Flavanóis de cacau dietéticos melhoram a função mitocondrial no músculo esquelético e modificam o metabolismo do corpo inteiro em camundongos saudáveis

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Abstrato: A disfunção mitocondrial é amplamente relatada em várias doenças e contribui para sua patogênese. Avaliamos o efeito deflavonóides de cacausuplementação sobre a função mitocondrial e todo o metabolismo, e exploramos se a desacetilase mitocondrial sirtuína-3 (Sirt3) está envolvida ou não. Exploramos os efeitos de 15 dias de suplementação de CF no tipo selvagem e Sirt3-/camundongos. O metabolismo de todo o corpo foi avaliado por calorimetria indireta e um teste oral de tolerância à glicose foi realizado para avaliarmetabolismo da glicose. A função respiratória mitocondrial foi avaliada em fibras permeabilizadas e os teores de nucleotídeos de piridina (NAD plus e NADH) foram quantificados. No tipo selvagem, a suplementação de FC modificou significativamente o metabolismo de todo o corpo, promovendo o uso de carboidratos e melhorando a tolerância à glicose. A suplementação com FC induziu um aumento significativo da massa mitocondrial, enquanto uma adaptação qualitativa significativa ocorreu para manter a produção de H2O2 e o estresse oxidativo celular. A suplementação de CF induziu um aumento significativo no conteúdo de NAD plus e NADH. Todos os efeitos mencionados acima foram atenuados em camundongos Sirt3-7. Coletivamente, a suplementação de FC impulsionou o metabolismo do NAD que estimula o metabolismo das sirtuínas e melhorou a função mitocondrial, o que provavelmente contribuiu para a adaptação observada do metabolismo de todo o corpo, com maior capacidade de usar carboidratos, pelo menos parcialmente, através do Sirt3.

Palavras-chave: flavanóis de cacau; metabolismo do NAD; massa mitocondrial; metabolismo da glicose; músculo esquelético

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1. Introdução

As mitocôndrias são organelas subcelulares que estão envolvidas em múltiplas funções celulares, como a transdução de energia através da fosforilação oxidativa mitocondrial e na produção de peróxido de hidrogênio mitocondrial ou ativação da morte celular mediada por mitocôndrias [1-3]. Evidências emergentes sugerem que a disfunção mitocondrial está envolvida em muitas patologias e desempenha um papel central em sua patogênese [4]. Nosso grupo relatou comprometimento mitocondrial em pacientes com diabetes tipo 1 muito antes das complicações clínicas [5]. Além disso, ocorre uma diminuição da capacidade oxidativa mitocondrial com o envelhecimento, mesmo em pessoas saudáveis ​​[6]. Portanto, a identificação de estratégias para mitigar essas disfunções ou aumentar a massa mitocondrial são oportunidades para prevenir, ou pelo menos reduzir, a incidência de muitos distúrbios ou aumentar a capacidade aeróbica de indivíduos saudáveis.

Neste contexto, a identificação de compostos seguros e naturais que melhoram a função mitocondrial e o metabolismo de todo o corpo com ou sem efeitos colaterais limitados é de interesse. Entre os compostos naturais,flavonóides de cacau(CF) são consideradas moléculas promissoras, pois seu consumo demonstrou afetar positivamente a saúde cardiovascular, a resistência à insulina ou a função imunológica [7]. De fato, a FC demonstrou melhorar o metabolismo da glicose, e uma administração a curto prazo de FC é seguida por um aumento na sensibilidade à insulina, mesmo em pacientes hipertensos intolerantes à glicose [8,9].

Dentre os flavanóis, a (-)-epicatequina (EPI) é o monômero mais comumente encontrado na FC, e a EPI é considerada a principal molécula biodisponível e bioativa da FC [10]. Um corpo consistente de evidências indica que a suplementação de EPI melhora a função e/ou conteúdo mitocondrial no músculo esquelético [11]. A suplementação de EPI estimula múltiplas vias convergindo no coativador gama do receptor ativado pelo proliferador de peroxissoma 1-alfa(PGCl) e os principais complexos transcricionais nucleares. EPI aumenta diretamente a geração de óxido nítrico, que estimula a biogênese mitocondrial [11]. Concomitantemente, as sirtuínas 1 e 3 também são estimuladas pela suplementação de EPI [11]. O uso de proantocianidinas, oligoméricasflavonóidesque contêm EPI, demonstrou aumentar os níveis intracelulares de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD plus) através do aumento de vários precursores para a biossíntese de NAD e regular os níveis de mRNA de sirtuína -1 no fígado de rato [12]. A família sirtuína (Sirt), uma desacetilase dependente de NAD, compreende sete membros que diferem por sua distribuição subcelular, especificidade de substrato e funções celulares [13]. Sirt1, um membro extensivamente estudado desta família, estimula a biogênese mitocondrial promovendo a desacetilação de PGCl, aumentando assim sua atividade transcricional [14]. Sirte, um sensor metabólico chave, foi estimulado após a administração de EPI [12,15-17]. No entanto, a influência do EPI em outras sirtuínas não foi explorada. A avaliação do efeito EPI será particularmente interessante em sirtuínas localizadas dentro das mitocôndrias (Sirt3, Sirt 4 e Sirt5), que são conhecidas por modular a atividade do ciclo de Krebs e enzimas da cadeia respiratória [18]. Sirt3, que é altamente expresso em tecidos com alto turnover metabólico e conteúdo mitocondrial, é de particular interesse em relação ao seu papel crítico na manutenção da função mitocondrial normal através da desacetilação reversível da proteína lisina [19-21]Além disso, Sirt3 desempenha um papel importante na regulação do metabolismo de todo o corpo [20. Sirt3 mostrou-se alterado no músculo esquelético de modelos de diabetes tipo 1 e tipo 2 e doenças cardiovasculares [22,23]. Além disso, foi sugerido que a ativação de Sirt3 pode representar uma estratégia terapêutica promissora para melhorar a função e o metabolismo mitocondrial [23,24]. Portanto, determinar se Sirt3 está subjacente a parte dos efeitos benéficos da suplementação de FC no metabolismo de todo o corpo e na função mitocondrial é de interesse.

