Modelagem de doenças com organoides renais Ⅱ

4. Estratégias para melhorar as plataformas organoides renais

Exibição atual de organoides renaisestruturas relevantes para os rinsmas não se parecerins adultos funcionais. Assim, os protocolos descritos na Seção2.2 dão origem a organoides renais que carecem de um ambiente biofísico semelhante ao in vivo, incluindo o fluxo de fluido através dos tecidos. Estudos recentes melhoraram a semelhança dos organoides com o rim adulto, usando técnicas como o transplante e combinando diferentes tipos de organoides para obter estruturas renais de ordem superior. Estas técnicas podem ser combinadas com abordagens de bioengenharia para explorar e melhorar a maturação organoide. Abaixo, destacaremos essas estratégias e discutiremos novas considerações para gerarsistemas organoides renais. 

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4.1. Apresentando Gradientes

Sabemos que durante a embriogênese normal os mesonefros, metanefros e UB enviam sinais entre si para padronizar o rim em desenvolvimento [6]. Além disso, gradientes bioquímicos estabelecidos no embrião inicial são essenciais para direcionar o padrão e o desenvolvimento adequado dos rins [47]. Uma questão significativa em nossos protocolos atuais de desenvolvimento organoide renal é o seu isolamento de outros tecidos corporais durante o desenvolvimento e, portanto, a falta de gradientes bioquímicos estabelecidos através de interações com outros sistemas de tecidos em codesenvolvimento de um embrião. Portanto, vale a pena incluir essas interações no desenvolvimento organoide. Taguchi e Nishinakamura (2017) e Tsujimoto et al. (2020) consideraram algumas dessas interações para facilitar a maturação organoide [17,24]. Em suas estratégias, eles primeiro usaram fatores específicos de PIM e AIM para desenvolver organoides independentes e, em seguida, transplantaram organoides MM e UB co-cultivados em camundongos [17,24]. Os organoides renais desenvolvidos desta maneira exibiram estruturas de ordem superior, mas não conseguiram recapitular extensas ramificações UB semelhantes a in vivo. Embora estes estudos sublinhem a importância da co-cultura de tecidos vizinhos, eles apelam à melhoria do organoide através de gradientes estabelecidos incluídos desde o início do desenvolvimento do organoide.

Como é quase impossível incluir todos os tecidos do embrião em desenvolvimento e otimizar suas condições, propomos uma simulação de um ambiente onde as células experimentam os efeitos dos tecidos vizinhos. Isto pode ser conseguido através da engenharia de um gradiente bioquímico para o crescimento de células, em que o gradiente pode imitar a presença de tecidos vizinhos. O gradiente pode então direcionar ambas as linhagens AIM e PIM dentro da mesma suspensão de células e, assim, induzir a formação de UB e MM simultaneamente. Por exemplo, poderíamos estabelecer um gradiente de GDNF e avançar a ramificação UB dentro do MM para induzir a formação do intrincado sistema de dutos coletores do rim adulto.

Embora essas abordagens baseadas em gradiente não tenham sido exploradas para estabelecer organoides renais, elas têm sido usadas para melhorar a maturação de outros organoides. Por exemplo, Ben-Reuven e Reiner et al. (2020) incorporaram esferas de liberação de morfogênio em um hidrogel para ajudar a padronizar o eixo ântero-posterior dos organoides cerebrais [48]. Em outro estudo, Kamperman et al. (2019) estabeleceram substrato celular com morfogênios biotinilados [49]. Além dessas abordagens estáticas, os pesquisadores também desenvolveram chips microfluídicos com adição de morfogênio conduzida por colegas. Por exemplo, Cui et al. (2020) usaram uma câmara com câmaras de quimiotaxia para distribuição de morfogênio e câmaras nas quais células-tronco podem ser cultivadas em hidrogéis [50]. Assim, os pesquisadores podem aplicar sistemas semelhantes para programar o desenvolvimento organoide renal usando fatores específicos que são controlados espacialmente para mediar seus efeitos. Isto estabeleceria um gradiente e imitaria as distribuições naturais de morfogénios relevantes para o desenvolvimento renal embrionário. Por exemplo, esferas com fatores específicos para diferenciação de AIM e PIM podem ser semeadas em lados opostos de um hidrogel para imitar gradientes naturais de AIM-PIM. Alternativamente, para controlar a diferenciação de hiPSC, células ou organoides podem ser semeadas em dispositivos microfluídicos, de modo que células/organoides de diferentes linhagens estejam em lados opostos (ver Figura 5A). HiPSCs incorporados em hidrogéis podem ser cultivados entre essas duas estruturas, que podem servir como fontes de fatores morfogênicos. Esta abordagem pode ser utilizada para imitar interações entre os mesonefros e metanefros, que faltam aos atuais protocolos organoides renais em sua configuração (ver Figura 5A). Assim, trabalhos futuros devem ter como objetivo imitar sinais bioquímicos de múltiplos tipos de tecidos que são relevantes para o desenvolvimento renal, incluindo aqueles entre o UB e o MM, bem como entre o rim em desenvolvimento e a vasculatura. O projeto do sistema relacionado pode explorar as opções de estabelecimento de gradientes para imitar essas interações.

