Controle diferencial de células T efetoras e Treg humanas na imunidade tumoral por anticorpo anti-CTLA fabricado por Fc-4

O mAb anti–CTLA-4 é eficaz no aumento da imunidade tumoral em humanos. CTLA-4 é expresso por células T convencionais após a ativação e por células FOXP3 mais CD4 mais Treg de ocorrência natural constitutivamente, levantando uma questão de como o mAb anti–CTLA-4 pode controlar diferencialmente essas populações de células T funcionalmente opostas em imunidade tumoral. Aqui, mostramos que as células Treg efetoras altamente potentes de FOXP3 eram abundantes em tecidos de melanoma, expressando CTLA-4 em níveis mais elevados do que células T CD8 plus infiltrantes de tumor. Após a estimulação de antígeno tumoral in vitro de células mononucleares do sangue periférico de indivíduos saudáveis ​​ou pacientes com melanoma, anti-CTLA modificado na região Fc-4 mAb com alta citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e fagocitose celular (ADCP ) depletou seletivamente as células CTLA-4 mais FOXP3 mais Treg e, consequentemente, expandiu as células T CD8 mais específicas do antígeno tumoral.

É importante ressaltar que a expansão ocorreu apenas quando a estimulação do antígeno foi atrasada vários dias a partir do tratamento com anticorpo para poupar CTLA-4 mais células efetoras CD8 mais T ativadas da morte mediada por mAb. Da mesma forma, em camundongos portadores de tumor, o tratamento com mAb anti–CTLA -4 de alto ADCC/ADCP com vacinação retardada do antígeno tumoral prolongou significativamente sua sobrevida e aumentou acentuadamente a produção de citocinas por células T CD8 plus infiltrantes do tumor, enquanto o tratamento com anticorpos concomitante com a vacinação não. O mAb anti–CTLA4 modificado para exibir uma atividade de ligação a Fc menor ou nenhuma atividade não mostrou esse aumento imunológico in vitro e in vivo dependente do tempo. Assim, o alto ADCC anti-CTLA-4 mAb pode esgotar seletivamente as células Treg efetoras e evocar imunidade tumoral, dependendo do CTLA-4-expressando o status das células T CD8 mais efetoras. Essas descobertas são fundamentais para projetar a imunoterapia contra o câncer com mAbs direcionados às moléculas comumente expressas por FOXP3 mais células Treg e células T efetoras reativas a tumores.

Células T reguladoras|CTLA-4|FOXP3|imunoterapia contra o câncer|citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos.

As células Treg CD25 mais CD4 mais de ocorrência natural, que expressam o fator de transcrição FOXP3, desempenham papéis indispensáveis ​​na manutenção da autotolerância imunológica e da homeostase (1). No entanto, eles também impedem respostas imunes efetivas contra células tumorais que surgem de si mesmas, conforme ilustrado pelas descobertas de que os tumores de camundongos podem ser erradicados simplesmente pela depleção de células Treg (2-5).

Em humanos, há evidências acumuladas de infiltração abundante de células Treg em vários tecidos tumorais (6-8) e uma correlação significativa entre a infiltração de Treg e mau prognóstico em vários tipos de câncer (9). O controle de células Treg em tecidos tumorais é, portanto, provavelmente uma maneira promissora de evocar imunidade tumoral eficaz em pacientes com câncer.

Para antitumoral, descobrimos que Cistanche deserticola tem um efeito antitumoral óbvio em pesquisas com ratos. 3 Os componentes polissacarídeos do Cistanche deserticola podem melhorar a função imunológica do corpo, promover a ativação de glóbulos brancos, melhorar o estado imunológico do corpo e também podem atuar diretamente nas células tumorais. Inibir a proliferação, metástase e invasão de células tumorais. Também inibe a angiogênese. O crescimento do tumor e a metástase precisam do suporte do crescimento de novos vasos sanguíneos, e os componentes polissacarídeos do Cistanche podem inibir a angiogênese, reduzindo assim o crescimento do tumor e a metástase.

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Células T CD4 plus que expressam FOXP3-humano são heterogêneas em função, incluindo células Treg e células T convencionais não supressivas. Eles podem ser fracionados em três subpopulações por seus diferentes níveis de expressão de FOXP3 e CD45RA (10) (Fig. 1A): (i) CD45RA mais FOXP3lo virgens/células Treg em repouso [Fração (Fr). I];(ii) células Treg (Treg) efetoras CD45RA− FOXP3hi (Fr. II), que são diferenciadas terminalmente e altamente supressivas; e (iii) células CD45RA− FOXP3lo não-Treg (Fr. III), que não possuem atividade supressora e são capazes de secretar citocinas pró-inflamatórias. Após estimulação antigênica, Fr. As células Treg naïve diferenciam-se em Fr. Células Treg II, que expressam altamente CTLA-4 (10).

Fig. 1. Expressão preferencial de CTLA-4 por células Treg FOXP3hi em tecido de melanoma. (A e B) Gráficos representativos de coloração de células CD4 mais T (A) e frequências de cada fração (B). PBMCs de doadores saudáveis ​​(HD, n=5) e PBMCs e TILs de pacientes com melanoma (n=11 e 14, respectivamente) foram submetidos à coloração direta para CD4, CD45RA e FOXP3. (C e D) Gráficos representativos da expressão de CCR7 e CD45RA por células T CD8 plus (C) e resumo de cada subconjunto de células T CD8 plus (D). (E) CTLA-4–expressando clusters (linha pontilhada) em PBMCs e TILs de pacientes com melanoma por análise de CyTOF. Gráficos viSNE de células T CD4 plus e CD8 plus com mapas de calor para os níveis de expressão do marcador indicados são mostrados (n=2). (F) Superfície apenas ou superfície e coloração intracelular de CTLA-4 em HD PBMC. (G) Expressões de superfície CTLA-4 por cada fração celular de TILs e PBMCs de pacientes com melanoma. Médias ± SEM. *P Menor ou igual a {{20}}.05, **P Menor ou igual a 0.01, ***P Menor ou igual a 0,001 e ****P menor ou igual a 0,0001 por ANOVA unidirecional com teste post hoc de Tukey HSD.