Neste estudo, usamos uma abordagem integrativa para investigar, em camundongos, o efeito de uma suplementação de FC de 15-dia. Nós hipotetizamos que a suplementação de FC iria: (i) modificar o metabolismo de todo o corpo emetabolismo da glicose, (ii) aumentar a função mitocondrial no músculo oxidativo e glicolítico em fibras permeabilizadas, e (ii) aumentar o metabolismo do NAD. Também exploramos o suposto envolvimento de Sirt3 na biogênese mitocondrial induzida pela FC e no metabolismo do corpo inteiro. Nossas hipóteses eram de que os efeitos da FC no metabolismo do corpo inteiro e na massa mitocondrial seriam atenuados em camundongos Sirt3-7.

2. Métodos

2.1. Animais e dieta

Para este estudo, camundongos machos 129S1/SvlmJ 10-com uma semana de idade foram adquiridos nos Laboratórios Jackson (Bar Harbor, ME, EUA). Para determinar se as sirtuínas estão envolvidas na adaptação da massa e função mitocondrial induzida pela administração de FC, também usamos camundongos machos knock-out de corpo inteiro Sirt3 10-de uma semana de idade na mesma cepa do tipo selvagem [25]. O Sirt3/camundongos foram usados ​​para explorar o envolvimento do Sirt3 na biogênese mitocondrial induzida pela FC e nas adaptações do metabolismo do corpo inteiro. Os camundongos foram mantidos em uma sala com temperatura regulada de 23-25 graus e iluminação controlada (12-h ciclos de luz e escuridão). Os animais tiveram acesso a ração para roedores e água da torneira ad libitum.

Após pelo menos uma semana de habituação no biotério, os animais experimentais receberam suplementação de FC por gavagem oral de um extrato natural (302,1 mg/kg de peso corporal duas vezes ao dia por 15 dias) ressuspenso em carboximetilcelulose (Sigma-Aldrich, St. Louis , Mo, EUA). A composição do pó de cacau está descrita na Tabela 1 e foi obtida de Naturex (Quart de Poblet, Espanha). A composição foi estabelecida pelo método de cromatografia líquida de alta eficiência e 100 mg do extrato equivalem a uma média de 475 mg de sementes secas de cacau. Os camundongos controle receberam um veículo composto por teor semelhante de teobromina e cafeína dissolvida em carboximetilcelulose por gavagem oral. A dose diária foi determinada de acordo com a orientação da indústria que converte a dose humana em doses equivalentes animais com base na área de superfície corporal, e multiplicamos a dose humana por 12,3 [26]. A gavagem oral foi realizada por um técnico experiente.

2.2. Coleta de Tecidos1

Vinte e quatro horas após a última gavagem oral, os animais em jejum foram anestesiados com cetamina e xilazina (respectivamente: 100 e 10 mg/kg). A coleta de tecidos foi realizada imediatamente após a obtenção da anestesia. O sóleo e a porção branca do gastrocnêmio foram excisados. As amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em -80 grau para análise subsequente ou usadas para preparar fibras musculares esfoladas.

2.3. Avaliações Metabólicas e de Atividade Física

A calorimetria indireta e a atividade física espontânea foram medidas por meio do Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, EUA). Os camundongos foram alojados individualmente nas câmaras a 28 graus, com luz das 07h00 às 19h00 e acesso ad libitum a ração para roedores e água da torneira. Os camundongos foram aclimatados às gaiolas metabólicas por três dias antes do primeiro dia da coleta de dados. A coleta de dados foi realizada no décimo quinto dia de suplementação. O consumo de oxigênio (VO2), a produção de dióxido de carbono (VCO2) e a taxa de troca respiratória (RER) foram medidos com um fluxo de ar de 0,5 L/min e uma amostra de ar de 0,4 L/ min. A frequência cumulativa relativa percentual (PCRF) do RER foi determinada ao longo de um período de 24-h, conforme descrito anteriormente por Riachi et al. (2004). Resumidamente, o PCRF foi determinado pela adição da frequência de cada ponto de dados à sequência de incremento anterior (de 0,65 a 1,20 com um incremento de 0,01)[27]. A flexibilidade metabólica foi determinada pela inclinação de Hill (valor H) e o percentil 50 (EC50) da curva PRCF e pela medida da amplitude do RER ao longo de 24 h (Riachi et al.2004). A atividade física geral foi monitorada usando um sistema de sensor operado por feixe infravermelho que detectou a atividade dos eixos x e z. Ambas as contagens totais (cada vez que um feixe é quebrado) e contagens ambulatórias (cada vez que um novo feixe é quebrado) foram avaliadas. Uma contagem X-total (X-TOT) é registrada quando o animal se move horizontalmente mais de 0,5 pol e é representativo de atividades repetitivas de pequena escala, como arranhar e escovar. A contagem ambulatorial X (X-AMB) mede a locomoção real registrando uma contagem apenas quando o animal quebra um novo feixe. Uma contagem Z-total (Z-TOT) é registrada quando ocorre 1,5 pol de movimento vertical, ou seja, criação (Abreu-Vieira 2016). Para estimar carboidratos e gordurasoxidaçãode VO2 e VCO2, usamos a tabela de quociente respiratório não proteico de Péronnet e Massicotte usada anteriormente em camundongos [28,29].

2.4. Corpo Total e Massa Gorda

A massa gorda total e a massa magra total foram determinadas em camundongos não anestesiados por análise de interferência de ressonância quantitativa usando o analisador de ressonância magnética de corpo inteiro EchoMRI (Echo Medical System, Houston, TX, EUA). A massa gorda total representou a soma de toda a gordura do corpo. A massa magra total incluiu principalmente músculos e órgãos internos. Sabe-se que a massa muscular esquelética é responsável pela maior parte da massa magra total.

