Dihidroflavonas benziladas e alcalóides derivados de isoquinolina da casca de Diclinanona Calycina (Annonaceae) e suas citotoxicidades

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Abstrato: Diclinanona calycina RE Fries popularmente conhecido como "enviro", é uma espécie da família Annonaceae endêmica do Brasil. Em nossa busca contínua por compostos bioativos de plantas Annonaceae da Amazônia, a casca de D.calycina foi investigada por técnicas cromatográficas clássicas que produziram treze compostos (alcalóides e flavonóides) descritos pela primeira vez em D. calycina, bem como no gênero Diclinanona. A estrutura destes compostos isolados foi estabelecida por análise extensiva usando espectroscopia 1D/2D-RMN em combinação com MS. Os alcalóides isolados foram identificados como pertencentes às subclasses: isoquinolina simples, thali online (1); aporfina, anonaína (2); oxoaporfina, liriodenina (3); benziltetra-hidroisoquinolinas, (S)-(mais)-reticulina(4); dehidro-oxonorreticulina (3,4-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinil)(3-hidroxi-4-metoxifenil)-metanona)(5 );( mais )-1S,2R-reticulina Ng-óxido (6); e (mais)-1S,2S-reticulina N-óxido (7); tetra-hidroprotoberberina, coreximina(8); e pavina, bisnorargemonina (9). Enquanto oflavonóidespertencem ao benziladodihidroflavonas, isorhamnetina (10), dichamanetina (11) e uma mistura de uvarinol (12) e isouvarinol (13). O Composto 5 é descrito pela primeira vez na literatura como um produto natural. A atividade citotóxica dos principais compostos isolados foi avaliada contra linhagens celulares cancerosas e não cancerosas. Entre os compostos testados, os resultados mais promissores foram encontrados para as dihidroflavonas benziladas dichamanetina (10), e a mistura de uvarinol (12) e isouvarinol (13), que apresentou atividade citotóxica moderada frente aos compostos testados.célula cancerosalinhas (<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). A dichamanetina (11) apresentou atividade citotóxica contra HL-60 e HCT116 com valores de IC50 de 15,78 ug·mL-I(33,70 umol·LI) e 18,99 ug∶mL-（40,56 umol. L-）, respectivamente, enquanto a mistura de uvarinol（12） e isouvarinol (13) demonstrou atividade citotóxica contra HL-60, com valor de IC5 de 9,74 ugs.mL-1, e HCT116, com IC50 valor de 17,31 ug. mL-I. Essas atividades citotóxicas podem ser atribuídas à presença de um ou mais grupos hidroxibenzil presentes nessas moléculas, bem como à posição em que esses grupos estão ligados. As atividades citotóxicas da reticulina, anonaína e liriodenina foram previamente estabelecidas, sendo a liriodenina o composto mais potente.

Palavras-chave: Diclinanona calycina; alcalóides e dihidroflavonas benziladas; atividade citotóxica

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1. Introdução

Annonaceae é uma grande família de árvores e arbustos tropicais e subtropicais, compreendendo cerca de 112 gêneros e 2440 espécies. Várias espécies são conhecidas por seus frutos comestíveis e propriedades medicinais ]2]. A investigação fitoquímica prévia com algumas espécies de Annonaceae levou ao isolamento e caracterização de diferentes classes de metabólitos secundários, como monoterpenos, diterpenos, triterpenos, lignanas,flavonóides, fenilpropanóides derivados de asarona, acetogeninas e principalmente alcalóides típicos derivados de isoquinolina [3-7]. Alguns desses metabólitos secundários isolados de espécies de Annonaceae exibiram importantes atividades biológicas, como propriedades anti-inflamatórias e inibidoras de urease [8,9], tripanocida [10,11], leishmanicida [11,12], antimalárica [4,13] , antimicrobiana [4,14,15], ação antioxidante e antirreumática [9,15] e, principalmente, atividade citotóxica contra diferentes linhagens de células tumorais humanas [4,6,11,16-21].