Embora a maioria das células em Fr. III são células não-Treg e não se diferenciam em Fr. As células II eTreg, um subconjunto circulante de células reguladoras foliculares T, que são CXCR5 mais CD45RA-, estão incluídas em Fr. III (11), indicando a heterogeneidade do Pe. III população. Em contraste, com a presença dessas três populações FOXP3 plus no sangue, a maioria dos tumores apresenta infiltração predominante de células Treg, que parecem estar suprimindo respostas imunes antitumorais eficazes em pacientes com câncer (12). Esses achados sugerem que a depleção/redução de células Treg em tumores e linfonodos regionais é fundamental para evocar e aumentar as respostas imunes antitumorais, conforme demonstrado recentemente com alguns anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para as moléculas especificamente expressas pelas células Treg (13).

CTLA-4 é expresso por células T convencionais mediante ativação e por FOXP3 mais CD25 mais CD4 mais células Treg constitutivamente. Ele desempenha um papel fundamental na supressão mediada por Treg, pelo menos em parte, por meio do controle da expressão de CD80/CD86 por células apresentadoras de antígenos (APCs) (14–16). O mAb CTLA-4 anti-humano, que é clinicamente eficaz no tratamento de melanoma (17, 18), foi inicialmente considerado para bloquear o sinal negativo mediado por CTLA-4 em células T efetoras ativadas, mantendo seu estado ativado em atacando as células tumorais. No entanto, estudos pré-clínicos recentes mostraram que o mAb anti–CTLA-4 pode esgotar as células FOXP3 mais Treg, especialmente em tecidos tumorais, aumentando assim a imunidade tumoral (19–21). Em humanos, no entanto, é controverso se CTLA-4 mAb afeta o número ou a função de células Treg ou células T efetoras, ou ambas, ao aumentar as respostas imunes antitumorais em contextos clínicos.

Neste estudo, investigamos in vivo e in vitro, em humanos e camundongos, os efeitos dos mAbs anti–CTLA-4 manipulados por Fc em células FOXP3 mais Treg e em células T CD8 mais específicas para antígenos próprios/tumorais. Mostramos que mAb anti–CTLA-4 depletor de células com alta atividade de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) pode evocar respostas imunes antitumorais dependendo dos níveis e da cinética de expressão de CTLA-4 pelo duas populações. Os resultados podem ser estendidos para mAbs depletores de células direcionados a outras moléculas da superfície celular que as células Treg e T efetoras (Teff) comumente expressam em diferentes níveis e com diferentes cinéticas.

Significado

O mAb anti–CTLA-4 pode aumentar a imunidade tumoral apesar da expressão de CTLA-4 por populações de células T funcionalmente opostas: células T efetoras ativadas (Teff) e células FOXP3 mais CD4 mais Treg. Aqui mostramos que mAb anti-CTLA-4 projetado para ser células Treg depletadas citotóxicas de forma eficaz in vitro em humanos e in vivo em camundongos. Ele expandiu as células CD8 mais Teff específicas do antígeno quando a estimulação do antígeno do tumor foi atrasada vários dias para protegê-las da morte pelo mAb. O mAb anti–CTLA-4 modificado para exibir uma atividade de depleção celular menor ou nula não apresentou tais efeitos. Essa estratégia de controlar diferencialmente as células Treg e Teff por mAb citotóxico anti-CTLA-4 para evocar imunidade tumoral eficaz ajudará na concepção de imunoterapia contra o câncer visando outras moléculas comumente expressas por células Treg e Teff.

Contribuições dos autores: DH, A. Tanaka, HN e SS planejaram a pesquisa; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA e IK realizaram pesquisas; A. Tanemura contribuiu com novos reagentes/ferramentas analíticas; DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN e SS analisaram os dados; e DH, A. Tanaka e SS escreveram o artigo.

Revisores: MA, Tokyo Medical and Dental University; e SAQ, University College London.

Declaração de conflito de interesses: HN recebeu uma bolsa de pesquisa da Bristol Myers Squibb. SS recebeu uma bolsa de pesquisa da Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK é empregado da Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., que forneceu alguns dos anticorpos usados ​​neste estudo.

Publicado sob a licença PNAS.

1 Endereço atual: Departamento de Imunologia, Graduate School of Medicine, Nagoya University, 466-8550 Nagoya, Japão.

2 Endereço atual: Departamento de Imunologia, Moffitt Cancer Center, Tampa, FL 33612.

3 Endereço atual: Division of Cancer Immunology, Exploratory Oncology Research & Clinical Trial Center, National Cancer Center, 277-8577 Kashiwa, Japão.

4 A quem a correspondência deve ser endereçada. E-mail: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Publicado online em 26 de dezembro de 2018.

Resultados

Acúmulo de CTLA-4–Expressando células Treg FOXP3hi terminalmente diferenciadas em tecidos de melanoma.

Primeiro avaliamos a frequência de várias subpopulações de células T entre linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) em pacientes com melanoma. As células eTreg CD45RA− FOXP3hi (Fr. II) foram predominantemente (∼10-vezes) aumentadas na proporção entre os TILs CD4 mais, em comparação com as células T CD4 mais do sangue periférico em doadores saudáveis ​​ou pacientes com melanoma (Fig. 1 A e B ). A frequência de CD45RA− FOXP3lo Fr. As células não-Treg III também aumentaram ligeiramente (∼duas vezes) entre os TILs CD4+. Em contraste, as células Treg virgens de CD45RA mais FOXP3lo (Fr. I) foram significativamente reduzidas em TILs para um quarto, em média, da fração correspondente em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).

Entre as células T CD4 plus convencionais FOXP3- em TILs, CD45RA- FOXP3- efetoras/células CD4 de memória CD4 plus, que podem ser mais dissecadas nas populações CD25 plus (Fr. IV) e CD25- (Fr. V) (10) , ligeiramente (∼1.3-vez) aumentou, enquanto as células CD45RA mais FOXP3- naïve CD4 mais T (Fr. VI) reduziram significativamente para um décimo daquelas em PBMCs. Na fração de células T CD8 mais de TILs, em comparação com PBMCs dos pacientes ou doadores saudáveis, houve um aumento significativo (∼1,6-vez) de células T (TEM) de memória efetora CD45RA- CCR7-, com uma diminuição significativa nas células CD45RA mais CCR7 mais virgens e CD45RA mais CCR7- memória efetora diferenciada terminalmente (TEMRA) para metade e um quinto, respectivamente, daquelas em PBMCs, e nenhuma mudança significativa em CD45RA- CCR7 mais memória central T (TCM) (Fig. 1 C e D). Também foi observado em pacientes com melanoma que as células T CD8 mais naïve em PBMCs diminuíram acentuadamente (∼14-vezes) em comparação com doadores saudáveis.

