Lipidômica diferencial de células HK-2 e exossomos sob estimulação de alta glicose

Abstrato

O metabolismo lipídico celular anormal é muito importante na ocorrência e progressão da doença renal diabética (DKD). No entanto, a composição lipídica e a expressão diferencial pela estimulação de alta glicose das células tubulares renais e seus exossomos, que é uma parte vital do desenvolvimento da DKD, são amplamente desconhecidas. Neste estudo, com base na análise de lipídios direcionados por marcação de isótopos e espectrometria de massa em tandem, um total de 421 e 218 espécies lipídicas foram quantificadas em células HK-2 e exossomos, respectivamente. Mais importante, os resultados mostraram que GM3 d18:1/22:0, GM3 d18:1/16:0, GM3 d18:0/16:0, GM3 d18:1/22:1 foram significativamente aumentados, enquanto LPE18:1, LPE, CL66:4 (16:1), BMP36:3, CL70:7 (16:1), CL74:8 (16 :1) diminuíram significativamente em células HK{{4{{90}}}} estimuladas com alta glicose. Além disso, PG36:1, FFA22:5, PC38:3, SM d18:1/16:1, CE-16:1, CE-18:3, CE-20:5, e CE-22:6 foram significativamente aumentados, enquanto GM3 d18:1/24:1, GM3 foram significativamente diminuídos em exossomos secretados por células HK-2 estimuladas com alta glicose. Além disso, TAG, PC e CL diminuíram significativamente nos exossomos em comparação com as células HK-2 e LPA18:2, LPI22:5, PG32:2, FFA16:1, GM3 d18:1/18:1 , GM3 d18:1/20:1, GM3 d18:0/20:0, PC40:6p, TAG52:1(18:1), TAG52:0(18:0), CE{{101 }}:5, CE-20:4, CE-22:6 foram encontrados apenas em exossomos. Além disso, a expressão de PI4P em células HK-2 diminuiu sob um estado de alta glicose. Esses dados podem ser úteis para fornecer novos alvos para explorar os mecanismos da DKD.

Palavras-chave

Lipidômica direcionada; Túbulos renais; Exossomos; Doença renal diabética.

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Introdução

Distúrbios do metabolismo lipídico participam da ocorrência e desenvolvimento da doença renal diabética (DRD) [1, 2]. Alterações na composição lipídica celular no rim sob um estado de alta glicose podem causar um aumento na produção de oxigênio ativo, disfunção mitocondrial e até mesmo induzir a apoptose [3, 4, 5, 6]. Embora numerosos pesquisadores tenham reconhecido o importante papel dos túbulos renais no desenvolvimento e progressão da DKD, poucos estudos abordaram a expressão lipídica geral nos túbulos renais ou as alterações sob estimulação de alta glicose [7, 8]. Portanto, é de grande importância obter informações abrangentes sobre os lipídios nos túbulos renais, elucidando ainda mais o papel dos lipídios na patogênese da DKD.

Nos últimos anos, o papel dos exossomos no desenvolvimento da DKD tem atraído cada vez mais atenção. Exossomos que podem cooperar com a via autofagia-lisossoma para aliviar o estresse intracelular têm um papel importante na manutenção da homeostase celular [9, 10]. Enquanto isso, eles atuam como portadores de transferência de material e comunicação de informações entre as células [11]. Estudos recentes revelaram que o crosstalk entre as células tubulares e outros tipos de células renais no néfron pode ter um papel importante na progressão da doença [12, 13]. Embora a composição lipídica dos exossomos possa afetar suas propriedades, ela foi estudada em menor grau em comparação com a atenção da proteína e do RNA [14]. Como os exossomos secretados por diferentes células variam em tipos, conteúdos e funções lipídicas, esclarecer a composição lipídica e a expressão diferencial dos exossomos secretados pelos túbulos renais sob um estado de alta glicose forneceria uma base teórica para esclarecer o mecanismo de comunicação exossomal em relação aos túbulos renais .

Aqui, apresentamos uma análise lipidômica diferencial de túbulos renais e seus exossomos sob alta estimulação de glicose e detectamos espécies lipídicas diferencialmente expressas de cardiolipina (CL), monosialodihexosil gangliosídeo (GM3) e éster de colesterol (CE). Também exploramos inicialmente o papel dos fosfoinositídeos (PIPs) na produção exossomal e observamos a captação de exossomos tubulares por células mesangiais glomerulares (GMCs).