4.2. Perfundindo Organoides com Microfluídica

O fluxo de fluido é vital parafisiologia renaluma vez que inicia uma cascata de eventos intracelulares em resposta à mecanossensibilização e facilita o transporte através dos tecidos [51]. Portanto, se quisermos gerar organoides renais funcionais e sustentá-los por longos períodos de tempo, devemos integrar redes vasculares estáveis ​​e perfusáveis ​​em nossos sistemas modelo organoides. O fluxo de fluidos foi introduzido nos organoides renais de duas maneiras principais: microfluídica e transplante. Homan et al. (2019) incluíram pistas biofísicas em um chip bioimpresso em 3D, onde organoides foram cultivados em uma câmara com fluxo de fluido dinâmico [52]. Esta configuração simulou o companheiro microfluídico e promoveu a formação de redes vasculares, mas não recapitulou a perfusão através de estruturas vasculares e tubulares para replicar a fisiologia renal. No entanto, este estudo destacou a importância do ambiente biofísico na maturação organoide.

Figura 5. Melhorias propostas para plataformas organoides renais. (A) Abordagens para gerar gradientes nos quais os hiPSCs podem ser cultivados para evoluir para organoides renais. Da esquerda para a direita: cluster iPSC em hidrogel flanqueado por esferas emissoras de morfogênio, cluster hiPSC em hidrogel flanqueado por organoides emissores de morfogênio, sistema de chip multicâmara com cluster hiPSC cultivado em hidrogel e exposto bilateralmente a morfogênios de linhagem NP e UB contidos em um líquido. (B) Sistema de chip proposto para cultivar um organoide renal ao lado de um canal endotelial ramificado, com acompanhamento em um hidrogel (por exemplo, matriz de colágeno). (C) Configurações de andaimes propostas, nas quais os organoides renais podem ser cultivados e posteriormente transplantados. Da esquerda para a direita: estrutura porosa com canais endoteliais ramificados (vermelho), organoides renais semeados e esferas de morfogênio semeadas (esferas vermelhas e azuis); andaime poroso com organoides NP circundando organoides UB

Acreditamos que é possível desenvolver organoides em uma plataforma microfluídica canalizada de órgão em chip para modelar o rim humano, como foi realizado em outros sistemas esferoidais. Por exemplo, ao contrário de Homan et al. (2019), que colocou um organoide em uma câmara fluida, Nashimoto et al. (2017) cultivaram esferóides de fibroblastos de pulmão humano em uma matriz extracelular (ECM) entre dois canais endoteliais [52,53]. Os canais deram origem a uma rede vascular perfusível formada por angiogênese. Usando uma abordagem um tanto semelhante a Nashimoto et al. (2017), propomos colocar um cluster hiPSC próximo a um vaso endotelial perfusável que pode ser incorporado em um chip, como mostrado na Figura 5B [53]. Com a subsequente adição de sinais específicos de organoides renais, o canal vascular pode ser direcionado para se ramificar e invadir o organoide à medida que ele começa a se diferenciar. Essa configuração replicaria os estágios iniciais do desenvolvimento renal (54). Com a perfusão sustentada dos sinais morfogenéticos necessários para o desenvolvimento renal, os organoides renais devem ser capazes de replicar melhor os processos reais de formação renal humana. Também é importante que os parâmetros do sistema, como tensão do fluido, composição e configuração da ECM e estágio organoide, sejam cuidadosamente considerados e otimizados. Além disso, uma vez que Schumacher et al. (2021) mostraram que a hipóxia leva ao aumento da angiogênese nos organoides renais, tal sistema ex vivo pode ser cultivado na presença de diminuição do oxigênio para induzir a vascularização de forma mais eficiente [55]. Em última análise, estas estratégias devem facilitar a maturação organoide, recapitular a perfusão vascular e tubular e desempenhar funções fisiológicas à medida que ocorrem in vivo.