Em seguida, avaliamos qual população de células T expressa CTLA-4 em TILs ou PBMCs de pacientes com melanoma por citometria por citômetro de espectrometria de massa time-of-flight (CyTOF) (Fig. 1E e SI Apêndice, Fig. S1A). O agrupamento de células CD4 mais CD45RA- Foxp3hi, representando Fr. As células eTreg II, predominantemente expressam CTLA4 em PBMC e TIL, enquanto as células T CD8 mais raramente expressam CTLA-4 em PBMC ou TILs. Em camundongos, a expressão predominante de CTLA4 por células FOXP3 mais Treg foi observada de forma semelhante no baço e no tecido tumoral CMS5a (SI Apêndice, Fig. S1B). CTLA4 expresso por Fr. humano. II As células Treg estavam principalmente no compartimento intracelular e o CTLA da superfície celular-4 era limitado (Fig. 1F). No entanto, em TILs, células Treg e, em menor grau, Fr. III células não-Treg, foram encontradas para expressar superfície CTLA-4 em níveis significativamente altos (Fig. 1G e Apêndice SI, Fig. S2). As células TIL CD8 mais TCM e TEM também expressaram um nível mais alto de CTLA de superfície-4 em comparação com qualquer uma das frações de células T circulantes, embora as células Treg mostrassem uma expressão muito maior em pacientes com melanoma (Fig. 1G e SI Apêndice, Fig. S2).

Tomadas em conjunto, as características cardinais dos tecidos do melanoma humano são um aumento e uma diminuição marcantes de células Treg e células Treg virgens, respectivamente, e um aumento marcado de células T CD8 plus efetoras/de memória com uma redução de células T CD8 plus virgens. Essas células Treg e células T CD8+ nos TILs expressam CTLA-4 na superfície celular, com maior expressão das primeiras do que das últimas. Em contraste com as células TIL eTreg, as células eTreg circulantes em pacientes com melanoma são significativamente mais baixas no nível de expressão de CTLA4 de superfície, sugerindo que elas podem ser menos afetadas pelo tratamento anti–CTLA–4 mAb.

Redução de células Treg e células T CD8 mais específicas de antígeno por tratamento in vitro com mAb anti-CTLA-4 depletor de células e estimulação simultânea de antígeno.

Para determinar se os efeitos antitumorais do mAb anti–CTLA-4 dependeriam de sua capacidade de esgotar as células Treg por ADCC, modificamos a porção Fc do mAb anti–CTLA-4 IgG1 (clone MDX{{3 }}, ipilimumab), que possuía uma atividade ADCC moderada, para alterar sua afinidade por Fc RIIIa (CD16a), um Fc R ativador expresso por células NK, monócitos/macrófagos e outras células (22) (Fig. 2A). Um mAb anti–CTLA-4 assim gerado com uma alta atividade ADCC, que chamamos de domínio Fc de tecnologia de reengenharia assimétrica (ART-Fc), possuía diferentes substituições de aminoácidos em cada cadeia pesada (23); isto é, substituições L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A em uma região Fc de cadeia pesada e substituições D270E/K326D/A330M/K334E na outra. O mAb reconstruído mostrou uma afinidade de ligação 1000-vezes maior para o Fc RIIIa humano do que o mAb não modificado sem aumentar a afinidade para o Fc RIIb inibitório. Também geramos um mAb anti–CTLA-4 que mal se liga a Fc Rs, que chamamos de silencioso-Fc anti–CTLA-4, por substituições de aminoácidos; isto é, L235R, G236R e S239K na região Fc de ambas as cadeias pesadas. Em comparação com o mAb anti–CTLA-4 Fc não modificado ou silencioso, o ART-Fc mostrou citotoxicidade in vitro muito maior para CTLA-4– expressando células de ovário de hamster chinês (CHO) na presença de PBMCs de doadores saudáveis , com citotoxicidade aumentada por incubação mais longa (Fig. 2B). Da mesma forma, mAb ART-Fc anti–CTLA-4 efetivamente matou Fr. II células Treg e, em menor grau, Fr. III não-Treg ou Fr. I células Treg virgens, enquanto IgG1 (ipilimumabe) ou mAb Fc silencioso dificilmente mostraram atividade letal (Fig. 2C).

Em seguida, avaliamos os efeitos desses mAbs manipulados por Fc na expansão específica do antígeno in vitro de células T CD8 mais, estimulando PBMCs de doadores saudáveis ​​que expressam HLA-A*0201 ou pacientes com melanoma por 9 d com vários peptídeos, por exemplo: derivado de Melan-A/MART-1, um antígeno próprio/tumoral expresso por melanócitos normais e algumas células de melanoma (24); e NY-ESO-1, antígeno de câncer/testículo expresso por vários tipos de células cancerígenas e células germinativas humanas (25), citomegalovírus (CMV) ou vírus influenza (Flu). Esta estimulação peptídica in vitro, por exemplo, pelo peptídeo Melan-A, manteve a alta expressão de CTLA4 pelas células Treg (Fig. 2D e Apêndice SI, Fig. S3). A estimulação peptídica sozinha também expandiu tetrâmero específico de peptídeo (Tet) mais células T CD8 mais, que expressaram níveis mais altos de CTLA-4, especialmente na superfície celular, em comparação com células Tet- (Fig. 2 E, F, e eu). Quando ART-Fc anti–CTLA-4 mAb estava presente desde o início da estimulação peptídica de PBMCs de doadores saudáveis ​​ou pacientes com melanoma, a proporção de células Treg que expressam CTLA-4 entre células T CD4+ foi significativamente reduzido de uma maneira dependente da dose, enquanto o mAb de Fc silencioso falhou em mostrar esse efeito (Fig. 2 D e G e Apêndice SI, Figs. S4 e S5).

A redução das células Treg, no entanto, não acompanhou a expansão das células T CD8+ antígeno-específicas; em vez disso, o tratamento causou uma redução profunda da proporção de células T Tet mais CD8 mais entre células T CD8 mais (Fig. 2H). Nessas estimulações in vitro, IgG1 não modificada ou mAb silencioso-Fc anti–CTLA-4 não exibiu atividade significativa de depleção de eTreg (Fig. 2I). O grau de redução de células eTreg por esses mAbs foi de fato correlacionado com a redução de células T CD8 mais específicas do antígeno, independentemente do antígeno estimulante, por exemplo, Melan-A ou peptídeo CMV (Fig. 2I).