Embora a família Annonaceae seja considerada uma família primitiva e bem estudada, poucos estudos fitoquímicos e/ou farmacológicos têm sido realizados com suas espécies[3]. Estudos fitoquímicos e/ou farmacológicos têm se concentrado principalmente em espécies dos gêneros Annona, Asimina e Cananga, devido à sua grande importância econômica, e em algumas espécies dos gêneros Duguetia, Guatteria e Xylopia[5]. Apesar do grande crescimento nos últimos 20 anos em relação aos estudos fitoquímicos e farmacológicos, o número de espécies investigadas ainda é muito pequeno em relação ao grande número de espécies reconhecidas. Atualmente, de acordo com os bancos de dados científicos da Web of Science, Scopus e SciFinder, apenas cerca de 15% das espécies de Annonaceae descritas têm qualquer estudo fitoquímico e/ou farmacológico correspondente.

Entre as espécies pouco estudadas estão as do gênero Diclinanona Diels. Este gênero pertence à tribo Annoneae, da subfamília Annonoideae, e ocorre apenas na América do Sul tropical (principalmente na região Amazônica). É um gênero composto por apenas três espécies, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas e Diclinanona tessmannii Diels, que ocorrem como árvores [22-24].D.calycina (sinonímia Xulopia calycina Diels) é um gênero de 8 a Árvore de 30 m de altura, popularmente conhecida como “envireira” e “enviro”, distribuída por toda a bacia amazônica no Brasil, Peru e Venezuela [23]. D.calycina é superficialmente semelhante a Xylopia por suas flores com pétalas alongadas e estreitas, mas é diferente por seus monocarpos lenhosos, indeiscentes, globosos e de paredes espessas [23,24].

Estudos anteriores com D. calycina relatam apenas estudos farmacológicos. O primeiro estudo descreve a investigação da atividade antimicrobiana de extratos metanólicos, clorofórmios e aquosos contra os microrganismos Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus e Candida albicans usando o método de difusão em gel [25]. O segundo relata a investigação da atividade antimicrobiana de extratos orgânicos (diclorometano: metanol 1:1) e aquosos contra o microrganismo Enterococcus faecalis utilizando o ensaio de microdiluição em caldo (MDBA) e ensaio de difusão em disco (DDA)[26]. Assim, em nossa busca contínua por novos produtos naturais bioativos de Annonaceae da floresta amazônica, este estudo teve como objetivo investigar as propriedades fitoquímicas e farmacológicas da casca de D.calycina. Neste relatório, treze compostos (nove alcalóides e quatro benziladosdihidroflavonas) foram isolados e identificados pela primeira vez em D.calycina, bem como no gênero Diclinanona. Além disso, a citotoxicidade dos principais compostos foi investigada contra B16-F10, HepG2, K562 e HL{{ 4}} linhas de células tumorais usando o ensaio Alamar blue.

2. Resultados e Discussão

2.1. Elucidação Estrutural dos Compostos

Tendo descoberto a presença de compostos contendo nitrogênio no extrato metanólico usando o reagente de Dragendorff, ele foi submetido ao tratamento ácido-base de acordo com a metodologia de Costa et al. [12] resultando em frações alcalóides e neutras. Uma alta concentração de compostos contendo nitrogênio foi observada na fração alcalóide que foi submetida à análise cromatográfica. As sucessivas separações cromatográficas, conforme descrito na seção Extração e Isolamento, levaram ao isolamento e identificação de treze constituintes químicos (1-13, Figura 1), nove alcalóides derivados de isoquinolina 1-9 e quatro dihidroflavonas benziladas 10-13. As estruturas desses compostos isolados (Figura 1) foram estabelecidas por extensa análise usando espectroscopia de RMN 1D e 2D em combinação com MS (Dados Suplementares), bem como comparação com dados da literatura.