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Métodos

1. Cultura celular

A linha celular epitelial tubular proximal renal humana HK-2 foi adquirida do Shanghai Institute for Biological Sciences Cell Resource Center. As células HK-2 foram cultivadas em glicose normal Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) que foi suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal (FBS; FSP500, ExCell). A glicose normal DMEM/F-12 era uma mistura 1:1 de DMEM (11966025, Gibco) e Ham's F-12 (11765054, Gibco) que continha 5,56 mmol/L de glicose. As células foram mantidas a 37 graus em uma incubadora de 5% de CO2. Uma vez que 80 por cento de confluência foi alcançada, as células foram colhidas usando o procedimento padrão de digestão com tripsina e passadas em uma proporção de divisão de 1:2. As células de passagem foram cultivadas com FBS depletado de exossoma (CMS101.03, Cellmax) em 5,5 mmol·L-1 glicose como o grupo de controle em branco (NG) e 30 mmol·L-1 glicose como glicose alta grupo (HG) por 48 horas.

2. Isolamento de exossomos

A ultracentrifugação diferencial foi usada para extrair exossomos dos sobrenadantes da cultura de células HK{{0}}. Em resumo, os sobrenadantes da cultura de células HK-2 foram coletados e centrifugados sequencialmente a 2000×g, 4 graus por 10 min e, em seguida, a 10,000×g, 4 graus por 30 min para remover células, detritos celulares e vesículas grandes. As frações do sobrenadante foram filtradas usando filtros de tamanho de poro de 0,22-μm. As amostras filtradas foram então submetidas a ultracentrifugação a 110.000 × g por 75 min, duas vezes a 4 graus para sedimentar os exossomos. Os exossomos resultantes foram ressuspensos em uma pequena quantidade de solução tampão de fosfato (PBS) e armazenados a -80 graus .

3. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)

Os exossomos foram descongelados em banho-maria a 25 graus e colocados no gelo, após o que foram diluídos diretamente com 1 × PBS para detecção com sensor de pulso resistivo sintonizável (TRPS). As análises de distribuição de tamanho e concentração de exossomos foram realizadas usando qNano Gold com Izon Control Suite 3.3.2 da Izon Science.

4. Determinação de proteínas e western blotting

Aproximadamente. 100ul de solução de craqueamento pré-misturada (solução de craqueamento RIPA e inibidor de PMSF a 1 por cento) foi adicionado à célula e amostras de exossomos separadamente. Após craqueamento por 30min, foram centrifugados a 12,000×g, 4 graus por 20min. O sobrenadante foi retirado e as concentrações de proteína foram determinadas usando o kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (BCA; Beyotime) de acordo com as instruções do fabricante. A albumina de soro bovino foi utilizada como proteína padrão.

As amostras de proteínas foram fracionadas por eletroforese em gel de sódio-dodecil-sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE). Depois de serem transferidos para uma membrana de PVDF (Millipore), eles foram incubados com vários anticorpos primários, anti-CD63 (EXOAB-CD63A-1, SBI; 1:1000), anti-ALIX (YT6283, Immunoway; 1:1000 ), anti-Calnexin (YT0613, Immunoway; 1:1000), anti-P62 (P0067, Sigma; 1:1000) e anti-LC3 (L7543, Sigma; 1:1000), seguido por cabra anti-coelho ou camundongos Anticorpos secundários Ig (180202-001, SBI; 1:5000). Bandas específicas foram detectadas usando substrato quimioluminescente aprimorado (ECL; Beyotime). -actina (BM0627, Boster) foi usada como controle interno. A intensidade relativa da banda foi medida usando o software ImageJ.

5. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

Amostra de 5ul foi descartada na rede de cobre e incubada em temperatura ambiente por 5min. Uma gota de acetato de peróxido de urânio a 2 por cento foi adicionada à rede de cobre e incubada à temperatura ambiente por 1 min. Em seguida, foi seco por cerca de 20 minutos em temperatura ambiente e observado em microscópio eletrônico de nanotransmissão (Tecnai G2 Spirit BioTwin, FEI).