Assim, enquanto as células Treg expressam constitutivamente CTLA-4, especialmente CTLA intracelular-4, a estimulação antigênica expande células T CD8 mais que expressam altos níveis de CTLA-4, particularmente na superfície celular. O mAb ART-Fc anti–CTLA-4 com alta atividade de ADCC é, portanto, capaz de esgotar não apenas as células CTLA-4 mais Treg, mas também as células CTLA-4 mais CD8 mais T ativadas por antígeno . Essa depleção de células T CD8 mais efetoras pode compensar um efeito de aumento imunológico da depleção de células eTreg em respostas imunes in vitro.

Fig. 2. Estimulação peptídica in vitro concomitante com ART-Fc anti–CTLA-4 mAb restringe respostas de células T CD8 mais específicas de antígeno. (A) Resumo das substituições de aminoácidos feitas na porção Fc do mAb CTLA-4 IgG1 anti-humano (clone MDX-010, ipilimumab) para gerar ART-Fc ou mAbs Fc silenciosos e suas afinidades a Fc RIIb inibidor ou Fc RIIIa ativador. A afinidade do Silent-Fc mAb estava abaixo do limite de detecção do ensaio BIACORE. (B) Atividade ADCC de vários mAbs anti–CTLA4 contra células CHO humanas que expressam CTLA-4. Anti–CTLA-4 mAbs (ART, ADCC-enhanced anti–CTLA-4 ART-Fc; IgG1, anti-CTLA convencional não modificado-4 IgG1; Silencioso, anti-CTLA inativado na região Fc CTLA-4 silent-Fc) foram incubados com células CHO e HD PBMCs (n=3) a uma razão E/T de 50:1. Médias ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre cada anticorpo e o Silent-Fc nas respectivas concentrações para culturas {{3{76}}}}h (preto) ou 24-h (vermelho). (C) Atividade de ADCC para cada fração celular de células T CD4 plus e CD8 plus de PBMCs por ART-Fc, IgG1, ou silenciosa-Fc anti–CTLA-4 mAbs (n=4 ou 5). As frequências de células mortas entre as células pré-marcadas com CTV após a cultura {{40}}h são indicadas. (D) expressão CTLA-4 do Pe. Células Treg II após 9 d de estimulação do peptídeo Melan-A e 1 ug/mL de ART-Fc, silent-Fc ou IgG1 anti-CTLA-4 tratamento mAb para PBMCs inteiros (n {{50 }}). (E e F) Expressões CTLA-4 de superfície por células T Tet plus e Tet− CD8 plus após estimulações peptídicas indicadas. Histogramas representativos (E) e resumo da intensidade média de fluorescência (MFI) (F) (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Gripe, n=3; ESO{{ 57}}, n=4). (G e H) Parcelas representativas e frequências de Fr. II células eTreg (G) e células T CD8 mais específicas do antígeno (H) de HDs (n=6) ou pacientes com melanoma (n=5) após a cultura com o peptídeo indicado e 1 ug/mL ART -Fc anti–CTLA-4 mAb como em D. (I) Quantificação da frequência de células Treg (superior) e células Tet mais CD8 mais T (inferior) após 9 d de estimulação de antígeno Melan-A ou CMV para HD PBMCs com mAbs anti-CTLA-4 indicados em G e H. Médias ± SEM. A significância representada entre os dois grupos foi calculada usando o teste t pareado, ANOVA de uma via ou ANOVA de duas vias com teste post hoc de Tukey HSD. *P Menor ou igual a 0,05, **P Menor ou igual a 0,01, ***P Menor ou igual a 0,001 e ****P Menor ou igual a 0,0001.

Expansão Robusta de Células T CD8+ Específicas para Antígenos por Depleção de Células eTreg Antes da Estimulação do Antígeno.

. Em seguida, tentamos esgotar as células CTLA-4 mais Treg antes da estimulação do antígeno para evitar que as células T CD8+ expressando CTLA{2}} ativadas por antígeno fossem mortas por mAbs anti–CTLA-4. Cultivamos PBMCs inteiros de doadores saudáveis ​​ou pacientes com melanoma na presença de ART-Fc anti-CTLA-4 mAb por 5 dias sem estimulação de antígeno, removemos o mAb, depois estimulamos as células com vários peptídeos por 8 dias e os analisamos para o proporção de células Treg e células Tet mais CD8 mais T entre células T CD4 mais ou células T CD8 mais, respectivamente (Fig. 3A). A proporção de células Treg FOXP3hi foi significativamente reduzida em 5 d pelo pré-tratamento ART-Fc (Fig. 3A e Apêndice SI, Fig. S6) e mantida em um nível baixo durante a estimulação peptídica subsequente (Fig. 3B), indicando que Treg as células não se recuperaram totalmente durante o período de estimulação do antígeno. Este pré-tratamento ART-Fc combinado com a estimulação de antígeno induziu uma expansão robusta de células T CD8 plus específicas de Melan-A de PBMCs de doadores saudáveis ​​e células T CD8 plus específicas de NY-ESO-1 de PBMCs de pacientes cujos tecidos de melanoma expressaram NY-ESO-1 (Fig. 3C). Células T CD8 mais específicas para CMV não foram muito afetadas pela depleção de Treg mediada por ART-Fc. Em contraste com o ART-Fc, o mAb silencioso anti–CTLA-4 Fc não alterou a frequência das células Treg e falhou em expandir as células T Tet mais CD8 mais, independentemente da espécie de antígeno (Fig. 3D).