O Composto 5 foi obtido como um pó amorfo marrom e testado positivo para o reagente de Dragendorff. Mostrou uma molécula protonada em m/z328 [M plus H]' no LR-ESI(plus)MS compatível com a fórmula molecular C18H1NO5. Os espectros de 'H e 13C-NMR de 5(Tabela 1) foram consistentes com os de reticulina (4)[27, exceto pela ausência do grupo metil ligado a nitrogênio (CH3-N) e o sinal de o grupo metina na posição 1, que foi substituído por um sinal em δc 165,1 no espectro típico de 13C-RMN do grupo imina conjugado com um grupo carbonil em bc 192,8. No espectro 'H-NMR, três hidrogênios de campo inferior em δH 6,88（1H,d, J=8,4 Hz, H-5'）,5H7,57（1H,d, J{{33} }.0Hz, H-2'）e δH 7,60（1H, dd, J=8,4 e 2,0 Hz, H-6') , revelou a presença de um sistema de acoplamento ABX. Dois sinais singuletos em 6H 6,90(1H,s, H-8) e 6,71(1H, s, H-5) indicaram a presença de 1,2,4,5-anel fenil tetrasubstituído. Além disso, o espectro H-NMR de 5 também mostrou sinais para dois grupos metoxi ressoando em bH 3,93 (3H, s) e 6H 3,95 （3H,s）, e sinais para dois grupos metileno ressoando em δμ 2,79（2H,t, J=7,8 Hz） e 6H 3,89(2H,t,/=7,8 Hz), atribuídos a H-4 e H-3, respectivamente (Tabela 1) . Esses dados indicaram que o alcalóide 5 possui um esqueleto de benziltetrahidroisoquinolina [28-30].

Esses grupos foram estabelecidos com base no mapa de correlação 'H-13C de duas e três ligações do experimento HMBC-NMR (Figura 2 e Tabela 1). Esta análise revelou que o hidrogênio em δH 3,89 （H-3） mostrou uma correlação 'H-13C de três bandas com os carbonos em 6c130.1（4a） e δc165.{ {42}}（C-1）e duas ligações lH-13C correlação com o carbono atδc 25.4(C-4), confirmando a presença do grupo imina na molécula. Por outro lado, os sinais em δH 7,57 （H-2'） e δH 7,60（H-6'）mostram três ligações lH-13C correlação com os carbonos em δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）e δc192,8（C-7）,and5c116,0（C-2'）,6c 151,4 (C-4') e c 192,8(C-7'), respectivamente, estabelecendo o grupo carbonila na molécula (Figura 2 e Tabela 1). Portanto, com base nesses dados de RMN, o composto 5

foi estabelecido como o alcalóide benziltetrahidroisoquinolina 34-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinil)(3-hidroxi-4-metoxifenil)-metanona, que foi denominado desidro-oxonorreticulina. Este alcalóide é descrito pela primeira vez na literatura como um produto natural. Seu primeiro e único registro foi descrito por Dörnyei et al. em 1982 【31】como produto de origem sintética. Apenas os dados de 'H-NMR são descritos com algumas multiplicidades indeterminadas. Assim, as atribuições completas para todos os deslocamentos químicos 1H e 13C-NMR foram estabelecidas por experimentos de correlação de uma ligação (HSOC) e duas e três ligações (HMBC)' H-13C-NMR, e foram descritas em Tabela 1.

Os compostos 6 e 7 foram identificados como os alcalóides de benziltetra-hidroisoquinolina ( plus )-1S,2R-reticulina-N-óxido e( mais )-1S,2S-reticulina-N-óxido, respectivamente. Os dados de H-NMR desses alcalóides foram comparados com os dados descritos por Lee et al. [28]usando o mesmo solvente deuterado (CD3OD) e algumas inconsistências foram observadas (Tabela 1), principalmente em relação a H-1, H-8 e H, C-NO. Não há dados de 13C-NMR descritos para esses alcalóides na literatura. Com base nos dados limitados de 1H- e 13C-NMR, bem como nas ambiguidades observadas para essas moléculas, experimentos de 'H e 13C 1D e 2D NMR foram realizados para determinar suas atribuições e multiplicidades corretas.

