Subunidade catalítica da proteína quinase dependente de DNA (DNA-PKcs) impulsiona a progressão da doença renal crônica em ratos machos Ⅱ

A fosforilação de TAF7 mediada por DNA-PKcs agrava a fibrose renal

Para dissecar ainda mais os possíveis mecanismos moleculares pelos quais as PKcs do DNA regulam odesenvolvimento de DRC, a fosfoproteômica foi realizada para revelar possíveis substratos de DNA-PKcs. Como mostrado na Fig. 5a, a maioria das proteínas diferencialmente fosforiladas eram proteínas nucleares. Oníveis de fosforilaçãode apenas 6 proteínas dessas proteínas foramdiminuiu significativamente nos tecidos renaisde camundongos DNA-PKcs -/- em comparação com camundongos WT, como mostrado pelos gráficos do vulcão (Fig. 5a). A análise do mapa de calor de proteínas diferencialmente fosforiladas entre camundongos DNA-PKcs -/- e controles WT mostrou que os níveis de fosforilação dos locais indicados de Slc4a1, Ampd2, Hbb-b1, Gas2, Ank1 e TAF7 diminuíram significativamente após o nocaute de DNA-PK (Fig. 5a). Através da análise de localização subcelular e do knockdown destas proteínas, descobrimos que o DNA-PKcs medeia a fibrose renal, talvez através da fosforilação do TAF7, que é uma subunidade do TFIID. Estudos de coimunoprecipitação revelaram uma possível interação direta entre DNA-PKcs e TAF7 (Fig. 5b). O acoplamento proteína-proteína entre DNA-PKcs e TAF7 foi analisado através de um banco de dados online ClusPro39,40. Os resultados de acoplamento mostraram uma possível interação direta entre DNA-PKcs e TAF7, e a serina do sítio 213-do TAF7 é um dos sítios mais próximos, talvez de ligação ao DNA-PKcs (Figura 6a suplementar). Um ensaio de quinase in vitro foi realizado para analisar se o TAF7 foi fosforilado diretamente por DNA-PKcs. Os produtos do ensaio de quinase foram analisados ​​por espectrometria de massa. Os resultados mostraram que os locais S213, T137, Y24 e S171 do TAF7 humano foram fosforilados por DNA-PKcs (Figura 6b suplementar). Além disso nossos resultados revelaram uma associação positiva entre os níveis proteicos de p-DNA-PKcs e TAF7 em humanosRim DRCtecidos via co-coloração de imunofluorescência de p DNA-PKcs com TAF7 (Fig. 5c).

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Um estudo anterior descobriu que o peso molecular calculado do TAF7 é de cerca de 40 kDa, mas o TAF7 fosforilado é de aproximadamente 55 kDa41. Os resultados de Western blot e coloração imuno-histoquímica mostraram que os níveis de TAF7 foram grandemente induzidos por UUO nos tecidos renais dos controles WT (Fig. 5d e Fig. Complementar 6d). O nocaute de DNA-PKcs inibiu a fosforilação de TAF7 nos modelos de linha de base e UUO em comparação com os controles WT (Fig. 5d). A fosforilação de TAF7 em camundongos UUO também foi confirmada por Phos-tag SDS-PAGE42 (Fig. Complementar 6c). Resultados semelhantes também foram observados no modelo UIR (Fig. 5e). O tratamento com o inibidor de DNA-PKcs NU7441 também inibiu a fosforilação regulada positivamente de TAF7 induzida por UIR em camundongos (Fig. 5f). Além disso, os níveis de proteína de TAF7 analisados ​​por Western blot mostraram que tanto o nocaute de DNA-PKcs em células HK-2 (Fig. 5g) quanto o tratamento com NU7441 em células HK2 (Fig. 5h) ou NRF-49F (Fig. 5i) inibiu a fosforilação regulada positivamente de TAF7 induzida por TGF 1 in vitro.