Um dos vários mecanismos de supressão usados ​​pelas células Treg é a regulação negativa dependente de CTLA-4 da expressão de CD80 e CD86 por células dendríticas (DCs) (14, 15). Para investigar as possíveis contribuições desse mecanismo para a expansão de células T CD8 mais específicas do antígeno próprio/tumoral após o tratamento in vitro ART-Fc anti–CTLA-4 mAb, avaliamos a expressão de CD80 e CD86 por DCs, que foram fenotipicamente definidas como Lin-1− CD11c mais HLA-DR plus , em PBMCs de doadores saudáveis. A expressão de CD80 e CD86 mostrou regulação positiva distinta no grupo pré-tratado com ART-Fc, em contraste com a expressão inalterada de CD80/CD86 em uma IgG1- não modificada pré-tratada, Fc silenciosa – grupo pré-tratado ou não tratado (Fig. 3E). Além disso, o grau de afinidades de ligação de Fc R de mAbs teve uma boa correlação com sua atividade de depleção de Treg e também com Tet mais CD8 mais atividade de indução de células T (Fig. 3F). Como o mero bloqueio de CTLA-4 por silent-Fc não regulou CD80/86, os resultados indicaram que a depleção de Treg por ART-Fc ativou DCs, embora exista a possibilidade de que ART-Fc em si possa adicionalmente contribuem para a ativação de DCs via ligação de alta afinidade aos seus receptores Fc ativadores.

Tomados em conjunto, esses resultados indicam que a depleção de Treg por ART-Fc anti–CTLA-4 mAb vários dias antes da exposição ao antígeno pode poupar a morte de CTLA-4 mais células T CD8 mais ativadas por antígeno pelo anticorpo, expandindo-os, pelo menos em parte, por meio do aprimoramento da expressão CD80/CD86 por APCs.

Fig. 3. A pré-depleção de células Treg usando ART-Fc anti–CTLA-4 mAb aumenta as respostas de células T CD8 mais específicas do antígeno próprio/tumoral. (A–D) Células T CD8 mais específicas do antígeno foram induzidas de PBMCs inteiros de HDs (n=7) ou pacientes (n=5) ​​após 5 d de pré-tratamento com ART-Fc anti–CTLA{ {11}} mAb. (A) Esquema do experimento e coloração FOXP3 e CD45RA representativa de células T CD4 plus no dia -5 e dia 0 do experimento. Resumo do Pe. Frequências II eTreg no dia 0 (inferior). (B e C) Coloração FOXP3 representativa de células T CD4 mais (B) e células T CD8 mais específicas do antígeno (C) com ou sem pré-tratamento ART-Fc para cada peptídeo após a cultura. Resumo das freqüências de células T CD8 mais T específicas de Treg e antígeno após a cultura (parte inferior). (D) Resumo do Pe. II eTreg e Tet mais CD8 mais frequências de células T com pré-tratamento silencioso-Fc anti–CTLA-4 mAb em vez de ART-Fc como em A–C. (E) Níveis de expressão de CD80 e CD86 por Lin-1−CD11c mais HLA-DR mais DCs após 5 d de estimulação Melan-A com o pré-tratamento de anti–CTLA indicado -4 mAbs (n=6). Os números nos histogramas mostram MFI. (F) Resumo das frequências de células Treg e Tet mais CD8 mais T após pré-tratamento com mAbs anti–CTLA-4 indicados, seguido por estimulação Melan-A26–35 como em A–C. Médias ± SEM. A significância representada entre os dois grupos foi calculada usando o teste t pareado. *P Menor ou igual a 0,05.

CTLA-4–Depleção de Treg Mediada Antes da Vacinação de Antígeno Tumoral Aumenta as Respostas Antitumorais em Camundongos.

Para validar em camundongos as descobertas in vitro com PBMCs humanos e mAbs CTLA anti-humanos-4, geramos mAbs com um ADCC alto ou baixo e atividade de fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) de CTLA anti-camundongo{{4 }} mAb (clone UC10) de isotipo IgG2a (doravante denominado mIgG2a) por substituição de aminoácidos no domínio Fc (Fig. 4A). A mutação S239D em ambas as cadeias pesadas aumentou a afinidade para Fc RIV de camundongo ∼ sete vezes (variante mFa55 mIgG2a), enquanto as mutações L235R, G236R e S239K em ambas as cadeias pesadas as tornaram não ligadas a Fc Rs de camundongo (variante mFa31 mIgG2a); o primeiro foi chamado de mouse ADCC/ADCP–enhanced-Fc (aumentado), o último mouse mutile-Fc (mSilent) mAb. Para comparar a atividade antitumoral desses mAbs anti-camundongo-CTLA-4 modificados por Fc em combinação com a vacinação com antígeno tumoral, inoculamos subcutaneamente células de fibrossarcoma CMS5a de camundongos BALB/c expressando o antígeno NY-ESO-1 humano, e no dia 9, quando o tumor se estabeleceu, tratou os camundongos com 100 ug de cada mAb e vacinou com o peptídeo NY-ESO-1 no mesmo dia (dia 9; doravante chamamos o protocolo de "tratamento concomitante") ou 3 d depois (dia 12; daqui em diante "pré-tratamento Ab") (Fig. 4B). O pré-tratamento Ab com mAb mEnhanced foi mais eficaz do que o tratamento concomitante ou pré-tratamento com mIgG2a ou mAb mSilent no retardo do crescimento do tumor; os efeitos dos dois últimos mAbs no crescimento do tumor foram baixos e não significativamente diferentes entre o pré-tratamento com Ab e o tratamento concomitante (Fig. 4C). A sobrevivência foi significativamente melhor em camundongos pré-tratados com mAb aprimorado e também em camundongos com tratamento simultâneo ou pré-tratamento com mIgG2a, embora qualquer forma de tratamento com mIgG2a não tenha induzido a regressão do tumor na maioria dos camundongos (Fig. 4 C e D).

Fig. 4. O pré-tratamento com mAb anti–CTLA-4 aprimorado com ADCC/ADCP induz fortes efeitos antitumorais em camundongos. (A) Resumo das substituições de aminoácidos feitas na porção Fc do mAb anti-camundongo CTLA-4 IgG2a (clone UC10; mIgG2a) para gerar ADCC/ADCP anti-camundongo–CTLA aprimorado{{ 1 0}} (aumentado) ou silenciosa-Fc anti-mouse–CTLA-4 (mSilent) mAbs, e suas afinidades para mouse Fc RIV são mostrados. A afinidade mSilent mAb estava abaixo do limite de detecção do ensaio BIACORE. (B– D) Esquema do experimento (B). Os camundongos foram desafiados com 2 × 106 fibrossarcoma CMS5a expressando NY-ESO-1 humano no dia {{40}} e deixados sem tratamento ou tratados com mEnhanced, mIgG2a ou silencioso mAb anti-camundongo–CTLA-4 no dia 9. A vacinação de peptídeos NY-ESO-181–88 misturados com CFA foi realizada no mesmo dia (dia 9, tratamento concomitante) ou 3 dias depois (dia 12, pré-tratamento Ab). Crescimento tumoral de cada camundongo com uma linha em negrito indicando a média de cada grupo de tratamento (C) (n=8–13 por grupo). Resumo do crescimento médio do tumor de cada grupo de tratamento (D, Esquerda). Os asteriscos indicam os valores de P entre o grupo de pré-tratamento com mAb aprimorado por ANOVA bidirecional com teste de comparação múltipla de Tukey. Resumo da taxa de sobrevivência (D, Direita) de cada grupo de tratamento. Os valores de p entre a sobrevivência de cada grupo e a sobrevivência do controle apenas com vacina foram calculados pelo teste de log-rank. O evento de morte corresponde ao comprimento do tumor maior ou igual a 200 mm ou à morte do camundongo. *P Menor ou igual a 0,05, **P Menor ou igual a 0,01, ***P Menor ou igual a 0,001 e ****P Menor ou igual a 0,0001.

