no entanto, afetou os perfis transcricionais apenas em mulheres axênicas, mas não em mulheres convencionais.

2.2. Microbiota intestinal e comportamento agressivo

O comportamento agressivo, amplamente observado no reino animal, é crítico para a sobrevivência e a reprodução [54]. Em Drosophila, o comportamento agressivo inclui ameaça de asa, boxe, batidas com a perna dianteira, investidas e cabeçadas [2,33]. Jia et al. descreveram um protocolo para analisar o comportamento agressivo em moscas.

Neste ensaio, duas moscas machos ou fêmeas (5-7 dias de idade) são colocadas numa câmara de combate, que é então rapidamente coberta com uma lamela de vidro de 20 mm × 20 mm. A luta durante os 30 minutos é registrada por uma câmera. O comportamento agressivo é analisado contando o número de investidas nos machos e cabeçadas nas fêmeas e avaliando a frequência de investidas/latência de luta. A frequência de investida é definida como o número de investidas por minuto após o início da investida, enquanto a latência de combate é definida como a duração entre o início do registro e a primeira investida [33].

Estudos sugerem que os comportamentos agressivos se coordenam com estímulos visuais, olfativos, gustativos, mecanossensoriais e auditivos. Essas entradas integram-se ao corpo do cogumelo cerebral (MB), ao corno lateral e às regiões centrais do complexo e, finalmente, conduzem as saídas motoras através dos músculos das asas e das pernas.

Estudos também sugerem que neurotransmissores e neuropeptídeos, como octopamina, serotonina, dopamina, acetilcolina e neuropeptídeo F (NPF), também desempenham papéis importantes em comportamentos agressivos [54].

Estudos recentes mostraram que a microbiota intestinal específica está associada à agressividade em moscas. Jia et al. usou hipoclorito de sódio e uma série de protocolos de lavagem para gerar moscas axênicas [33].

Em comparação com as moscas convencionais (Canton-S), as moscas axênicas apresentaram menos comportamento agressivo entre machos, indicando que as moscas livres de germes reduziram a agressão entre machos. Além disso, bactérias comensais como Acetobacter, Lactobacilli e Enterococci promoveram comportamentos agressivos em moscas axênicas por recolonização microbiana. Os autores também relataram uma redução de 73% nos níveis de octopamina em moscas livres de germes, e a manipulação genética da atividade neuronal octopaminérgica restaurou o comportamento agressivo em moscas axênicas.

O mesmo estudo também relatou dois fatores-chave envolvidos na regulação da agressão através da expressão da octopamina. Um deles foi o período crítico de desenvolvimento durante a fase larval (48-98 horas após a postura dos ovos), no qual a suplementação com uma dieta rica em leveduras restaurou o comportamento agressivo nas moscas axênicas. O outro fator foi a nutrição, pois também é importante para a expressão da octopamina, e fornecer nutrição adequada às moscas axênicas normalizou o comportamento agressivo.

Essas descobertas demonstram que a microbiota intestinal e a nutrição durante o período crítico de desenvolvimento afetam a expressão da octopamina, que regula a agressão em homens adultos [33].
2.3. Microbiota intestinal e sono e atividade locomotora
O sistema Drosophila Activity Monitor (DAM) é usado para estudar o comportamento de sono e locomoção em moscas [55]. Neste ensaio, as moscas são alojadas em condições de ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão [56,57].

O aparelho DAM tem três componentes principais: (1) um tubo de vidro no qual uma única mosca pode se mover livremente, (2) um feixe infravermelho direcionado através do ponto médio do tubo de vidro e (3) um computador para registrar o comportamento. resultados [55]. No ensaio de comportamento de sono/locomotor, o sistema DAM registra quebras de feixe infravermelho devido a moscas andando em tubos de vidro para detectar sono ou locomoção [58].

O conhecido circuito relacionado ao comportamento do sono no cérebro da Drosophila é composto por neurônios circadianos. A luz estimula um grupo de grandes neurônios ventro-laterais (l-vLNs), que liberam fatores de dispersão de pigmentos (PDFs) para estimular um grupo de pequenos neurônios ventro-laterais (s-vLNs). Finalmente, os s-vLNs regulam o centro de controle locomotor do cérebro, os corpos elipsóides, para inibir o comportamento do sono.

Tanto l-vLNs quanto s-vLNs expressam receptores GABAA, que podem inibir a vigília através de neurônios GABAérgicos que promovem o sono. O MB também é uma importante região do cérebro que regula o sono através da subunidade catalítica da proteína quinase A, uma enzima ativada pela via do AMPc relevante para o sono (59). A atividade locomotora é importante para a sobrevivência da Drosophila e é controlada por hormônios, que também podem ser analisados ​​pelo sistema DAM. King et al.

relataram recentemente a presença de um circuito peptidérgico que liga o relógio circadiano à atividade locomotora. Os s-vLNs liberam PDFs que estimulam os neurônios do relógio DN1 que, por sua vez, estimulam os neurônios pars intercerebralis (PI) positivos para DH44. Neurônios PI DH 44- positivos estimulam neurônios SEZ positivos para hugina, que finalmente liberam o neuropeptídeo hugina para o circuito motor no cordão nervoso ventral que regula a atividade locomotora em Drosophila (60).