Como o DNA-PKcs está envolvido na fosforilação do TAF7 na fibrose renal, examinamos se a deficiência de TAF7 pode afetar a desdiferenciação das células epiteliais renais ou a ativação e proliferação de fibroblastos intersticiais induzidos pelo TGF 1. Células mPTC knockout para TAF7 e NRK{{5 }}Células F foram geradas usando CRISPR/Cas9, e a construção bem-sucedida de células knockout TAF7 foi confirmada por Western blot (Figura 6e suplementar). Nossos resultados mostraram que o nocaute de TAF7 melhorou a desdiferenciação das células epiteliais renais, como mostrado pelos baixos níveis de produção de FN e colágeno I após exposição ao TGF 1 (Fig. 5j, l). Da mesma forma, o nocaute de TAF7 embotou o fenótipo profibrótico de células NRF-49F induzidas por TGF 1, como mostrado pelos baixos níveis de produção de FN (Fig. 5k), colágeno I (Fig. 5m), -SMA (Fig. 5n ), bem como baixos níveis de coloração EdU (Fig. 5o) em células TAF7-/-. Para determinar se a superexpressão de TAF7 em células epiteliais renais é suficiente para conduzir um fenótipo profibrótico, células HK -2 ou células NRK49F foram transfectadas com um TAF7 humano ou com os plasmídeos de superexpressão de seu mutante. Os resultados do Western blot mostraram que o fenótipo profibrótico das células HK -2 ou NRF49F foi de fato aumentado pela superexpressão de TAF7 ou seus mutantes (Figura 6h, j suplementar). No entanto, os efeitos profibróticos do TAF7 foram quase totalmente bloqueados pelo nocaute de DNA-PKcs nas células HK -2 (Figura 6i suplementar). Além disso, examinamos se a deficiência de TAF7 pode afetar os efeitos profibróticos do DNA-PKcs. Curiosamente, a deficiência de TAF7 inibiu os efeitos profibróticos da superexpressão de DNA-PKcs (Fig. Complementar 6f) e bloqueou os efeitos anti-profibróticos de NU7441 em células mPTC (Fig. Complementar 6g). Recentemente, Wang S, et al. descobriram que DNA-PKcs citoplasmáticos estavam aumentados e interagiam com Fis1 e o fosforilavam em Thr34 em seu motivo TQ, o que aumentou a afinidade de Fis1 por Drp1 e induziu fragmentação mitocondrial em AKI43. Em nosso estudo, os resultados da análise da proteína de extração nuclear mostraram que o DNA-PKcs estava principalmente localizado e aumentado no núcleo dos rins de camundongos UUO, o que era diferente do modelo AKI (Fig. Complementar 6k). E derrubar Fis1 promoveu a resposta profibrótica em células epiteliais tubulares renais desafiadas com TGF 1, sugerindo que Fis1 não mediou o papel profibrótico de DNA-PKcs na DRC (Figura 6l Complementar). Tomados em conjunto, estes dados indicaram que a fosforilação de TAF7 mediada por DNA-PK agrava a fibrose renal.

TAF7 promove ativação de mTORC1 regulando positivamente a expressão de RAPTOR

Para investigar os mecanismos dos efeitos profibróticos do TAF7, RNA-Seq foi realizado para analisar alterações transcriptômicas em células NC e TAF-/- mPTC tratadas com ou sem TGF 1. Os resultados de RNA-Seq mostraram que o nocaute de TAF7 melhorou o TGF {{5} } induziu expressão gênica associada à fibrose em mPTCs (Fig. Complementar 7a, b). A análise de enriquecimento da via KEGG mostrou que a via de sinalização mTOR era a principal via entre as células TAF -/- e NC mPTC sem tratamento com TGF 1 (Fig. 6a). A análise de enriquecimento do conjunto de genes (GSEA) revelou uma regulação positiva significativa da via de sinalização mTOR após o tratamento com TGF 1, que foi significativamente diminuída após o nocaute de TAF7 em células mPTC em comparação com células de controle NC (Fig. 6a). A análise do mapa de calor da sinalização mTOR demonstrou que o RPTOR (RAPTOR), um regulador positivo do mTORC144,45, foi aumentado pelo tratamento com TGF 1, que foi inibido pelo nocaute do TAF7 nas células mPTC (Fig. 6b).