2.5. Teste de tolerância oral à glicose (OGTT)

A glicemia foi medida usando uma gota de sangue coletada da cauda com um glicosímetro (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). OGTT foi realizado em camundongos que ficaram em jejum por 5 a 6 h. A mensuração foi realizada no último dia de suplementação de FC. Após a medição da glicemia basal (tempo O), os camundongos foram então injetados per os com uma solução de 20 por cento de glicose em água estéril na dose de 1,5 g de glicose·kg de peso corporal-1. A glicemia foi medida em 15, 30, 60,90 e 120 min após a injeção da solução de glicose. A área incremental da curva de glicose foi então calculada como uma medida de tolerância à glicose.

2.6. Análise qRT-PCR

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. O cDNA foi sintetizado a partir de RNA total (2 μL) usando o supermix de transcrição reversa iScript para RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, EUA). Os produtos totais de RT foram analisados ​​por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCR) usando o 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG de acordo com as especificações do fabricante (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Canadá). A ciclagem foi realizada em uma cicladora CFX96 (Biorad, Hercules, Califórnia; condições: 95 graus C por 10 min e 40 ciclos de 95 graus por 30 s, 55 graus por 45 s e 72 graus por 45 s). Ao final de cada corrida, a ausência de formação de dímero de primer e a presença de um único amplicon foram confirmadas usando a curva de fusão. Os valores do ciclo de limiar (Ct) foram usados ​​seguindo o método 2-A△Ct para analisar dados de qPCR, com ß-Actina ou HPRT1 como um gene de manutenção【30】. Os valores quantitativos de RT-PCR foram relacionados aos do grupo controle, que foram definidos como 1.

2.7. Atividades enzimáticas

A medição da atividade específica dos complexos da cadeia de transporte de elétrons e da citrato sintase foi realizada espectrofotometricamente como descrito anteriormente [31]. Músculos gastrocnêmios brancos congelados pulverizados (~ 30 mg) foram homogeneizados com um homogeneizador de microesferas vibratório em 500 uL de tampão de homogeneização (120 mM KCl, 20 mM de HEPES, 2mM de MgCl2,1 mM de EGTA e 5 mg·mL-I de BSA , pH 7,4) seguido pela adição de 500 μL de meio hipotônico (fosfato de potássio 25 mM e MgCl 5 mM, pH 7,2). As amostras foram então submetidas a três rodadas dos ciclos de congelamento-descongelamento em nitrogênio líquido. As amostras foram centrifugadas por 10 min a 600×g a 4 graus, e o sobrenadante foi mantido em gelo até a análise. O teor de proteína foi determinado no sobrenadante em triplicado usando um kit Pierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA).

A atividade da citrato sintase (CS) foi determinada espectrofotometricamente a 412 nm após a redução de 2 mM de 5,5'-ditio-bis(2-ácido nitrobenzóico) na presença de 0,1 mM de acetil -CoA e 12 mM de ácido oxaloacético em tampão Tris 200 mM (pH 7,4). O ensaio NADH-decilubiquinona oxidorredutase (complexo I) sensível à rotenona foi realizado a 340 nm usando o aceptor 2,3-dimetoxi-5-metil-6-n-decil-14-benzoquinona （ 80 μM） e NADH como doador de elétrons （200 μM） em tampão Tris 10 mM（pH 8,0）. A adição de 4μM de rotenona foi usada para quantificar a atividade sensível à rotenona. A atividade da citocromo oxidase (complexo IV) foi realizada a 550 nm usando 10 μM de citocromo c reduzido como doador e 2,5 mM de n-dodecil-ß-maltosídeo para permeabilizar ambas as membranas mitocondriais em tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,0).

Todos os ensaios enzimáticos foram determinados em triplicata e os resultados foram relacionados aos do grupo controle, que foi ajustado para 100.

2.8. Avaliação mitocondrial

A respiração mitocondrial e a produção mitocondrial de H2O2 foram estudadas in situ em fibras permeabilizadas por saponina usando os músculos gastrocnêmio e sóleo brancos|1]. Resumidamente, as fibras foram separadas sob o microscópio binocular em solução A a 4 graus (em mM:2,77 CaK2 EGTA,7,23 K, EGTA,6,56 MgCl2, 20 taurinas,0,5 DTT,5{ {50}} Sulfonatos de K-metanos, 20 imidazóis, 5,7 Na2 ATP e 15 creatina-fosfato, pH 7,1) e permeabilizados em solução A com 50 ug·mL-I de saponina por 30 min a 4 graus. A função respiratória mitocondrial foi determinada em um oxímetro equipado com um eletrodo do tipo Clark (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). A câmara foi preenchida com 1 mL de Solução B (em mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl,, 20 taurina, 0,5 DTT, 50 K-metanossulfonatos e 20 imidazóis, pH 7,1) e após a gravação conteúdo de oxigênio da linha de base na câmara, um pacote de 1-2 mg de peso seco de miofibras permeabilizadas foi colocado na câmara, que foi então selada. Após as leituras da linha de base, as seguintes adições foram feitas sequencialmente: palmitoil carnitina e malato (160 μM∶5 mM), glutamato (10 mM), succinato (25 mM), rotenona (0,5 μm), o desacoplador CCCP (1 μM), antimicina -A （8 uM）, e dicloridrato de N, N', N'-tetrametil-p-fenilenodiamina e ascorbato (0,9:9 mM). A respiração foi medida a 23 graus sob agitação contínua. Ao final de cada teste, as fibras foram cuidadosamente removidas da célula xilográfica, manchadas e secas por pelo menos 24 h a ~80C para a determinação do peso da fibra. As taxas de consumo de O2 (JO2) foram expressas em nmol O2 min-1.(mg peso seco)-I. Todas as medidas foram realizadas pelo menos em duplicata.