A posição correta do hidrogênio H{{0}} e H-1 de ambos os isômeros 6 e 7 foi estabelecida com base no mapa de correlação de três ligações 'H-13C do HMBC -Experiência de RMN （Figura 2）. Para o isômero 6, a análise revelou que o hidrogênio em δH 5,78（H-8）apresentou correlação 'H-13C de três ligações com os carbonos em 6c 79,8（C-1）,δc120 .6（4a）, e δc 149,4 （C-6）, enquanto o hidrogênio em δH 4,13 （H-1）mostrou três ligações 'H-13C correlação com os carbonos em c 60,7（C-3）,6c 115,7 （C-8）,δc 120,6（C-4a）, e 131,2 （C-1'), estabelecendo assim o posições corretas dos hidrogênios H-8 e H-1 para o isômero 6. Esta atribuição pode ser confirmada pela análise do hidrogênio em δH 6,76（H-5）que mostrou três ligações Correlação H-13C com os carbonos em δc 27,0（C-4）,δc 127,1（C-8a） e δc 145,7 （C-7）（Figura 2). Para o isômero7 a análise revelou que o hidrogênio em δH 6,30 （H-8）apresentou três ligações 'H-13Ccorrelação com os carbonos em δc 79,4（C-1）,δc 122,8（ 4a）, e δc 148,9 （C-6）, enquanto o hidrogênio em δH 4,46 （H-1）mostrou três ligações H-13C correlações com os carbonos em δc 62,9 （C{ {82}}）,5c 115,5（C-8）, bc 122,8（C-4a）, e 131,4（C-1'）, estabelecendo assim as posições corretas dos hidrogênios H -8 e H-1 para o isômero 7. Esta atribuição também foi confirmada pela análise do hidrogênio em δH 6,71 （H-5）que mostrou três ligações lH-13C correlações com os carbonos em δc26,3（C-4）, δc 126,9（C-8a） e 6c 146,1（C-7）(Figura 2). O experimento NOESY também foi realizado para estabelecer a estereoquímica correta dos isômeros 6 e 7. Neste experimento, a forte correlação NOE de H-1（δH 4.13）e H,CN(5 3.15) indicou a -orientação do oxigênio no isômero 6. Por outro lado, nenhuma correlação NOE óbvia entre H-1(6H 4,46) e HAC-N(5H 3,20) pode ser encontrada no experimento 2D-NOESY para 7, indicando a orientação do oxigênio no isômero 7 (Figura 2). Essas pequenas diferenças nos deslocamentos químicos desses isômeros são claramente observadas devido à estereoquímica do nitrogênio afetada pelas posições e do oxigênio. As comparações dos dados de 'H-e 13C-RMN obtidos para os compostos 6 e 7 com dados de moléculas com estruturas próximas, como hexapetalina A e hexapetalina B [30] suportam os dados descritos na Tabela 1 sem ambiguidade.

Os compostos 1-4 e 8-13 foram identificados como talifolina (1) [32], anonaína (2) [33]liriodenina (3)[10,34], (S)-( plus )-reticulina ( 4)[27], coreximina (8) [34,35], bisnorargemonina (9)[36], isochamanetina (10) [37], dichamanetina (11) [37] e uma mistura de uvarinol (12) e isouvarinol (13) [37] com base em seus perfis espectroscópicos e comparação com valores da literatura. Os espectros de lH-e 13C 1D e 2D-RMN, bem como os espectros de massa de todos os compostos isolados, estão disponíveis como Materiais Suplementares.

Do ponto de vista quimiofenético (um novo termo para quimiossistemática de plantas/quimiotaxonomia de plantas), é importante notar que a presença de flavanonas C-benziladas e diidrocalconas C-benziladas são um tipo especial de flavonóides derivados da bem conhecida flavanona pinocembrina e foram descritos particularmente em espécies do gênero Uoaria pertencentes à família Annonaceae [3,38-42]. A presença destes compostos em D. calycina sugere estreitas relações quimiofenéticas com Uoaria. Por outro lado, mais investigações devem ser realizadas com outras partes da planta, bem como outras espécies de Diclinanona para confirmar esta relação quimiofenética. Flavanonas e chalconas são comuns nas plantas superiores, mas a adição de grupos benzílicos é bastante rara e parece estar limitada nas Annonaceae ao gênero Uoaria [3,39-42] e agora ao gênero Diclinanona. Grupos benzil presumivelmente surgem de uma via C6-C1, mas a funcionalidade o-hidroxi é incomum. A ausência de substituintes no anel B em todos esses flavonóides de Uoaria e Diclinanona pode ser relacionada com a observação anterior sobre os flavonóides de Popowia cauliflora [38].