Os níveis de proteína de RPTOR e a fosforilação de mTOR aumentaram significativamente após o tratamento com TGF 1 em células mPTC, conforme analisado por Western blot. No entanto, a deficiência de TAF7 diminuiu os níveis proteicos de RPTOR e a fosforilação de mTOR induzida por TGF 1 em células mPTC em comparação com os controlos NC (Fig. 6c). Os níveis de mRNA de mTOR e seus parceiros proteicos, incluindo Raptor, Rictor e Mlst8, foram analisados ​​por qRT-PCR, e os resultados mostraram que o tratamento com TGF 1 regulou positivamente os níveis de mRNA de Rptor, Rictor e Mlst8, mas não de mTOR. A deficiência de TAF7 diminuiu significativamente os níveis de mRNA de Raptor com e sem tratamento com TGF 1 em células mPTC em comparação com células de controle NC, mas não Rictor, Mlst8 ou mTOR (Fig. Complementar 7c). Da mesma forma, a deficiência ou inibição de DNA-PKcs diminuiu significativamente os níveis de mRNA deTecidos renais de raptorinade camundongos UUO e camundongos UIR (Fig. Complementar 7d, e). Além disso, construímos dois resíduos diferentes 213 mutantes de sítio de serina de TAF7, TAF7- S213D e TAF7-S213A para analisar a fosforilação da serina 213 de TAF7 na ativação transcricional de Raptor humano induzida por TGF 1 em Células HK-2. Os resultados do ensaio de luciferase mostraram que a superexpressão de todos esses mutantes TAF7 aumentou a ativação transcricional do Raptor humano, embora a atividade relativa da luciferase do grupo TAF7- S213A tenha sido menor que a do TAF7-WT e TAF{ {15}}Grupos S213D (Fig. 6d). Além disso, os resultados do ensaio ChIP mostraram que o TAF7 poderia ligar-se diretamente ao promotor Rptor (Fig. 6e). Estes resultados indicaram que o TAF7 medeia a ativação transcricional do RPTOR induzida pelo TGF 1, talvez não apenas através da fosforilação do resíduo 213. Além disso, nossos resultados mostraram que os níveis proteicos do RPTOR e a fosforilação do mTOR foram ambosaumentado nos tecidos renaisde camundongos UUO e UIR e diminuíram significativamente após o nocaute de DNA-PKcs em camundongos basais e modelo (Fig. 6f-i). Resultados semelhantes também foram observados em resposta a células HK -2 knockout de DNA-PKcs e tratamento NU7441 em células NRF -49F (Fig. 6j, k). Além disso, os resultados do Western blot mostraram que os níveis de proteína de RPTOR e a fosforilação de mTOR aumentaram após a superexpressão de DNA-PKcs ou TAF7 (Figura 7f, g suplementar). Além disso, o knockdown do RPTOR inibiu marcadamente a fosforilação do mTOR induzida pelo TGF 1 (Fig. Complementar 7h). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a fosforilação de TAF7 mediada por DNA-PKcs promove a ativação de mTORC1 regulando positivamente a expressão de RPTOR.