O pré-tratamento aprimorado com mAb também resultou em um aumento significativo no número de células T CD8 plus infiltrantes do tumor e na razão CD8/Treg em TILs, embora a porcentagem de células FOXP3 plus entre as células T CD4 plus tenha aumentado ligeiramente (Fig. 5 A- C). Além disso, enquanto a frequência de CD8 mais TILs específicos do peptídeo NY-ESO-1 não foi estatisticamente diferente entre os camundongos tratados com cada mAb ou entre o pré-tratamento e o tratamento concomitante, os TILs CD8 mais específicos do antígeno do mAb aprimorado pré-tratado os camundongos, em comparação com outros grupos, mostraram produção significativamente mais ativa de IL-2 e IFN após a reestimulação in vitro com o peptídeo NY-ESO-1 (Fig. 5 D e E). Além disso, as células T CD8 plus de memória efetora definidas como a população CD44highCD62Llow aumentaram significativamente entre os TILs CD8 plus específicos de NY-ESO-1 em camundongos pré-tratados com mAb aprimorado (Fig. 5 F e G).

Tomados em conjunto, o pré-tratamento com mEnhanced mAb foi mais eficaz em evocar a imunidade tumoral, seguido pelo pré-tratamento com mIgG2a, que teve alguma atividade ADCC, enquanto mSilent mAb foi muito menos eficaz. Os resultados indicam que o pré-tratamento de camundongos portadores de tumor com mAb anti–CTLA-4 aprimorado com ADCC/ADCP, seguido de vacinação com antígeno tumoral, pode efetivamente evocar respostas imunes antitumorais in vivo.

Discussão

As principais descobertas neste relatório são: (i) células eTreg altamente supressivas e diferenciadas terminalmente são abundantes em tecidos tumorais e expressam CTLA de superfície-4 em níveis mais altos do que células T CD8 plus infiltrantes de tumor; (ii) mAb anti–CTLA-4 com alta atividade ADCC é capaz de esgotar/reduzir CTLA-4células eTreg altas e CTLA-4 mais células CD8 efetoras mais células T; e (iii) o mAb anti–CTLA-4 depletor de células pode evocar e aumentar a imunidade tumoral efetiva quando o regime de tratamento com anticorpo é planejado para não afetar as células CTLA-4 mais efetoras CD8 mais T, por exemplo, por alterando o tempo de depleção de células Treg e vacinação com antígeno de câncer.

A atividade ADCC do mAb anti–CTLA-4 é um determinante chave da eficácia da redução de eTreg e da expansão resultante de células T CD8+ reativas ao tumor. Apoiando a noção, demonstramos que mAb anti–CTLA-4 (ART-Fc) com uma atividade ADCC aumentada (e/ou atividade ADCP em camundongos) foi capaz de aumentar as respostas imunes antitumorais in vitro em humanos e in vivo em camundongos pela depleção de células Treg que expressam CTLA-4. Anti–CTLA4 mAbs (silent-Fc) modificados para exibir muito menos ou nenhuma atividade ADCC falharam em mostrar tal atividade antitumoral, mesmo que possuíssem a mesma especificidade para um epítopo da molécula CTLA-4. Ainda não está claro em humanos se o efeito antitumoral do ipilimumabe com porção IgG1 Fc é atribuído ao bloqueio da molécula CTLA4 ou à depleção de células que expressam CTLA-4 por ADCC. Foi demonstrado em camundongos que um aumento da imunidade antitumoral por um mAb anti–CTLA-4 exigia a depleção de células Treg infiltrantes do tumor por ADCC mediado por Fc R (19–21, 26, 27). Da mesma forma, os anticorpos contra as moléculas GITR, OX40 e CD25, nas quais as células Treg infiltrantes do tumor expressam as maiores quantidades, demonstraram ser dependentes da depleção de células Treg mediada por ADCC na rejeição do tumor (19, 26, 28). Também foi relatado que o tratamento com ipilimumabe em pacientes com melanoma reduziu significativamente as células FOXP3 mais Treg nos tecidos tumorais, particularmente em respondedores clínicos (29).

Além disso, um relatório recente mostrou que, entre os pacientes com melanoma com alta carga de mutação tumoral, aqueles geneticamente com uma variante de alta afinidade de Fc RIIIa com ADCC aprimorado (variante V158, em oposição à variante F158 de baixa afinidade) mostraram significativamente melhor respostas clínicas ao tratamento com ipilimumabe e melhor sobrevida global (27). Essa descoberta apóia a noção de que mAb anti-CTLA-4 com melhor atividade de depleção de Treg pode ser mais eficaz do que ipilimumabe na imunoterapia do câncer. Portanto, é provável que ART-Fc anti–CTLA4 mAb, que possui uma alta afinidade para a variante V158 (KD=3,7 × 10−10 M, em comparação com 3,1 × 10−6 M para ipilimumab ou IgG1) , pode ter melhor eficácia clínica na imunoterapia do câncer por meio da depleção de células Treg. Juntos, esses achados em humanos e camundongos indicam que o mAb anti–CTLA-4 de alto ADCC/ADCP pode ser eficaz na evocação e aumento da imunidade tumoral por meio da depleção de células Treg.