Os alcalóides derivados de isoquinolinas isolados e descritos neste trabalho já foram registrados em várias espécies de Annonaceae em diferentes gêneros. Alguns destes, como liriodenina e anonaína, são considerados marcadores quimiofenéticos, e a presença desses alcalóides em D.calycina reforça ainda mais a relação desses marcadores quimiofenéticos na família Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Vale ressaltar que, segundo Zidorn [44], estudos quimiofenéticos são definidos como estudos que visam descrever a matriz de metabólitos secundários especializados em um determinado táxon, como já observado em vários trabalhos publicados [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Assim, os estudos quimiofenéticos contribuem para a descrição fenética dos táxons, à semelhança das abordagens anatômicas, morfológicas e cariológicas, que já foram reconhecidas como de grande importância para o estabelecimento de sistemas "naturais", e que continuam sendo de extrema importância para a descrição de organismos classificados com a ajuda de métodos moleculares modernos [44].

2.2. Ensaio Citotóxico

A atividade citotóxica in vitro dos compostos isolados (Tabela 2), exceto para os compostos 2, 3,5 e 8 (devido ao seu baixo rendimento), foi avaliada contracélula cancerosalinhagens HL-60 (leucemia promielocítica humana), MCF-7(adenocarcinoma de mama humano), HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), HCT116 (carcinoma de cólon humano) e linha celular não cancerosa MRC{{5} } (fibroblasto de pulmão humano) usando o ensaio Alamar blue após 72 h de incubação.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Dichamanetina (11) apresentou atividade citotóxica contra HL-60 e HCT116 com valores de IC50 de 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L-1） e 18,99 ug·mL-1（40,56 umol.L-1）, respectivamente. A mistura de uvarinol (12) e isouvarinol(13) demonstrou atividade citotóxica contra HL-60, com valor de ICs0 de 9,74ug∶mL-1, e HCT116, com valor de ICs0 de 17,31 ug∶mL{ {30}}. Entre as dihidroflavonas benziladas, apenas a isorhamnetina (10) apresentou atividade citotóxica contra HepG2 com valor de IC50 de 19,79 ugs:mL-1(54,65 umol.L-1). De acordo com a literatura, as dihidroflavonas benziladas são descritas com propriedades citotóxicas [39-42]. Entre os descritos neste trabalho, isorhamnetina (10), dichamanetina (11) e uvarinol (12) são descritos dentro de propriedades citotóxicas in vitro contra linhagens de células tumorais humanas de carcinoma de nasofaringe (KB) e leucemia linfocítica P-388 (PS) com valores de IC50 de 5,3 e 4,1,4,8 e 1,8 e 5,9 e 9,7, ug.mL-1, respectivamente [39,40]. Essas diferentes atividades podem ser atribuídas à presença de um ou mais grupos hidroxibenzil presentes nas moléculas, bem como à posição em que esses grupos estão ligados. No entanto, mais investigações são necessárias para confirmar esta observação.

A atividade citotóxica in vitro dos alcalóides derivados de isoquinolina anonaína (2), liri-adenina (3) e (S)-( mais)-reticulina (4) foi recentemente descrita por Menezes et al.[2{{16] }}], Souza et al. [6] e Costa et al. [43] com ênfase na liriodenina, que demonstrou potente atividade citotóxica contra as linhagens celulares de câncer B{{10}}F10(melanoma de camundongo), HepG2(carcinoma hepatocelular humano), HL{{13 }} (leucemia promielocítica humana) e K562 (leucemia mielocítica crônica humana） com valores de IC5s0 abaixo de 10,0 μmol.L-1【43】. Anonaína mostrou atividade moderada contra B16-F10, HepG2, HL60 , e K562 com valores de IC50 inferiores a 19,0 umol.L-1[20]. (S)-( plus )-Reticulina mostrou atividade moderada apenas contra HepG2 com valores de IC50 de 15,35 μmol L-1【 6,20】.