A liberação líquida de H2O2 pelas mitocôndrias respiratórias foi medida em feixes de fibras permeabilizadas com a sonda fluorescente Amplex Red（20 μM∶excitação-emissão∶563-587 nm）, conforme descrito anteriormente [32]. Após a preparação de fibras permeabilizadas, amostras

destinados para medições de H2O2 foram lavados três vezes em tampão Z(em mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O e 0,5 mg:mL{ {14}} BSA, pH 7,3 a 4 graus). Feixes de fibra ({{20}}.3-1,0 mg de peso seco) foram incubados a 37 graus em uma microcuveta de quartzo com agitação magnética contínua em 600 uL de tampão Z (pH 7,3 a 37C) suplementado com 1,2 U·mL-I de peroxidase de rábano. As leituras de fluorescência da linha de base foram feitas na ausência de quaisquer substratos respiratórios exógenos. As seguintes adições foram então feitas sequencialmente: glutamato (5 mM), succinato (5 mM), rotenona (0,5 uM), ADP (10 mM) e antimicina-A （8 μM）. No final de cada teste, as fibras foram cuidadosamente removido da cuvete, secado e seco para determinar o peso da fibra. As taxas de produção de H2O2 foram expressas em AU·min-1.(mg peso seco)-I e por capacidade de oxfos que correspondeu à respiração mitocondrial máxima em estado de fosforilação. Todas as medidas foram realizadas pelo menos em duplicata.

A capacidade de retenção de cálcio mitocondrial (CRC) foi avaliada em fibras fantasmas do músculo gastrocnêmio branco, conforme descrito anteriormente [33]. Resumidamente, as fibras foram incubadas em uma microcuveta de quartzo sob agitação contínua em 600 μL de tampão CRC (em mM∶250 sacarose, 10 MOPS, 0,005 EGTA e 10P;-Tris, pH 7,3). As fibras foram então expostas a um único pulso de 20 nM de Ca2 plus. As alterações na concentração de cálcio extramitocondrial foram monitoradas fluorometricamente usando verde de cálcio 5N(1 mM: excitação-emissão:505-535 nm). A suscetibilidade do poro de transição de permeabilidade (PTP) foi avaliada medindo-se o tempo necessário para a abertura do PTP, e o CRC foi considerado como a quantidade total de Ca' acumulada pelas mitocôndrias antes de sua liberação. No final de cada teste, as fibras foram cuidadosamente removidas da cuvete, secas e secas para determinar o peso da fibra. Os valores de CRC foram expressos em nM de Ca2 mais por mg de peso seco.

2.9. Análise Western Blot

Proteínas dos músculos gastrocnêmio e sóleo branco foram diluídas em tampão Laemmli e separadas em géis de poliacrilamida pré-moldados Mini-PROTEAN TGX Stain-Free 10 por cento (Biorad); um padrão interno foi carregado em cada gel. A separação eletroforética foi feita a 200 V por 35 min em tampão de migração (25 mM TrisBase,0,2 M glicina e 1 por cento SDS (p/v)). A tecnologia Stain-Free(SF) contém um composto tri-halo patenteado que reage com as proteínas, tornando-as detectáveis ​​através da exposição aos raios UV. A imagem SF foi realizada usando ChemiDoc MP Imager e Image Lab4.0.1 software (Biorad, Hercules, Califórnia, EUA) com um tempo de ativação de coloração 5-min, e os padrões de proteína total foram, portanto, visualizados. As proteínas foram então transferidas para uma folha de nitrocelulose de 0,2 um usando o Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). A qualidade da transferência foi controlada por membranas de imagem usando tecnologia SF. Após a etapa de transferência, as proteínas carbonil foram derivatizadas com dinitrofenil-hidrazina diluindo em HCL 2N e foram finalmente lavadas extensivamente com metanol. As membranas foram bloqueadas com 5 por cento de leite em pó desnatado em solução salina tamponada com Tris contendo Tween-20 (TBST: 15 mM Tris/HCl, pH 7,6.140 mM NaCl e 0,05 por cento Tween-20) para 1h em temperatura ambiente. As membranas foram então incubadas a 4 graus durante a noite ou 2 h à temperatura ambiente com os seguintes anticorpos primários: anticorpo primário de carbonila de proteína (Anti-DNP;#STA-308, Cell Biolabs) e SOD2 (#Ab13533, Abcam). Após três lavagens de 10 min em TBST, as membranas foram sondadas com anticorpos secundários para proteína carbonil (conjugado HRP;#STA-308, Cell Biolabs) e SOD2 (ligado a IgG-HRP anti-coelho;#7074, Sinalização Celular) em solução de bloqueio por 2 h à temperatura ambiente e foram finalmente lavados extensivamente com TBST. A diluição de anticorpos primários e secundários foi otimizada para cada anticorpo. A detecção de quimioluminescência foi realizada usando ECL Clarity (Biorad), e a captura de imagens foi feita com ChemiDocMP. Todas as imagens foram analisadas no software Image Lab 4.0.1. A normalização das intensidades de sinal da proteína foi realizada após a quantificação dos respectivos níveis de proteína total nas imagens de SF, controle da amostra e padrões internos.

2.10. Medição de NAD

Os níveis totais de NAD e NADH foram medidos em gastrocnêmio branco homogeneizado usando um kit comercial (#K337-100, Biovision, EUA) e seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, o pool total de NAD (NADt= NADt e NADH) foi extraído. Para cada uma das amostras extraídas, metade da amostra foi aquecida a 60 graus por 30 minutos para decompor o NADt, mantendo o NADH intacto. Ambas as amostras de NADt e NADH foram misturadas com a enzima de ciclagem de NAD e a absorbância foi medida a 450 nm. O NADt e o NADH foram quantificados comparando com a curva padrão do NADH e normalizando para mg de proteína. Finalmente, a razão de NAD plus (NADt-NADH) para NADH foi calculada. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

2.11. Estatisticas

Os dados são relatados como média ± desvio padrão (DP). A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de normalidade de D'Agostino-Pearson. A análise dos dados foi realizada por meio do teste t de Student e ANOVA de duas vias (grupo e tempo) para medidas repetidas seguido do teste post hoc de Bonferroni usando Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Foi aplicado um nível bilateral de 5 por cento para o erro tipo I.