Figura 6|A fosforilação de TAF7 mediada por DNA-PKcs promove a ativação de mTORC1 regulando positivamente a expressão de RPTOR. um RNA-seq mostrando que a sinalização mTOR (indicada pela fonte vermelha) foi o principal fator de sinalização diferencialmente expresso entre os grupos TAF7 -/- e NC. GSEA mostrou que a sinalização mTOR foi regulada positivamente no grupo NC + TGF 1 e suprimida no grupo TAF7-/- + TGF 1 (n=2), tratamento com TGF 1 (5 ng/ml) por 24 h. b Imagem do mapa de calor mostrando que o Rptor (indicado pela fonte vermelha) estava diminuído nos grupos TAF7-/- em comparação com os grupos NC com ou sem tratamento com TGF 1 (5 ng/ml) por 24 h (n=2 de cada grupo). c Níveis de proteína de RPTOR, mTOR e mTOR fosforilado analisados ​​​​por Western blot em mPTCs TAF7-/- e NC tratados com TGF 1 (5 ng/ml) por 24 h. As barras representam resultados de quantificação (média ± DP, n=3 experimentos independentes). d Ensaio de repórter de luciferase em células HK-2 com TGF 1 (5 ng/ml) durante 24 h. As barras representam os resultados de 3 experimentos independentes (média ± DP). O ensaio ChIP foi realizado para analisar a ligação do TAF7 ao promotor do Raptor. As barras representam resultados de quantificação (média ± DP, n=3 experimentos independentes). f Os níveis proteicos de RPTOR, mTOR e mTOR fosforilado foram analisados ​​por Western blot emtecidos renaisde camundongos de controle DNA PKcs-/- e WT submetidos a UUO (dia 7) ou UIR (dia 21) (g), NU7441 (40 mg/kg) e camundongos de tratamento com veículo submetidos a UUO (h) ou UIR (i), em células DNA PKcs-/- ou NC HK-2 (j), NU7441 (0,1 μM) ou células NRK{8}}F de tratamento de veículo (k) tratadas com TGF 1 (5 ng /ml) por 24 horas. As barras representam resultados de quantificação (média ± DP, n=6 ratos de cada grupo en=3 experimentos independentes para modelos celulares). ANOVA unidirecional seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey foi usada para determinar os valores de p para d, e. ANOVAs bidirecionais seguidas pelo teste de comparações múltiplas de Šídák foram usadas para determinar os valores de p para c, f – k. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.

A inibição da DNA-PK corrige a reprogramação metabólica in vivo e in vitro

De acordo com vários estudos anteriores9,46, a ativação aberrante de mTORC1 promove a progressão da fibrose renal ao mediar a reprogramação metabólica emrins fibróticos. Assim, examinamos se a inibição de DNA-PK ou TAF7 corrige a reprogramação metabólica em rins fibróticos. Com base na análise de RNA-Seq de alterações transcriptômicas em células NC tratadas com TGF 1- e TAF-/− mPTC, a análise de enriquecimento da via KEGG mostrou que a via de sinalização metabólica era uma das vias mais diferencialmente expressas entre TGF {{4} } células TAF-/- e NC mPTC tratadas (Fig. 7a). Além disso, a GSEA revelou uma regulação positiva significativa da fosforilação oxidativa e da via de oxidação dos ácidos gordos (FAO) após tratamento com TGF 1 em células mPTC knockout para TAF7 em comparação com células de controlo NC (Fig. 7a). A via da glicólise diminuiu significativamente quando o TAF7 foi eliminado nos mPTCs em comparação com o controle NC (Fig. 7a). Estes resultados indicaram que a deficiência de TAF7 corrige a reprogramação metabólica induzida por TGF 1- em células PTC.

Compreender o papel das DNA-PKcs na regulação da reprogramação metabólica em rins fibróticos. Primeiro, os níveis de proteína e mRNA das principais enzimas envolvidas na oxidação de ácidos graxos (CPT1, CPT2, ACOX1 e ACOX2) foram analisados ​​por Western blot e qRT-PCR. Os resultados mostraram que a expressão destas enzimas foi significativamente reduzida nos rins de camundongos WT sob condições UUO ou UIR, mas sua expressão foi significativamente restaurada em camundongos knockout para DNA-PKcs (Fig. 7b, c e Fig. Complementar 8). Em segundo lugar, a morfologia e a função mitocondrial são necessárias para a fosforilação oxidativa, e a microscopia eletrônica revelou fragmentação óbvia das mitocôndrias nas células dos túbulos renais de camundongos WT induzidas por UUO, que foi significativamente melhorada nas células dos túbulos renais de camundongos DNA-PKcs -/- (Fig. 7f). Estes resultados revelaram que a fosforilação oxidativa anormal e o metabolismo dos ácidos graxos induzidos pelo UUO em camundongos WT são melhorados pelo nocaute de DNA-PKcs.