3. Materiais e Métodos

3.1. Procedimentos Experimentais Gerais

As rotações ópticas em metanol (MeOH) foram registradas com um polarímetro P{0}} (Jasco, Tóquio, Japão) a 589 nm. Experimentos de RMN 1D e 2D foram adquiridos em CDCl. (clorofórmio-d) ou CDCl mais gota de CD, OD (metanol-du e CD, COCD3(acetona-d6) a 298 K em um espectrômetro AVANCE I HD NMR (Bruker, Billerica, MA, EUA) operando a 11,75 T (Mão 13C a 500 e 125 MHz, respectivamente) e em um espectrômetro Bruker AVANCE I 600 NMR operando a 14,1 T('H and13Cat 60{ {63}} e 150 MHz respectivamente). Todos os deslocamentos químicos lH- e 13C-NMR （δ）são apresentados em ppm em relação ao sinal de tetrametilsilano a 0.00 ppm como uma referência interna, e as constantes de acoplamento (D) são dadas em Hz. O espectrômetro de NMR foi equipado com uma sonda de detecção inversa multinuclear 5- mm (experiências de RMN 1D e 2D) com um gradiente z. Uma ligação (HSQC) e dois e experimentos de correlação de três ligações (HMBC)1H-13C-NMR foram otimizados para a constante de acoplamento média' JcH e LRJ(cH de 140 e 8 Hz, respectivamente. Para análise de espectrometria de massa de baixa resolução (LC-MS), o amostras dos compostos isolados foram ressuspensas em metanol (grau HPLC), criando o estoque k soluções (1 mg·mL-1). Alíquotas (5 uL) das soluções estoque foram ainda diluídas para 5 ug·mL- e analisadas por infusão direta em um espectrômetro de massa triplo quadrupolo, modelo TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, CA, EUA), equipado com ionização por eletrospray (ESI) ou fontes de ionização química à pressão atmosférica (APCI). Condições ESI-MS: tensão de pulverização, 5kV; gás de revestimento, 10 unidades arbitrárias (arb); gás auxiliar, 5arb; gás de varredura, 0arb; temperatura capilar, 250 graus; tensão capilar, 40 V; lente do tubo, 70 V; faixa de massa, m/z 100 a 1000. Condições APCI-MS: corrente de descarga, 5 μA; temperatura do vaporizador, 350 graus; pressão do gás da bainha, 25 unidades arbitrárias （arb）; pressão de gás de varredura de íons, 0,0 arb; pressão de gás auxiliar, 10 arb; temperatura capilar, 250 graus C; deslocamento da lente do tubo, 70 V; deslocamento do skimmer, 0 V; faixa de massa, m/z 100 a 1000. Argônio foi usado como gás de colisão, e os espectros MS/MS foram obtidos usando energias de colisão variando de 25 a 30 eV. Gel de sílica 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EUA, malha 70-230) foi usado para a cromatografia em coluna (CC), enquanto gel de sílica 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha, 0,25 mm, alumínio) foi utilizado para análise e preparativa com cromatografia em camada fina (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, vidro). Os compostos foram visualizados por exposição sob luz UV254/365, por pulverização com reagente p-anisaldeído seguido de aquecimento em placa quente e por pulverização do reagente de Dragendorff.

3.2.Material Vegetal

Na presente investigação, o material botânico (casca) de D.calycina foi coletado em 27 de maio de 2017 na Reserva Adolpho Ducke (coordenadas geográficas: 02 graus 53'36,1S e 59 graus 58'28,9"W), Manaus, Estado do Amazonas , Brasil, e identificado pelo Prof. Dr. Antonio Carlos Webber, taxonomista de plantas do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM).Um exemplar de comprovante número 10.810 foi depositado no Herbário do DB/UFAM. o acesso (espécime) foi registrado no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) com o registro A70EDCD.