3. Resultados

3.1. Composição Corporal e Metabolismo do Corpo Inteiro

Quinze dias de suplementação de FC, em camundongos do tipo selvagem (WT), não modificaram o peso corporal(p=0.091), massa magra(p=0.{{24} }73) e massa gorda avaliada por EcoRM (p=0.89;Figura 1A). As taxas de consumo de O2 expressas por massa magra foram significativamente maiores no ciclo escuro (8±8 por cento, p=0.042), enquanto permaneceram semelhantes no ciclo claro (p =0 .392; Figura 1B.). Não houve alterações na atividade locomotora (dados não mostrados). Camundongos CF mostraram um aumento significativo do gasto de energia de corpo inteiro em 15±15 por cento (p =0.042;Figura 1C) e em ingestão alimentar (0,08±0,01 vs.0,11±0,01 g por peso corporal magro, respectivamente grupo FC e WT, p=0,013, Figura 1D).

A suplementação de FC modificou significativamente o metabolismo de todo o corpo: o principal efeito do RER mais alto no grupo de FC foi observado ao longo de 24 h(p=0.023, Figura 2A) e o RER médio ao longo de 12 h foi maior no grupo CF em ciclos claros e escuros (mais 5±3 por cento ,p=0.035 e mais 9±4 por cento , respectivamente, p=0.026). Além disso, a suplementação com FC promoveu o uso de carboidratos (CHO) (51± 13 por cento do consumo de energia dependeu da oxidação de CHO no grupo FC vs.37 ±12 por cento no grupo controle durante o ciclo de luz, p=0.108 e 71 ± 21 por cento no grupo CF vs. 47 ± 24 por cento no grupo de controle durante o ciclo escuro, p=0.004; Figura 2B.). No entanto, quando expresso em kJ, não houve diferença na oxidação de CHO nem na oxidação de ácidos graxos (oxidação de CHO: 3,7±1,4 kcal·d-1 no controle vs.4,4±1,7 kcal. massa corporal magra-1). d-1 em CF,p=0.33 e oxidação de ácidos graxos: 2,3± 1,0 kcal·d-Iin controle vs.2,6±0,87 kcal.massa corporal magra-1.d{{ 50}}em CF,p=0.608).A análise de PRCF de RER revelou um aumento de valores de EC50 no grupo CF (p=0,009; Figura 2D), o que significa que CF induz uma mudança para uma maior utilização de carboidratos. Uma diminuição da inclinação de Hill foi observada no grupo FC (valores de H: 25,16±4,44 nos controles vs. 12,79±3,96 no grupo FC,p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Bioenergética mitocondrial

Testamos o efeito da suplementação de FC na energética das mitocôndrias no músculo gastrocnêmio branco e sóleo em camundongos WT. Maior respiração mitocondrial usando substratos IV complexos nos músculos gastrocnêmio e sóleo brancos foi observada (p=0.004 ep=0.028, respectivamente; Figura 3A, B). Não foram observadas modificações nas razões respiratórias CII/CI e CIV/CI (p =0.899 ep =0.701 para o gastrocnêmio branco ep=0.693 ep{{ 11}}.912 para os músculos sóleos, respectivamente, dados não mostrados). Além disso, as atividades do complexo, I, IV e citrato sintase foram significativamente aumentadas no músculo gastrocnêmio branco (respectivamente: mais 31 ± 27 por cento ,p=0.004; mais 28 ± 38 por cento ,p=0 0,027; mais 35±38 por cento ,p= 0.009; mais 14±13 por cento ,p=0.040; Figura 3C). A capacidade das mitocôndrias para oxidar palmitoil-carnitina tende a aumentar em o gastrocnêmio branco (mais 24±12 por cento ,p =0.096; Figura 3D), enquanto nenhuma diferença foi observada no sóleo (p =0.363). As taxas relativas de respiração estimulada por palmitoil-carnitina permaneceram inalteradas quando expressas em função da respiração do complexo I (62±11 no grupo controle vs.64±20 no grupo FC no gastrocnêmio branco e 70±18 vs.72±16 no sóleo). Em seguida, exploramos a sensibilidade à abertura de PTP induzida por Ca plus no gastrocnêmio branco. Conforme mostrado na Figura 3E, nem o tempo de abertura do PTP nem a capacidade de retenção de Ca² foram modificados após a suplementação de CF (p=0.608 ep=0.943, respectivamente).

A avaliação de mRNA de genes envolvidos na biogênese mitocondrial mostrou uma regulação positiva de 70 por cento do mRNA de NRF1, enquanto nenhuma diferença foi relatada para PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa e Cox2 (Tabela 3). Exploramos, em algumas amostras, o efeito da suplementação de CF em supercomplexos mitocondriais (Figura S1, Materiais Suplementares). A análise densitométrica sugere que a suplementação com FC aumentou o conteúdo geral de supercomplexos sem adaptação qualitativa ou rearranjos. De fato, a densidade respiratória foi melhorada em 58 por cento usando sondas complexo I e complexo Ⅱ e em 93 por cento usando sonda complexo I. Da mesma forma, o conteúdo do complexo I e do complexo III incorporado em supercomplexos foi maior no grupo CF.

A suplementação de FC reduz a emissão de ROS mitocondrial. Enquanto a emissão de H2O2 permaneceu inalterada tanto no gastrocnêmio branco quanto no sóleo quando expressa por peso seco (Figura 4A, B, respectivamente), as taxas diminuíram quando expressas por conteúdo mitocondrial (Figura 4C). Um principal efeito positivo da suplementação de FC foi observado em várias condições no gastrocnêmio branco (p<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Marcadores de Estresse Oxidativo no Músculo Esquelético

O nível de estresse oxidativo da proteína celular em camundongos WT não foi afetado pela suplementação de CF, pois o conteúdo celular de SOD2 foi semelhante nos grupos experimental e controle no gastrocnêmio branco e sóleo (Figura 4E). Além disso, nenhuma diferença foi observada na carbonilação de proteínas no gastrocnêmio branco e sóleo (Figura 4F). Além disso, nenhuma diferença na expressão de catalase e MnSod mRNA foi observada após a suplementação de FC (Tabela 3).