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6. Lipidômica direcionada

Os lipídios foram extraídos usando uma versão modificada do método de Bligh e Dyer [15]. Todas as análises lipidômicas foram realizadas em uma cromatografia líquida de ultra desempenho Exion (UPLC) acoplada a um sistema SCIEX QTRAP 6500 PLUS. As análises UPLC-MS/MS foram conduzidas no modo de ionização por eletrospray (ESI), com as seguintes condições: gás de cortina=20, tensão de spray de íons=5,500 V , temperatura=400 grau , gás da fonte de íons 1=35 e gás da fonte de íons 2=35. Os lipídios polares foram separados usando uma coluna de sílica Phenomenex Luna de 3 µm (diâmetro interno 150 × 2.0 mm) com duas fases móveis: fase móvel A (clorofórmio: metanol: hidróxido de amônio, 89,5: 10: 0.5) e fase móvel B (clorofórmio: metanol: hidróxido de amônio: água, 55: 39: 0.5: 5,5). A separação do gradiente foi conduzida da seguinte forma: o gradiente foi mantido com 95 por cento A por 5 min e então reduzido linearmente para 60 por cento em 7 min e mantido por 4 min, após o que diminuiu para 30 por cento e foi mantida por 15 min. Finalmente, o gradiente original foi aplicado e mantido por 5 min. O monitoramento multi-reação por espectrometria de massa (MRM) foi estabelecido para várias identificações de lipídios e análises quantitativas [16, 17]. Espécies lipídicas polares individuais foram quantificadas por referência a padrões internos enriquecidos da mesma classe lipídica, incluindo PE-d31(16:0/18:1), DMPE; PG-d31(16:0/18:1), DMPG; PI-d31(16:0/18:1), di-C8- PI; PS-d31(16:0/18:1), DMPS; PA-d31(16:{{1{{1{{110}}8}}4}}/18:1), PA(17:0/17:0); BMP-(14:0/14:0); LPE-17:1; LPI-17:1; LPS-17:1; LPA-17:0; GM3 d18:1/18:0-d3; d31-16:0, d8-20:4; PC-d31(16:0/18:1), DMPC; SM d18:1/ d31-16:0, SM d18:1/12:0; LPC-17:0; Cer d18:1-d7/15:0; Sph-d18:1/17:0; CL 22:1(3)-14:1.

Os lipídios de glicerol, incluindo diacilgliceróis (DAGs) e triacilgliceróis (TAGs), foram quantificados usando uma versão modificada de HPLC/MS/MS de fase reversa. A separação de lipídios neutros foi realizada em uma coluna Phenomenex Kinetex-C18 2.6 µm (id 4,6x100 mm) usando uma fase móvel contendo clorofórmio: metanol: {{19} },1 M de acetato de amônio (100:100:4), a uma taxa de fluxo de 160 µl/min. d5-TAG (16:0)3; d5-TAG (14:0)3; d5-TAG (18:0)3 foram usados ​​para TAG de pico individual. d5-DAG (1,3-17:0); d5-DAG (1,3-18:1) foram usados ​​para aumentar o DAG individual com base na tecnologia Neutral miss MS/MS.

Colesterol livre, esteróis e seus ésteres foram analisados ​​por HPLC-MS/MS, conduzida em modo de ionização química à pressão atmosférica (APCI), com Colesteril-2,2,3,4,4,6-d6 Octadeconato; Colesterol-26,26,26,27,27,27-d6 como padrões internos.

Clorofórmio: metanol: (1:1), ácido clorídrico 2,4 M e 0 0,25 M EDTA foram adicionados à amostra, seguido de trituração a baixas temperaturas. A amostra foi centrifugada após incubação por 3 horas a 4 graus, após o que a fase orgânica inferior foi extraída. Clorofórmio foi adicionado para a segunda extração, seguida de lavagem da fase orgânica com ácido clorídrico 1N:metanol (1:1). A fase orgânica foi seca em concentrador rotativo a vácuo. Conforme relatado anteriormente, 40% de metilamina: água: n-butanol: metanol (36:8:9:47) foi usado para desacilação e analisado por cromatografia de íons Thermo ICS-5000. PI4P, PI3P, PI4P, PI(3, 4)P2, PI(3, 5)P2, PI(4, 5)P2 e PI(3, 4,5) P3 foram usados ​​para construir uma curva de calibração externa para análise. A análise foi apoiada pela Lipidall Technologies Company Limited.