Fig. 5. Respostas de células T CD8 mais específicas para Ag induzidas em camundongos portadores de tumor por pré-tratamento com mAb anti–CTLA-4 aprimorado ADCC/ADCP. (A–G) TILs da Fig. 4 foram analisados ​​19 d após a implantação do tumor (n=4–6 por grupo). O número de células T infiltradas por grama de tumor (A). Proporção de células CD8/Treg (B). Freqüência de células Foxp3 mais Treg entre as células T CD4 mais (C). Parcelas representativas de IL-2 mais IFN- mais CD8 mais células T (D). A produção de citocinas foi medida pela reestimulação de TILs com peptídeos ESO-181–88 in vitro por 5 h. Resumo de células Tet mais CD8 mais T no tumor e IL{{20}} mais IFN- mais células T CD8 mais em D após a reestimulação (E). Gráficos representativos (F) e resumo (G) das expressões de CD44 e CD62L por NY-ESO-1-Tet mais CD8 mais células T no tumor de cada grupo de tratamento. Os dados foram obtidos a partir de três experimentos independentes. Valores de P entre subconjuntos de células T Naïve ou EM CD8 mais de cada condição. Médias ± SEM. *P Menor ou igual a 0.05, † P Menor ou igual a 0.05, **P Menor ou igual a 0,01, ††P menor ou igual a 0,01 e ***P menor ou igual a 0,001 por ANOVA de duas vias com teste de comparação múltipla de Tukey.

Materiais e métodos

Amostras Doadoras.

Amostras de sangue periférico foram obtidas de indivíduos saudáveis ​​ou pacientes com melanoma estágio III a IV. As PBMCs foram isoladas por gradiente de densidade com Ficoll-Paque (GE Healthcare). Os TILs foram obtidos a partir de tecidos de melanoma ressecados. O tumor foi picado e as suspensões unicelulares geradas após dissociação suave do MACS (Miltenyi) foram preparadas por filtração através de um filtro de células 40-μm. Todos os doadores forneceram consentimento informado por escrito antes da amostragem de acordo com a Declaração de Helsinque. O presente estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Osaka.

Análise CyTOF.

TILs e esplenócitos de camundongos portadores de tumor foram enriquecidos para células CD3 plus e corados com 198-cisplatina para discriminação de células mortas e um painel de anticorpos incluindo os seguintes anticorpos conjugados com metal: 172Yb-CD4 (RM4-5 ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC-10), 158GdFOXP3 (FJK-16s). Para PBMCs e TILs humanos, as suspensões de células foram codificadas por anticorpos anti-CD45 com vários conjugados de metal, conforme descrito anteriormente (35), antes da coloração com 198-cisplatina para discriminação de células mortas e, em seguida, coloração de anticorpo com o seguinte painel. Anticorpos conjugados com metal foram obtidos da Fluidigm ou kit Maxpar Antibody Labeling (Fluidigm) foi usado de acordo com as instruções do fabricante para conjugar anticorpos purificados: 89Y-CD45 (clone: ​​HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend), 175Yb- Anticorpos CD45 (HI30; Biolegend) foram usados ​​para código de barras de diferentes amostras; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-Biotina (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 Cd)-CD8a (RPA -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; Fluidigm), 145NdCD4 (RPA-T4 ; Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C398.4A; Fluidigm) , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R&D Systems), 156Gd-anti-PE (CCR8) ( PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm), 164Dy-CD95 (DX2; Fluidigm), 165Ho- CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3.9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy–CTLA-4 (14D3; Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) e 168Er-Ki-67 (Ki-67; Fluidigm).

Células humanas e de camundongos foram fixadas com tampões de coloração eBioscience Foxp3/fator de transcrição (ThermoFisher) antes da coloração intracelular. As células coradas foram então ressuspensas em 2% de PFA com intercalador de DNA 191/193-iridium (Fluidigm) durante a noite, depois lavadas e ressuspensas em água Maxpar (Fluidigm) e esferas de quatro elementos EQ (Fluidigm) imediatamente antes da análise com Helios CyTOF sistema (Fluidigma). Os dados normalizados foram analisados ​​com Cytobank Premium.

Estimulação de células T CD8 mais específicas do antígeno.

PBMCs inteiros de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com melanoma foram estimulados com 10 μM de peptídeos curtos específicos para HLA-A*0201 (Operon Biotechnology) por 8–9 d: Melan-A26–35 (EAAGIGILTV), CMV495–503 (NLVPMVATV), Flu58 –66 (GILGFVFTL), ou NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). Para determinar o efeito do mAb anti–CTLA-4 com vários ADCC, um dos seguintes mAbs foi adicionado à cultura a 1 ug/mL (a menos que indicado de outra forma) no mesmo dia ou 5 dias antes da estimulação do antígeno: ADCC anti-CTLA-4 humano aprimorado (MDX-010-ART-Fc), anti-CTLA-4 IgG1 convencional não modificado (MDX-010-IgG1) ou Fc silencioso anticorpos anti–CTLA-4 IgG1 (MDX-010-silent-Fc): Todos os mAbs foram gentilmente cedidos pela Chugai Pharmaceutical. Metade do meio foi substituída por meio fresco contendo 10 U/mL IL-2 e 40 ng/mL IL-7 a cada 3 d.

Ensaio de liberação de lactato desidrogenase com células CTLA humanas-4–Expressando células CHO.

Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH) foi realizado para determinar a atividade de ADCC em PBMCs. As células CHO DG44-hCTLA4 (da Chugai Pharmaceutical) foram semeadas em 96-placas de fundo redondo (1 × 104 células por poço) e incubadas com várias concentrações de mAbs por 15 min. PBMCs obtidos de doadores saudáveis ​​foram então adicionados à cultura em uma proporção efetor-alvo (E∕T) de 50:1. As células foram incubadas a 37 graus, 5 por cento de CO2 por 6 ou 24 h, 100μL do sobrenadante de cada poço foi coletado e a absorbância de 492 nm e 630 nm foi medida usando o Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Instruments). A liberação de LDH foi considerada máxima após a incubação das células em solução Nonidet P-40 a 1 por cento. A citotoxicidade (por cento) foi determinada a partir da fórmula; (AC)∕(BC) × 100, onde A, B e C representam a liberação de LDH de cada experimento, liberação máxima de LDH e liberação de fundo de LDH, respectivamente. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.

Ensaio ADCC com PBMC Humano Isolado Recentemente.