3.4. Metabolismo NAD

O conjunto total de nucleotídeos de piridina aumentou após a suplementação de CF em 36±33 por cento (p=0.012). Especificamente, os teores de NAD e NADH aumentaram no gastrocnêmio branco (respectivamente em 69±60 por cento, p{{6 }}.026 e 29± 42 por cento ,p=0.017;Figura 5A,B) e a razão NAD mais /NADH tendeu a aumentar no grupo FC (p =0.084).Não efeito significativo foi observado para Sirt3 mRNA (p=0.096), NMNAT mRNA (p=0.094) e Sirt1 mRNA(p =0.869); Tabela 3 ).

3.5. Resposta de metabolismo celular e de corpo inteiro após suplementação de FC em Sirt3-/camundongos

Examinamos o efeito da suplementação de FC em camundongos Sirt{{0}}. A composição corporal como peso, massa magra e massa gorda não foi diferente entre os grupos FC e controle (p= 0,52,p=0,66,p=0,45,respectivamente; Figura 6A). Da mesma forma, o gasto energético diário não foi afetado pela suplementação de FC ({{10}},38±0.{{40}}1 Kcal.corpo magro) massa-1.dia-1 nos controles vs. 0,39 ± 0,01 Kcal·massa corporal magra-1.dia-1 em CF, p=0.502; Figura 6B). O RER foi semelhante entre os dois grupos nos ciclos claro e escuro (p=0.301; Figura 6C), e a oxidação do substrato não foi afetada pela suplementação de CF (44 ± 17 por cento do consumo de energia dependeu da oxidação de CHO no grupo controle vs. 50 ± 11 por cento no grupo FC durante a fase clara, p=0.209 e 65±19 por cento no grupo controle vs. 77±21 por cento no grupo FC durante a fase escura, p=0.395; Figura 6D). A flexibilidade metabólica avaliada pela amplitude do RER ao longo de 24 h permaneceu semelhante entre os dois grupos (0,19±0,05 no controle vs.0,20±0,03 no CF,p=0.604), enquanto a inclinação do PRCF foi diminuída no grupo CF (valores H: 17,77±4,38 em controle vs. 12,79±3,93 em CF, p=0,039).

Em seguida, comparamos o efeito da suplementação de FC nas atividades das enzimas mitocondriais. A suplementação de CF falhou em aumentar a atividade enzimática do complexo I,I,IV e CS em Sirt3-/camundongos como observado anteriormente em WT (respectivamente: p=0.623,p=0 ( respectivamente:p=0.027 e P=0.045)

4. Discussão

Neste estudo, fornecemos uma análise integrativa do efeito da ingestão de FC. Observamos que a ingestão crônica de FC melhorou a respiração mitocondrial e reduziu a produção de H2O2, avaliada em seu ambiente de miofibra, enquanto a suscetibilidade de abertura de PTP permaneceu inalterada. A ingestão de FC aumentou o metabolismo do NAD, apoiando o envolvimento das vias da sirtuína nas adaptações mitocondriais observadas. Também observamos modificações no metabolismo de todo o corpo em direção a uma maior capacidade de usar carboidratos como substrato principal, sugerindo que as adaptações mitocondriais provavelmente contribuíram para a adaptação observada no metabolismo de todo o corpo.

4.1. Metabolismo

A administração dietética de flavonóides do cacau foi identificada como uma estratégia eficaz para aliviar a intolerância à glicose, permitindo oportunidades para melhorar as doenças metabólicas [34]. Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores que relataram um aumento da tolerância à glicose após a ingestão de flavonoides [35,36]. Os mecanismos propostos para este efeito envolvem um aumento na translocação de GLUT4 para a membrana celular, um aumento na fosforilação da AMPK e a regulação positiva da expressão do gene UCP-2 no músculo esquelético [8,37] . Além disso, a ingestão de FC foi associada à melhora da sensibilidade à insulina em humanos[8]. Após 15 dias de consumo de chocolate amargo, observou-se uma diminuição do modelo de avaliação da homeostase do índice de resistência à insulina em indivíduos saudáveis ​​concomitantemente com um aumento do índice quantitativo de verificação de sensibilidade à insulina e do índice de sensibilidade à insulina [8]. Também observamos um aumento concomitante na tolerância à glicose e flexibilidade metabólica em camundongos WT, que se refere à capacidade de um organismo de adaptar a oxidação do combustível à disponibilidade de combustível [38]. Curiosamente, enquanto a capacidade oxidativa mitocondrial prejudicada e a oxidação do substrato relacionado foram associadas à resistência à insulina 39, o treinamento de exercícios de resistência aumentou o conteúdo mitocondrial, a sensibilidade à insulina e a flexibilidade metabólica [38]. Portanto, nossos resultados são específicos para a suplementação de FC e não são influenciados pela atividade espontânea.

O efeito positivo da FC na flexibilidade metabólica, bem como o aumento da atividade dos complexos mitocondriais, foram atenuados em camundongos Sirt3-7, indicando que os efeitos positivos da FC ocorrem pelo menos parcialmente através da Sirt3. Esses resultados apoiam descobertas anteriores e o papel central da Sirt3 na regulação da flexibilidade metabólica [24]. Nossos resultados sugerem que um aumento na função mitocondrial pode aumentar a flexibilidade metabólica. No entanto, além da função mitocondrial, o quociente respiratório basal, a taxa de eliminação de glicose, a capacidade de armazenamento de lipídios no tecido adiposo e a concentração plasmática de ácidos graxos livres também foram identificados como fatores determinantes da flexibilidade metabólica e devem ser considerados [40]. Estudos futuros devem avaliar os determinantes celulares da flexibilidade metabólica mais profundamente para aprofundar nossa compreensão das causas subjacentes do aumento da flexibilidade metabólica após a suplementação de FC.