A glicólise é uma característica da fibrose renal e promove o desenvolvimento de fibrose renal. Os níveis proteicos de hexoquinase 2 (HK2) e lactato desidrogenase A (LDHA), que são enzimas limitantes da glicólise, foram analisados ​​por Western blot. Os resultados mostraram que os níveis de HK2 e LDHA foram significativamente regulados positivamente nos tecidos renais de camundongos UUO e UIR, indicando aumento da atividade glicolítica em rins fibróticos. Em contraste, a glicólise foi significativamente inibida em tecidos renais de camundongos deficientes em DNA-PKcs em comparação com camundongos WT em ambos os modelos UUO e UIR, como indicado por níveis mais baixos de HK2 e LDHA (Fig. 7d, e). Ensaios de taxa de acidificação extracelular (ECAR) foram realizados para analisar a atividade glicolítica em células TGF 1-DNA-PKcs-/− HK-2 tratadas com TGF e células NRK-49F tratadas com NU-49 em vitro. Tanto o nocaute de DNA-PKcs quanto o tratamento com NU7441 diminuíram significativamente o ECAR, que foi regulado positivamente nas células tratadas com TGF 1- em comparação com as células de controle (Fig. 7g-h). O nocaute de TAF7 -/- também diminuiu significativamente a regulação positiva de ECAR em mPTCs induzidos por TGF 1 (Fig. 7i). Além disso, os níveis de lactato extracelular no meio de cultura de células tratadas com DNA-PKcs -/- e NU 7441- também diminuíram (Fig. 7j, k).

Para entender como a reprogramação metabólica foi melhorada em camundongos DNA-PKcs -/-, usamos perfis metabolômicos para analisar alterações metabólicas após cirurgia UUO (Fig. 8a). O UUO induziu comprometimento do metabolismo da glicose nos rins de camundongos WT, como evidenciado pela regulação negativa de metabólitos da glicose, como o piruvato, nos rins WT UUO, que foi restaurado por nocaute de DNA-PKcs (Fig. 8a). Além disso, também foi observado aumento do acúmulo de lactato nos rins de camundongos WT submetidos à UUO, indicando uma mudança metabólica da fosforilação oxidativa para aumento da glicólise nas células renais. No entanto, nos rins lesionados de camundongos DNA-PKcs -/-, a glicólise foi significativamente inibida (Fig. 8a). Além disso, o acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa conjugados com carnitina, incluindo lauroil carnitina (Fig. 8a) e miristoil carnitina (Fig. 8a), foi observado nos rins de camundongos WT UUO, sugerindo defeitos no metabolismo dos ácidos graxos. Em contraste, o nocaute de DNA-PKcs corrigiu amplamente todas essas anormalidades induzidas pelo UUO. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a inibição de DNA PK ou TAF7 corrige a reprogramação metabólica induzida por lesão ou TGF 1 in vivo e in vitro.

Discussão

A desdiferenciação epitelial e a ativação e proliferação de miofibroblastos, todas iniciadas por lesão celular, promovem a progressão da DRC2. Embora a resposta ao dano ao DNA (DDR) frequentemente se correlacione com a lesão epitelial renal47, pouco se sabe sobre seu papel potencial na desdiferenciação epitelial e na ativação de miofibroblastos na DRC progressiva. Neste estudo, nossos resultados revelaram que a expressão de DNA PKcs, uma subunidade catalítica da proteína quinase dependente de DNA, aumentou em rins fibróticos e promoveu o desenvolvimento de DRC. Embora DNA-PKcs seja ativado por quebras de fita dupla de DNA (DSBs)24,25 ou ROS26, nossos resultados mostraram que a expressão de DNA-PKcs também foi ativada pela sinalização TGF 1-SMAD, enquanto o nocaute de DNA-PKcs inibiu SMAD2/SMAD3 . Esses resultados sugerem uma nova via possível mediando a ativação da sinalização TGF 1-SMAD na fibrose.