7. Microscopia de fluorescência

Para visualizar a absorção de exossomos em GMCs (Sicencell), uma quantidade igual de exossomos secretados por células HK-2 com ou sem estimulação de alta glicose foram marcadas com PKH67 (mini67, Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. Exossomos marcados foram cultivados com GMCs por 24h. GMCs confluentes foram lavados três vezes com PBS, após o que as células foram fixadas com paraformaldeído a 4 por cento e mantidas fora da luz por 30 minutos. As células foram lavadas três vezes com PBS e coradas com DAPI (28718903, Solarbio) por 4-6min. Após lavagem três vezes, os GMCs confluentes foram fotografados usando microscópio confocal Nikon C2.

8. Análise estatística

GraphPad 7.0 foi aplicado para análise estatística e mapeamento. Os dados são expressos como média ± SEM. O teste t de Student foi utilizado para comparação entre os dois grupos. Um valor P < 0.05 foi considerado como significância estatística.

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Discussão

Nosso estudo fornece as espécies lipídicas diferencialmente expressas de células HK{{0}} e exossomos sob alta estimulação de glicose, que não foram relatadas anteriormente. Curiosamente, espécies de GM3, como GM3 d18:1/22:0, GM3 d18:1/16:0, GM3 d18:0/16:0 , GM3 d18:1/22:1 foram significativamente aumentados em células HK-2 estimuladas com alta glicose, e GM3 d18:1/24:1, GM3 foram significativamente diminuídos em seus exossomos. Além disso, GM3 d18:1 /18:1, GM3 d18:1/20:1 e GM3 d18:0/20:0 foram encontrados apenas em exossomos. O GM3 é o gangliosídeo mais amplamente distribuído no corpo, consistindo de glicose, galactose e ácido siálico caracterizado por grupos siálicos associados à estrutura do esqueleto da ceramida [18]. Está envolvido na regulação de uma variedade de funções celulares, incluindo transdução de sinalização, proliferação, diferenciação e apoptose. De acordo com estudos recentes, a concentração sérica de GM3 é maior em pacientes com diabetes tipo 2, hiperlipidemia e pacientes obesos, enquanto o GM3 pode promover a remoção de receptores de insulina e reduzir a sinalização da insulina [19]. Nossos resultados indicaram níveis elevados de todas as espécies de GM3 expressas diferencialmente em células HK-2 sob estimulação de alta glicose, especialmente o aumento de GM3 com cadeia lateral (22: 0) que foi o mais óbvio. Zhang et ai. [20] também observaram expressão elevada de GM3 d18:1/22:0 no córtex renal de camundongos com nefropatia diabética, o que foi consistente com nossos resultados. O estudo de ratos com diabetes tipo 2 induzido por estreptozotocina conduzido por Anela et al. [21] encontraram GM3 inalterado nos glomérulos, mas aumentou significativamente a expressão de GM3 nos túbulos renais, o que está de acordo com nosso achado de alterações de GM3 nos túbulos renais. Kwak et ai. [22] encontraram uma diminuição de GM3 no conteúdo glomerular de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina, seguida por uma perda da barreira de filtração seletiva de carga nos glomérulos. É importante notar que o papel do GM3 nos glomérulos e túbulos renais pode variar. O GM3 também é uma parte importante da balsa lipídica [23]. Alterações nos níveis de expressão de GM3 em jangadas lipídicas alteram as atividades do cotransportador Na+-glicose tipo 2 (SGLT2) e do cotransportador renal Na+/K+/Cl-, ambos dependentes de jangadas lipídicas [24]. Alguns pesquisadores presumiram que uma concentração mais alta de GM3 aumenta as atividades do SGLT2 e do Na+/K+/Cl-cotransportador, levando ao aumento da reabsorção tubular e da pressão hidrostática da arteríola eferente e, então, causando lesão das células tubulares renais ao danificar o equilíbrio tubuloglomerular. Kumari et ai. [25] descobriram que GM3 em exossomos urinários de pacientes mostrou uma diferença significativa entre DKD e diabetes mellitus. Em conjunto, o papel da expressão elevada de GM3 sob alta glicose nos túbulos renais deve ser abordado em pesquisas futuras.