O efeito da microbiota intestinal no comportamento do sono em Drosophila permanece obscuro. Selkrig et al. usaram a cepa isogênica de D. melanogaster Canton-S livre de Wolbachia como as moscas do tipo selvagem e realizaram ensaios de sono e comportamento locomotor. Os autores geraram moscas livres de germes Canton-S livres de Wolbachia lavando os ovos com NaClO e denominaram a primeira geração como F1 e a próxima geração como F2.

Seus dados revelaram que nem as moscas F1 livres de germes nem as moscas F2 livres de germes apresentam qualquer mudança significativa no comportamento do sono. Além disso, embora as moscas F1 livres de germes não apresentassem qualquer alteração no comportamento locomotor, as moscas F2 livres de germes exibiram um ligeiro aumento na atividade locomotora em comparação com as moscas convencionais [35].

Outro estudo de Silva et al. empregou Canton-S e W1118 como moscas do tipo selvagem e usou NaClO para lavar os ovos da mosca por 3 a 5 minutos para gerar moscas axênicas (61). Seus resultados revelaram que, em comparação com as moscas convencionais, as moscas axênicas tendem a dormir por mais tempo e apresentam recuperação reduzida do sono após a privação do sono [34]. No entanto, o estado da microbiota intestinal das moscas teve um pequeno efeito na ritmicidade circadiana da atividade locomotora.

Silva e outros. e Selkrig et al. focado na compreensão do papel da microbiota intestinal na regulação do sono e da locomoção da Drosophila. Schretter et al. propuseram um possível mecanismo para explicar a relação entre microbiota intestinal e locomoção/sono. Neste estudo, a cepa Oregon-R foi usada como tipo selvagem, e as moscas receberam a dieta suplementada com antibióticos para gerar moscas tratadas com antibióticos (ABX).

Os resultados mostraram que as moscas ABX aumentaram a velocidade de caminhada, melhoraram as atividades diárias e reduziram o sono durante o dia. Os autores também relataram que a enzima xilose isomerase, que catalisa a isomerização reversível de certos açúcares presentes no Lactobacillus brevis, reduz a atividade locomotora ao modular o metabolismo do açúcar através da estimulação dos neurônios octopaminérgicos; no entanto, esta enzima não afeta o sono [36].

2.4. Microbiota intestinal e comportamentos relacionados à temperatura

A temperatura ambiental afeta fortemente a fisiologia dos ectotérmicos, como a Drosophila. O comportamento de preferência de temperatura (as moscas evitam ambientes quentes ou frios) e a tolerância a temperaturas quentes ou frias são importantes para a sobrevivência em Drosophila. O ensaio de gradiente de temperatura é usado para estudar a preferência de temperatura em moscas.

Diferentes estudos usaram dispositivos de gradiente de temperatura distintos, mas o princípio básico é o mesmo: um lado do dispositivo está em baixa temperatura e o outro lado produz uma temperatura alta. Ao colocar uma folha de alumínio entre os dois lados, é produzido um gradiente de temperatura. As moscas são colocadas na folha de alumínio e podem escolher a temperatura preferida [62,63].

Existem duas maneiras diferentes de estudar o comportamento de evitar a temperatura: uma é usar o ensaio de gradiente de temperatura (descrito acima) e a outra é usar a máquina de ensaio de duas opções.

A máquina de ensaio de duas opções contém quatro quadrantes construídos com um chip de resfriamento termoelétrico e uma folha de alumínio. Ao realizar o ensaio de evitação de temperatura, a máquina de ensaio de duas opções definiria uma temperatura constante (25 ◦C) em um conjunto de quadrantes diagonais, e os outros quadrantes diagonais foram ajustados na temperatura experimental, que depende da análise [64] .

A recuperação do coma frio é um protocolo para estudar o comportamento de tolerância à temperatura. Neste ensaio, as moscas são imersas em um banho de água-glicol ajustado a -3,5 ◦C (dependendo do desenho experimental) para estresse por frio ou expostas a 38,5 ◦C de temperatura (dependendo do desenho experimental) para estresse por calor, após o que o as moscas podem se recuperar e o tempo de recuperação é medido [37,65].

Estudos recentes sugeriram que a microbiota intestinal afeta fortemente a tolerância à temperatura nas moscas da fruta. Henrique et al. gerou moscas axênicas por decloração, na qual os ovos da mosca foram imersos em hipoclorito a 2,7% por 2 min, etanol a 70% por 2 min e finalmente lavados duas vezes em água autoclavada [37]. Após a descloração, as moscas foram criadas em alimentos autoclavados. Os seus resultados sugerem que a tolerância ao frio das moscas axénicas é defeituosa em comparação com a das moscas convencionais. No entanto, a tolerância ao calor não foi afetada nas moscas axênicas. Isto sugere que a perturbação da microbiota diminui a capacidade de lidar com o stress do frio [37]. Estudos em outras espécies de Drosophila, como D. subobscura, sugerem que moscas convencionais expostas a condições de calor moderado (<34 ◦C) exhibit higher thermal tolerance than axenic flies [38].

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