Em seguida, geramos camundongos knockout para o gene prkdc globais. Nossos resultados revelaram que a deleção de DNA-PKcs atenuou a lesão tubular renal e a progressão da fibrose intersticial renal em modelos de camundongos UUO e UIR. Não podemos concluir que a DNA-PK promova fibrose renal independente dos linfócitos, já que o fenótipo mais proeminente dos camundongos DNA-PKcs −/− é a deficiência de linfócitos . Para excluir o efeito potencial da deficiência de linfócitos, construímos células epiteliais tubulares renais proximais com nocaute específico de DNA-PKcs in vivo usando camundongos knock-in CRISPR/cas9. Nossos resultados revelaram que a deleção específica do tubular renal de DNA-PKcs também dificultou a progressão da fibrose intersticial renal na UUO. Além disso, nossos resultados também mostraram que a deficiência de DNA-PKcs preservou o fenótipo das células epiteliais tubulares e regulou a ativação de fibroblastos intersticiais in vitro. Estes resultados indicam que o DNA-PKcs medeia a desdiferenciação epitelial e a ativação de miofibroblastos, provavelmente sem qualquer relação direta com a deficiência de linfócitos. Além disso, investigamos os efeitos antifibróticos de um inibidor altamente específico de DNA-PKcs, NU7441, e os resultados mostraram que o tratamento com NU7441 atenuou marcadamente a progressão da fibrose intersticial renal em modelos de camundongos UUO e UIR. NU7441 é um inibidor parcial de DNA-PK em doses fisiológicas. Um estudo anterior indicou que o tratamento com NU7441 não afetou significativamente a função das células B em camundongos adultos33. Além disso, confirmamos a ação específica do NU7441 no DNA-PKcs tratando camundongos knockout para DNA-PKcs com NU7441 no modelo de camundongo UUO. Estes resultados sugerem uma potencial transformação do NU7441 para o tratamento clínico da DRC, embora sejam necessárias mais pesquisas.

Nossos resultados mostraram que a deficiência de DNA-PKcs não agravou os DSBs in vivo e in vitro, sugerindo que o DNA-PKcs medeia a lesão renal e a fibrose intersticial renal, provavelmente não através do seu papel na DDR. A análise fosfoproteômica mostrou que a fosforilação do TAF7 estava diminuída nos tecidos renais de camundongos DNA-PKcs -/-. A deficiência de TAF7 inibiu o fenótipo profibrótico de células epiteliais renais e fibroblastos induzidos por TGF 1. Os efeitos profibróticos de TAF7 foram quase totalmente bloqueados pela deficiência de DNA-PKcs em células epiteliais renais. Nossos resultados indicam que o TAF7 é um substrato para a atividade da DNA-PKcs quinase e que a fosforilação do TAF7 mediada por DNA-PKcs agrava a fibrose renal.