A avaliação do metabolismo de todo o corpo revelou um aumento na oxidação relativa de CHO após a suplementação com FC. Este resultado contrasta com um estudo anterior que relatou um aumento na lipólise após uma ingestão aguda de flavanóis ou uma suplementação de duas semanas com flavan-3-óis em camundongos [36]. Além das diferenças na composição do extrato, esses achados contraditórios podem resultar dos efeitos pleiotrópicos do NO. É bem aceito que a ingestão de FC estimula a produção ou a biodisponibilidade do metabolismo do NO [7]. Por um lado, o NO estimula o transporte e a captação de glicose no músculo esquelético. A estimulação da produção de NO em miotubos derivados de linhagem celular por insulina ou peróxido de hidrogênio resultou em um aumento da translocação de GLUT4, que foi reduzida com a inibição da nNOS [41]. Além disso, o NO pode aumentar o transporte de glicose em uma via independente de insulina, levando a um aumento nos níveis de GMP cíclico e AMPK [42], que promove a oxidação da glicose no músculo esquelético do rato independente da disponibilidade e oxidação de ácidos graxos [43]. Por outro lado, o NO promove a oxidação de ácidos graxos, reduzindo o nível de malonil-CoA via inibição da acetil-CoA carboxilase e ativação da malonil-CoA descarboxilase no músculo esquelético. Enquanto observamos uma mudança para uma menor proporção relativa de uso de ácido graxo como substrato com FC, não houve diferença em relação aos valores absolutos expressos em kJ. Isso sugere que o aumento do gasto energético observado com a suplementação de FC depende de um aumento na oxidação da glicose. Portanto, esses resultados suportam a ideia de que o consumo de FC aumenta a sensibilidade à insulina e promove a oxidação da glicose sem um efeito concomitante na capacidade de oxidação dos ácidos graxos. Esses resultados levantam a questão da relevância do uso de flavanóis de cacau no contexto de uma dieta rica em gordura. Estudos futuros devem avaliar um possível efeito nocivo de uma associação de suplementação de FC e dieta hiperlipídica.

4.2. Função mitocondrial

A administração dietética de flavanóis de cacau demonstrou melhorar a função mitocondrial, incluindo (i) respiração mitocondrial e atividades de enzimas da cadeia de transporte de elétrons; (i) liberação de H2O2 mitocondrial, que reflete a produção de espécies reativas de oxigênio mitocondriais (ROS); e (i) capacidade de retenção de cálcio mitocondrial que reflete a suscetibilidade à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) (para revisão, consulte [11]. Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores; no entanto, nosso estudo foi o primeiro a avaliar o efeito de Suplementação de FC na função mitocondrial avaliada in situ em fibra permeabilizada e em diferentes tipos musculares. Diferentemente dos estudos anteriores sobre mitocôndrias isoladas, a avaliação da função mitocondrial em fibra permeabilizada preserva a morfologia mitocondrial, interações funcionais com outros componentes intracelulares [1] e evita a estrutura mitocondrial ruptura durante o processo de isolamento mitocondrial [32] Portanto, é importante estudar a função mitocondrial em preparações de tecidos onde a estrutura mitocondrial é preservada e todo o pool mitocondrial é representado para melhor avaliar a resposta ao tratamento.

Estudos anteriores realizados em cultura de células ou in vivo em camundongos mostraram que a suplementação com EPI, que é considerada a principal molécula bioativa na FC, aumenta a respiração máxima estimulada pelo ADP (por exemplo, respiração do estado 3) quando as mitocôndrias são energizadas com uma combinação de energia substratos que alimentam vários locais ao longo da cadeia respiratória [45-49]. Consistente com esses resultados, observamos um efeito principal da suplementação de FC na respiração mitocondrial em músculos oxidativos e glicolíticos. Para determinar se esse aumento está relacionado ao aumento da massa mitocondrial ou à remodelação dos complexos respiratórios mitocondriais, avaliamos os supercomplexos mitocondriais do músculo quadríceps. Acredita-se que essas estruturas supramoleculares diminuem a produção de ROS, estabilizam ou auxiliam na montagem de complexos individuais, regulam a atividade da cadeia respiratória e previnem a agregação de proteínas na membrana mitocondrial interna rica em proteínas [50-52]. Apesar de um número limitado de medidas, a análise visual dos resultados (Materiais Suplementares) sugere que a suplementação de FC induz um aumento da massa mitocondrial, refletido por um aumento em todas as espécies supercomplexas, em vez de reorganizações específicas do complexo da cadeia respiratória. Coletivamente, esses resultados sugerem que a FC promove um aumento da massa mitocondrial sem adaptação qualitativa dos arranjos complexos da cadeia respiratória.

Durante a respiração mitocondrial, quantidades variáveis ​​de superóxido são formadas e podem ser metabolizadas para formar outros tipos de EROs. Embora a produção excessiva de ROS pelas mitocôndrias esteja envolvida em um amplo espectro de patologias, baixas concentrações fisiológicas de ROS podem ter efeitos benéficos, como proteção contra agentes infecciosos e participação na sinalização celular [2,54]. Estudos anteriores realizados in vivo em roedores e humanos e modelos de cultura de células relataram efeitos benéficos da suplementação de FC na produção de ROS e vários sistemas antioxidantes [11]. Por exemplo, gavagem oral com EPI durante 15 dias aumenta a atividade da SOD2 e da catalase nos músculos quadríceps de camundongos [17]. Embora a produção de ROS mitocondrial não tenha sido amplamente avaliada, observamos que os níveis de produção de ROS foram semelhantes quando os valores foram expressos por peso muscular, enquanto a produção foi reduzida quando expressos por massa mitocondrial, sugerindo que ocorrem adaptações qualitativas para manter as concentrações fisiológicas de ROS. Além disso, não observamos nenhum efeito da CF em SOD2 nem danos induzidos por ROS avaliados por carbonilação de proteínas. Enquanto a FC aumenta os pools de proteínas antioxidantes, incluindo os níveis amplamente divulgados de SOD2 e catalase [16,17,55], essa adaptação nem sempre foi associada a uma diminuição nos danos induzidos por ROS [56-59]. Esses dados suportam a teoria de que baixos níveis de produção de ROS são necessários para a homeostase celular normal [2]. Coletivamente, esses resultados sugerem que, concomitantemente ao aumento da massa mitocondrial, a FC promove adaptações mitocondriais qualitativas para aumentar sua capacidade antioxidante e manter baixos níveis de produção de EROs.