3.3. Extração e Isolamento

A casca de D.calycina foi inicialmente seca em temperatura ambiente por 24 h e em seguida seca em estufa com circulação de ar por 48 h em temperatura de 40 graus, e posteriormente pulverizada em moinho de quatro facas (Marconi, Piracicaba, SP , Brasil) para obtenção do material em pó (1340 g). Em seguida, foi realizada uma maceração exaustiva com hexano (8 × 4 L) seguida de MeOH (8 × 4 L). As soluções extrativas obtidas foram concentradas em evaporador rotativo a pressão reduzida (40-50 graus) para dar os extratos de hexano (24,85 g) e MeOH (199,43 g), respectivamente.

A análise de TLC revelou com reagente de Dragendorff indicou uma alta presença de alcalóides no MeOHextract. Portanto, uma alíquota de extrato de MeOH (188,30 g) foi inicialmente submetida a uma extração ácido-base para dar frações alcalóides (5,46 g) e neutras (4,47 g). Posteriormente, parte da fração alcaloide (5.0g) foi submetida a coluna cromatográfica de sílica gel (CC) previamente tratada com solução de NaHCO3 a 10 por cento [12], eluída com hexano (100 por cento), hexano-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 e 10:90,v/o), CH2Cl2 (100 por cento), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 e 10:90,0/u), EtOAc (100 por cento), EtOAc-MeOH(95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 e 10:90, v/o) e, finalmente, MeOH dando 250 frações (30 mL cada). Após avaliação TLC usando uma mistura de CH2Cl2-MeOH nas proporções de 95:05, 90:10, 85:15 e 80:20 como o sistema eluente (v/o), as amostras semelhantes foram reunidas para dar 16 frações (F1 a F16).

A fração F5 (181,2 mg) da CC inicial eluída com hexano-CH,Cl2 (50:50 a 10:90,v/o) foi submetida a uma nova sílica gel CC usando a mesma metodologia acima eluída com hexano (100 por cento), hexano -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 e 10:90,v/o), CH,Cl ,(100 por cento), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 e 10:90 ,o/),EtOAc(100 por cento), EtOAc-MeOH(85:15,70:30,50:50, 30:70 e 15:85,/o),e MeOH (100 por cento) gerando 118 frações( 15 mL cada) que foram agrupados em 12 subfrações (F5.1 a F5.12), de acordo com a avaliação da análise de TLC usando uma mistura de CH2Cl2-MeOH nas proporções de 95:05 e 90:10.Subfração F5 0,1 (28,9 mg) eluído com hexano (100 por cento) foi submetido a um TCLE preparativo eluído com CH,Cl-MeOH (95:05, v/v, duas eluições) proporcionando 2 (1,4 mg) e 3 (1,7 mg), respectivamente. As subfrações F5.4 (21,5 mg) eluídas com hexano-CH,C(80:20,vo), F5.5 (16,7 mg) eluídas com hexano-CH,Cl(80:20,70:30,60;40. e 50:50 ,v/) e F5.6(15,4 mg) eluídos com hexano-CHCl2 (50:50,40:60 e 30:70, v/o) foram reunidos (53,6 mg) e também submetidos a uma TLC preparativa eluída com CH,Cl-MeOH (95:05, v/u, duas eluições) dando 3 (8,9 mg).