PBMCs de doadores saudáveis ​​foram classificados por FACS para cada fração de células T e Treg foram pré-marcadas com CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher) e cultivadas com células não-T, como células efetoras, em uma proporção de alvo para efetora de 1:50. Em seguida, 1 ug/mL do mAb anti-CTLA-4 indicado foi adicionado a 10 por cento de soro AB humano contendo meio RPMI1640 com 5 UI/mL IL-2. Após 24-h de cultura a 37 graus, a frequência de células mortas, indicada por coloração fixável LIVE/DEAD (ThermoFisher), entre células CTV plus foi avaliada por FACS.

Experiências de tumores murinos.

Camundongos BALB/c de seis a 7-semanas de idade foram adquiridos da CLEA Japan e mantidos sob condições específicas livres de patógenos. Os camundongos foram desafiados por via subcutânea com 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1. Nove dias após a implantação do tumor, os camundongos receberam 100 ug de mAb anti-camundongo-CTLA4 (clone UC-10; mIgG2a, mEnhanced ou mSilent, da Chugai Pharmaceutical) por via intravenosa. A variante mEnhanced (variante mFa55 mIgG2a) foi gerada pela mutação S239D no domínio CH2 e mostra afinidade de ligação melhorada para Fc RIV de camundongo em aproximadamente sete vezes em comparação com mIgG2a de tipo selvagem. Camundongos foram tratados com vacinação de 100 ug de ESO-181–88 peptídeos (Operon Biotechnology) misturados com 200 μL de CFA/PBS (proporção de 1:1) no mesmo dia (dia 9, tratamento concomitante) ou 3 d mais tarde (dia 12, pré-tratamento Ab) por via subcutânea. O tamanho do tumor foi medido a cada 3-4 dias. Os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional e conduzidos de acordo com os regulamentos da Universidade de Osaka.

Citometria de Fluxo.

Conforme descrito anteriormente (12, 23), células T CD8 mais específicas do antígeno geradas in vitro foram coradas com Melan-A marcado com PE, CMV ou tetrâmero de Flu (TC Matrix) ou NY-ESO marcado com PE-1 tetrâmero (MBL) por 10 min a 37 graus e, em seguida, corado com vários mAbs de superfície. Para a coloração de CTLA de superfície-4 neste estudo, um anticorpo CD152 anti-humano biotinilado (clone BNI3; BD Biosciences) foi usado a 4 graus por 15 min com outros anticorpos contra moléculas de superfície. Após a lavagem, adicionamos APC-estreptavidina (Biolegend) também a 4 graus por 15 min para evitar a coloração de moléculas CTLA-4 externalizadas na superfície após condição de coloração prolongada a 37 graus. Esses procedimentos de coloração foram realizados antes da fixação e permeabilização, conforme descrito em nosso estudo anterior (24).

A coloração intracelular de FOXP3 foi realizada usando o conjunto FOXP3 Transcription Factor Staining Buffer (eBioscience). Os seguintes anticorpos com marcadores fluorescentes indicados foram usados ​​para coloração de células humanas:5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), biotina–CTLA-4 (BNI3 ; BD Biosciences), APC-Streptavidin (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegned), AlexaFluor700-CD4 (RPA -T4; eBioscience), mistura FITC-Lineage (BD Biosciences), PerCP/Cy5.5-CD11c (3.9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) e corante de viabilidade fixável eFluor780 (eBioscience). Os seguintes anticorpos foram usados ​​para manchar células de camundongo: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy7-CD3e (145-2C11; eBioscience), eFluor 450-CD4 (RM4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK-16s; eBioscience), FITC–IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL-2 (JES6-5H4; eBiosciences) e corante de viabilidade fixável eFluor780 (eBioscience). As células T TIL CD8 mais específicas do antígeno de camundongos foram coradas com tetrâmeros de ESO -181–88 restritos a H-2Dd marcados com PE (Matriz TC), conforme descrito acima. Para medir a produção de citocinas a partir de células T CD8+, os TILs de camundongo foram reestimulados por 5 h a 37 graus na presença de 10 μM dos mesmos peptídeos ESO-181–88 usados ​​para uma vacinação com GolgiPlug (BD Bioscience). A fixação e a permeabilização foram realizadas com o conjunto de tampão Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience). As células foram adquiridas com LSR Fortessa (BD Bioscience) e analisadas usando o software FlowJo v9.9.5.

Análise estatística

O teste t pareado bicaudal foi usado para avaliar a significância entre os dois grupos. ANOVA de uma ou duas vias com teste post hoc de diferença honesta significativa (HSD) de Tukey foi usado para comparar vários grupos. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software Prism v6 (GraphPad). Valores de P < 0,05 foram considerados significativos.

AGRADECIMENTOS.

Agradecemos aos membros do Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Osaka pela coleta de amostras de pacientes; e K. Teshima, T. Shimizu e N. Mizoguchi pela assistência técnica. Anticorpos CTLA-4 anti-humanos e de camundongos projetados foram gerados e fornecidos pela Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. para Pesquisa Científica (A) 26253030 (para SS) e (B) 26290054 (para HN), Grantin-Aid para desafiar Pesquisa Exploratória 26670581 (para HN) e Grant-inAid para Jovens Cientistas (B) 26860331 e 17K15723 (para A. Tanaka) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão; e Core Research for Evolutional Science and Technology da Japan Science and Technology Agency (SS). Este estudo foi parcialmente realizado como um programa de pesquisa do Projeto de Desenvolvimento de Pesquisa Inovadora em Terapêutica do Câncer (P-DIRECT) e Pesquisa Prática para Controle Inovador do Câncer e Projeto de Pesquisa do Câncer e Evolução Terapêutica (P-CREATE) pelo Japão Agência de Pesquisa e Desenvolvimento Médico.

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uma Imunologia Experimental, Immunology Frontier Research Center, Universidade de Osaka, 565-0871 Osaka, Japão; b Laboratório de Imunologia Experimental, Departamento de Ciência e Engenharia de Regeneração, Instituto para Frontier Life and Medical Sciences, Universidade de Kyoto, 606-8507 Kyoto, Japão; c Research Division, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Kanagawa, Japão; d Departamento de Dermatologia, Escola de Pós-Graduação em Medicina, Universidade de Osaka, 565-0871 Osaka, Japão; e Agência para Ciência, Tecnologia e Pesquisa, Singapore Immunology Network, 138632 Singapore.

Contribuição de Shimon Sakaguchi, 23 de novembro de 2018 (enviado para revisão em 19 de julho de 2018; revisado por Miyuki Azuma e Sergio A. Quezada).

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