4.3. Biogênese mitocondrial

A massa mitocondrial é o resultado da interação entre a biogênese mitocondrial e a mitofagia. Nosso estudo se concentrou na biogênese mitocondrial ativada pelo consumo de polifenóis [60]. A biogênese mitocondrial é o processo celular que melhora a massa mitocondrial. Este processo complexo e altamente regulado envolve vários fatores de transcrição, receptores de hormônios nucleares e coativadores de transcrição que atuam coletivamente para coordenar mudanças na expressão de genes codificados de DNA nuclear e mitocondrial [61]. Estudos anteriores tentaram identificar quais vias podem estar subjacentes à biogênese mitocondrial induzida pela suplementação de FC. A estimulação da sinalização dependente de NO emergiu como uma via central envolvida na biogênese mitocondrial. A suplementação de FC aumenta a geração de NO ao inibir a enzima arginina degradante arginase, que aumenta a disponibilidade de L-arginina para a biossíntese de NO [62,63]. Além disso, usando um inibidor de eNOS, o efeito estimulador da epicatequina na biogênese mitocondrial foi parcialmente atenuado [17]. Esses resultados sugerem o envolvimento de outras vias de sinalização para estimular a biogênese mitocondrial.

Recentemente, Aragonés et al. (2016) relataram que as proantocianidinas dietéticas, membros da família dos polifenóis, aumentam o NAD hepático mais o metabolismo, aumentando a via de biossíntese de agora o NAD mais e a atividade de Sirte de maneira dose-dependente em ratos [12]. Além disso, o fígado exporta precursores de NADt para outros órgãos, como o músculo esquelético, que possuem menor capacidade de sintetizar NAD, aumentando a possibilidade de estender os efeitos observados no fígado para todo o organismo [64]. Enquanto alguns estudos relataram um efeito da suplementação de FC no conteúdo de proteína Sirt1, atividade ou mRNA [12,15-17,65,66], o envolvimento do metabolismo de NAD na biogênese mitocondrial após a suplementação de FC usando perda ou ganho de função nunca foi testada. Embora um nocaute específico do músculo tenha sido preferível em relação aos camundongos Sirt3 KO de corpo inteiro usados ​​em nosso estudo, nossos resultados sugerem que a FC melhora o metabolismo do NAD, e o Sirt3 está envolvido nessa melhoria da atividade da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial induzida pela suplementação. Os efeitos positivos observados na atividade dos complexos mitocondriais após a suplementação de CF não foram observados usando camundongos Sirt{17}} e uma maior atividade das atividades do complexo I e IV foi observada após a suplementação de CF apenas em WT. Essas observações estendem trabalhos anteriores mostrando que Sirt3 desempenha um papel fundamental na função mitocondrial ]67. Coletivamente, esses achados sugerem que as sirtuínas, por meio da modulação do metabolismo do NAD, estão envolvidas na melhora da massa mitocondrial observada após a suplementação com FC. 4.4. Limites

Os grãos de cacau são compostos por uma mistura de flavonóides monoméricos, oligoméricos e poliméricos. Entre os flavanóis, o EPI parece ser o monômero polifenólico mais abundante encontrado em produtos de cacau, representando até 35% do conteúdo de polifenóis [68]. O EPI foi estabelecido como a principal molécula bioativa subjacente aos benefícios associados à suplementação de cacau e chocolate [47,69]. No entanto, metabólitos de EPI (EPIm) podem estar envolvidos nos efeitos biológicos induzidos por EPI observados em estudos in vivo. O EPIm pode atingir concentrações plasmáticas mais altas do que o EPI[70]. Além disso, grandes diferenças no EPIm foram observadas entre as espécies. De fato, 80% da EPIm presente em humanos não foi detectada em ratos, enquanto a semelhança entre camundongos e humanos foi ligeiramente mais favorável, pois os dois principais metabólitos humanos foram detectados [70]. Usamos extrato de CF enriquecido contendo até cinco vezes mais EPI do que grãos de cacau não fermentados [71]. Além disso, o teor de EPI foi reduzido em 10-20 por cento pela fermentação e diminuiu de maneira dependente da temperatura durante a torrefação [71,72]. Coletivamente, esses dados sugerem que atenção deve ser dada apenas ao conteúdo de EPI ao avaliar os benefícios da suplementação de EPI na saúde humana, e os presentes resultados devem ser considerados com cautela antes de extrapolar os mecanismos subjacentes observados em humanos.

5. Conclusões

A suplementação diária de FC por 15 dias leva a melhorias na função mitocondrial nos músculos oxidativos e glicolíticos. Os presentes resultados sugerem que o aumento da respiração mitocondrial resulta em um aumento da massa mitocondrial enquanto o nível celular de produção de ROS foi mantido, sugerindo adaptações qualitativas dentro das mitocôndrias. Concomitante ao efeito celular sobre o metabolismo do NO descrito anteriormente [73], a FC modula o metabolismo do NAD, que estimula a atividade das sirtuínas. Sirt3 desempenha um papel central nas adaptações mitocondriais e na flexibilidade metabólica após a suplementação com FC. Como as sirtuínas são alvos recentes na patogênese de várias doenças, como diabetes ou asma [74,75l, mais estudos explorarão o potencial interesse do uso da FC como um ativador natural das sirtuínas.

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