4.3. Avançando na maturação de organoides por meio de transplante

Estudos indicaram que o transplante de organoides renais em um hospedeiro, como camundongo, ovo de galinha ou rato, pode fornecer uma rota viável para vascularização [16,33,56]. No entanto, os organoides transplantados apresentam sucesso limitado como estruturas funcionais. Um grande obstáculo nesta estratégia é recapitular a extensa ramificação UB dentro do MM de organoides transplantados. Além disso, os segmentos de néfrons dentro dos organoides não possuem orientação adequada em direção a um ducto coletor. Essas características são essenciais para que os organoides transplantados desempenhem a função de um rim humano adulto. Além disso, os organoides pós-transplante integram-se ao hospedeiro, dificultando a distinção entre os limites do tecido organoide e do hospedeiro e, assim, limitando a análise específica do organoide.

As estratégias de engenharia de tecidos fornecem uma ampla gama de ferramentas paramelhorar o desenvolvimento organoide renalem termos de maturação e integração funcional. Normalmente, as abordagens de engenharia de tecidos empregam andaimes (por exemplo, andaimes de fibroína de seda) em várias configurações, tais como filmes, esteiras, hidrogéis e esponjas, para apoiar o arranjo das células e recapitular os diferentes sinais biofísicos dos problemas desejados. Por exemplo, em um estudo, Gupta et al. (2019) usaram andaimes de seda porosa para cultivar organoides, seguido de transplante [31]. Nesta abordagem, o biomaterial e a configuração do andaime forneceram uma estrutura para apoiar o desenvolvimento organoide e conferir estabilidade após o transplante. No entanto, este sistema carecia de pistas funcionais para apoiar a maturação organoide, como o codesenvolvimento da vasculatura com o companheiro na proximidade de outras estruturas em desenvolvimento.

Estudos futuros podem desenvolver estratégias semelhantes e incluir pistas funcionais para apoiar a maturação organoide. Por exemplo, conforme descrito na Figura 5C, um andaime poroso pode ser configurado com canais perfusáveis ​​e carregado com fatores morfogênicos para desenvolver um sistema de desenvolvimento organoide relevante através de transplante. A pré-semeadura com células endoteliais pode apoiar o desenvolvimento direcionado de vasos, enquanto a estrutura porosa aberta pode ser semeada com hiPSCs e programada através de fatores morfogenéticos para o desenvolvimento organoide. Alternativamente, a matriz extracelular (MEC) secretada pelos tecidos renais pode, por si só, servir como material de estrutura para a engenharia de tecidos de um organoide renal. Por exemplo, rins descelularizados têm sido usados ​​para apoiar a maturação do organoide. Essas matrizes poderiam ser usadas para cultivar e transplantar organoides ou para derivar estruturas de engenharia de tecidos desses biomateriais.

Além disso, os andaimes apresentam uma oportunidade inexplorada para incorporar múltiplas linhagens organoides em posições escolhidas. Por exemplo, Taguchi e Nishinakamura (2017) e Tsujimoto et al. (2020) transplantaram organoides UB e NP, permitindo-lhes vascularizar [17,24]; no entanto, eles não tinham uma estrutura extracelular para orientar seus organoides multilinhagens. Ao utilizar andaimes, poderíamos imitar a geração de néfrons em torno de uma única estrutura coletora, orientando os organoides UB no centro e na parte inferior de um andaime. Ao mesmo tempo, podemos semear organoides NP ao longo do exterior (ver Figura 5C). Abordagens semelhantes de engenharia de tecidos podem ser desenvolvidas para promover a maturação organoide. No entanto, ao projetar uma abordagem baseada na engenharia de tecidos para o transplante de organoides, parâmetros como configuração e compatibilidade dos biomateriais devem ser cuidadosamente selecionados, de acordo com as necessidades do rim.

5. Conclusões

O desenvolvimento doorganoide renalé um grande avanço in vitromodelagem de doença renal. Organoides renaispermitir o estudo individualizado dedoenças renais genéticase triagem de drogas em uma plataforma de origem humana. Embora sejam extremamente promissores, os organoides renais são imaturos e isolados em sua forma atual. Para modelar verdadeiramente orim humanoe doenças relacionadas, precisamos amadurecê-las recapitulando as interações renais em desenvolvimento. Em particular, precisamos avançar nas interações entre o UB e o MM in vitro e introduzir a vasculatura de origem humana nos organoides renais. Devemos também considerar abordagens de morfogênio baseadas em gradiente para paralelo ao desenvolvimento embrionário humano in vivo. Organoides renais possuem grande potencial para estudos genéticos de adultos edoença renal fetale triagem de drogas. Seu avanço pode levar ao desenvolvimento de recursos que salvam vidas.doença renaltratamentos de uma forma mais rápida e precisa do que nunca.

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