É importante ressaltar que nossos resultados também mostraram que algumas espécies de CL, incluindo CL66:4(16:1), CL70:7(16:1) e CL74:8(16:1) diminuíram significativamente em HK estimulada com alta glicose{ {13}} células. Comparado com células HK-2, CL foi significativamente diminuído nos exossomos. CL está localizado quase inteiramente na membrana mitocondrial interna e é uma parte importante da manutenção da estrutura mitocondrial. Tem um papel importante na condução de elétrons, produção de trifosfato de adenosina, metabolismo energético e apoptose [26, 27]. No diabetes, as alterações morfológicas mitocondriais e a disfunção são frequentemente acompanhadas por alteração patológica do CL [28,29]. As células epiteliais tubulares renais proximais requerem ATP suficiente para manter o transporte ativo e a reabsorção de várias substâncias. Como células de alto consumo de energia, as células epiteliais tubulares renais proximais são ricas em mitocôndrias [30]. A fragmentação mitocondrial foi observada em células epiteliais tubulares proximais no diabetes inicial. Zhang et ai. [31] descobriram que CL era essencial para manter a função mitocondrial tubular em camundongos com diabetes tipo 1. Nossos resultados podem fornecer uma nova base teórica para estudar o mecanismo de lesão mitocondrial da DKD.

Os exossomos têm um papel importante na manutenção da homeostase celular, cooperando com a via autofagia-lisossoma. Estudos anteriores descobriram que mudanças nos níveis de expressão de PIPs podem afetar tanto a secreção de exossomos quanto a autofagia celular, regulando a transformação de MVBs [32, 33, 34]. Nina et ai. [35] descobriram que em células PC-3, a inibição de PIKfyve, cujo substrato é PI3P, aumentou a secreção de exossomos e induziu a autofagia secretora, mostrando assim que essas vias estavam intimamente ligadas por PIPs. Com base no mencionado acima, observamos as mudanças nos PIPs, produção exossomal e autofagia em células HK-2 estimuladas com alta glicose. Nossos resultados mostraram que a alta glicose estimulou tanto a secreção de exossomos quanto a ativação da autofagia em células HK-2, enquanto uma diminuição significativa foi encontrada na expressão de PI4P. Mais estudos são necessários para investigar o mecanismo regulador da autofagia exossomal de PIPs envolvidos na estimulação de alta glicose.

Como mensageiros, os exossomos têm um papel importante na sinalização intracelular e nas alterações funcionais no desenvolvimento da DKD [36, 37, 38]. Marcamos exossomos liberados por células HK-2 com fluorescência e demonstramos sua absorção parácrina por GMCs. Em comparação com suas células-mãe, os exossomos têm uma composição especial, o que os torna mais estáveis ​​e funcionais devido aos domínios ricos em colesterol, esfingolipídios, fosfolipídios saturados e jangada lipídica [39]. Mesmo pequenas mudanças na composição lipídica podem afetar as propriedades da membrana, tendo assim um grande efeito em sua função. No presente estudo, descobrimos que TAG, PC e CL diminuíram significativamente nos exossomos em comparação com as células-mãe HK-2, enquanto 13 espécies de lipídios, incluindo LPA18:2, LPI22:5, PG32:2, FFA16: 1, GM3 d18:1/18:1, GM3 d18:1/20:1, GM3 d18:{{30}}/20:0, PC40: 6p, TAG52:1(18:1), TAG52:0(18:0), CE-20:5, CE-20:4, CE-22:6 foram detectados apenas em exossomas. O trabalho aqui apresentado fornece uma base para uma análise mais aprofundada dos papéis parácrinos dos exossomos liberados pelas células tubulares.

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Conclusões

Em conclusão, nosso estudo demonstrou a importância da análise lipidômica em fornecer novos alvos para explorar a patogênese da DKD. Estudos adicionais sobre a função dos lipídios expressos diferenciais, bem como os estudos lipídicos abrangentes em outras células do néfron e seus exossomos, podem fornecer uma nova perspectiva que elucidaria ainda mais o mecanismo da DKD.

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Weidong Wang, Tingting Li, Zhijie Li, Hongmiao Wang, Xiaodan Liu

Departamento de Nefrologia, O Primeiro Hospital Afiliado da China Medical University, 155 North Nanjing Street, Shenyang, Liaoning, PR China, 110001