Os resultados do RNA-Seq mostraram que o TAF7 promove a ativação do mTORC1 regulando positivamente a expressão do Raptor, que é um regulador positivo do mTORC149,50. Os resultados do fosfoproteoma mostraram que a fosforilação do TAF7 na serina -213 foi significativamente diminuída nos rins de camundongos DNA-PKcs -/-, em comparação com os controles WT. A análise por espectrometria de massa indicou que os locais S213, T137, Y24 e S171 do TAF7 humano foram fosforilados por DNA-PKcs in vitro. Além disso, a transfecção de diferentes mutantes TAF7, incluindo TAF7-WT, TAF7-S213D e TAF7-S213A, aumentou a ativação transcricional de Rptor humano em células HK-2. Estes resultados indicam que o TAF7 medeia a ativação transcricional do Rptor induzida pelo TGF 1, provavelmente não apenas através da fosforilação do seu sítio 213-. O TAF7 não é um fator de transcrição central, mas interage com outros TAFs, como o TAF141,51, e regula as atividades enzimáticas dos fatores de transcrição, o que poderia explicar por que a superexpressão do TAF7 por si só não ativou a transcrição do RPTOR humano em HK{{28} } células sem tratamento com TGF 1. Vários resíduos de serina do TAF7 podem ser fosforilados para ativar ou inibir a transcrição . Por exemplo, um estudo anterior descobriu que a fosforilação do TAF7 na serina 264 interrompeu a ligação do TAF7 ao TAF1, resultando na regulação positiva da transcrição da ciclina D141. Além da transcrição1-dependente de TAF, o TAF7 também regula a transcrição1-independente de TAF51. Neste estudo, os resultados do ensaio ChIP demonstraram que o TAF7 poderia se ligar diretamente ao promotor Rptor, sugerindo que o TAF7 talvez colabore com outros fatores de transcrição para iniciar a expressão do Rptor. Embora os mecanismos de regulação positiva transcricional de Rptor mediada por TAF precisem de mais pesquisas, nossos resultados indicam que DNA-PKcs medeia a fosforilação de TAF7 para promover a ativação de mTORC1 regulando positivamente a expressão de Rptor.

Vários estudos anteriores relataram que a sinalização mTORC1 é ativada em células epiteliais desdiferenciadas e miofibroblastos de rins fibróticos9,52. Embora também tenha sido relatado que DNA-PK fosforila e ativa a sinalização AKT/mTOR em células tumorais em resposta a quebras de DNA53, o mecanismo preciso é desconhecido. Nossos resultados revelaram que a fosforilação de TAF7 mediada por DNA-PKcs promove a ativação de mTORC1 regulando positivamente a expressão de Rap tor, fornecendo um possível mecanismo de ativação de mTORC1 em rins fibróticos. A ativação crônica do mTORC1 promove a reprogramação metabólica em muitas doenças, incluindo a DRC9,54. Estudos recentes destacaram que tanto as células tubulares renais quanto os fibroblastos alteram os fenótipos metabólicos em resposta à DRC9,10,13. A mudança das vias oxidativas dos ácidos graxos e da fosforilação oxidativa para a glicólise é a principal característica da reprogramação metabólica9,10. Como o mTOR desempenha um papel central na manutenção da homeostase metabólica, a inibição do mTOR apresenta efeitos colaterais. Além disso, a inibição a longo prazo da sinalização do TGF também está associada a efeitos adversos inaceitáveis57. Neste estudo, descobrimos que a atividade do DNA-PKcs era quase indetectável em rins normais, em contraste com o seu forte aumento na DRC. Assim, a inibição de DNA-PKcs corrige a reprogramação metabólica em rins fibróticos.

Figura 8|A exclusão do DNA-PK corrige a reprogramação metabólica. a Análise metabolômica dos tecidos renais de cada grupo conforme indicado. Imagem de mapa de calor mostrando níveis relativos de metabólitos na via da glicólise, metabolismo de ácidos graxos e ciclo de Krebs nos rins de cada grupo (n=4). As barras representam a análise estatística de metabólitos representativos nos rins de cada grupo (média ± DP, n=4 camundongos de cada grupo). ANOVA unidirecional seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey foi utilizada para determinar os valores de p. b Modelo de trabalho (o modelo foi criado com BioRender.com) ilustrando em que DNA-PKcs medeia a ativação da sinalização Raptor/mTORC1 através da fosforilação de TAF7 e promove a reprogramação metabólica em células epiteliais lesionadas e miofibroblastos.

Referências

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5. Wynn, TA & Ramalingam, TR Mecanismos de fibrose: tradução terapêutica para doença fibrótica. Nat. Med. 18, 1028–1040 (2012).

6. Meng, XM, Nikolic-Paterson, DJ & Lan, HY TGF-beta: o regulador mestre da fibrose. Nat. Rev. Nefrol. 12, 325–338 (2016).

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