Fração F6(2099,1 mg) do CC inicial eluído com hexano-CHCl(10:90,v/)), CH2Cl, (100 percent ), e CH,Cl2-EtOAc (90:10 a 10:90, o/o) foi submetido a uma nova sílica gel CC usando a mesma metodologia acima eluída com os mesmos sistemas de solventes gerando 140 frações(30 ml cada). Após avaliação TLC usando uma mistura de CH2Cl2-MeOH nas proporções de 95:05, 90:10 e 85:15 como o sistema eluente (o/o), as amostras semelhantes foram agrupadas para dar 13 subfrações (F6 .1 a F6.13). A subfração F6.6 (1541,3 mg) foi submetida a um novo CC de sílica gel usando a mesma metodologia acima eluída com os mesmos sistemas de solventes gerando 120 frações (30 mL cada) que foram analisadas por TLC (usando a mesma metodologia acima) fornecendo 12 novas subfrações (F6.6.1 a F6.6.12). A subfração F6.6.2(17,0 mg) eluída com hexano-CH,Cl,(60:40 e 50:50,v/v) foi submetida a uma TLK preparativa eluída com CH2Cl2-MeOH(90:10, v/o, uma eluição) resultando em 3 (1,4 mg). Subfração F6.6.3 (643,3 mg) eluída com hexano-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 e 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 por cento) e CH2Cl2-EtOAc(90:10 e 80:20,o/o) foi submetido a um TL preparativo eluído com CH2Cl2-MeOH (90 :10, vfo, uma eluição) produzindo uma nova subfração F6.6.3.1 (161,8 mg) que foi submetida a uma nova TLC preparativa eluída com EtOAc-MeOH (90:10, v/o, uma eluição) gerando 4(148,2 mg). A subfração F6.6.4 (90,2 mg) eluída com CH2Cl2-EtOAc (70:30 e 60:40,o/o) foi submetida a uma TLK preparativa eluída com CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, uma eluição) produzindo 1 (1,4 mg) e 4 (50,1 mg), respectivamente. A subfração F6.6.5(83,4 mg) eluída com CH,Cl-EtOAc(60:40 e 50:50, o/o) também foi submetida a uma TLL preparativa eluída com CH,Cl2-MeOH(90:10, ufo, uma eluição) proporcionando novamente 1(1,5 mg) e 4(45,5 mg), respectivamente. A subfração F6.6.6 (101,4 mg) eluída com CH,Cl2-EtOAc (50:50 e 40:60, v/)) foi submetida a uma TLC preparativa eluída com CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, uma eluição) dando 8 (3,4 mg) e outra subfração F6.6.6.1 (48,8 mg). Esta subfração (F6.6.6.1) foi submetida a uma TLK preparativa eluída inicialmente com EtOAc-MeOH (85 :15, vo, uma eluição) e posteriormente CHCl-MeOH(90:10,v/v,uma eluição) resultando novamente em 4(37,4 mg). Para este procedimento, a placa cromatográfica foi inicialmente eluída com a fase móvel EtOAc-MeOH (85:15, v/o, uma eluição). Após esta eluição, a placa cromatográfica foi seca para remover o solvente e posteriormente submetida a uma nova eluição com a fase móvel CH,Cl,-MeOH(90:10,vf,uma eluição) rendendo 4. Subfração F6.6.7 ( 109,0 mg) eluído com CH,Cl2-EtOAc(40:60,30:70,20:80 e 10:90,vfo) foi submetido a uma TLC preparativa eluída com CH,Cl2-MeOH (90:10,vo, uma eluição) dando outra subfração F6.6.7.1 (24,8 mg) que foi submetida a uma nova TLC preparativa eluída inicialmente com EtOAc-MeOH (85:15, v/o, uma eluição) e posteriormente CH2Cl2-MeOH (90:10,vfo,uma eluição) resultando em 9 (11,1 mg). O procedimento de isolamento usado para 9 foi o mesmo descrito anteriormente para 4. A subfração F6.6.10 (92,0 mg) eluída com EtOAc-MeOH (60:40 e 50:50, v/o) foi submetida a uma TLK preparativa eluída com CH, Cl,-MeOH (90:10, v/o, uma eluição) produzindo 5(1,7 mg) e 6(7,8 mg), respectivamente. A subfração F6.6.11 (326,0 mg) eluída com EtOAc-MeOH (50:50,40:60,30:70,20:80 e 10:90,v/o) foi submetida a uma TLL preparativa eluída com CHCl- MeOH (90:10,v/o,uma eluição) produzindo 1(2,4 mg) e7 (12,5 mg), respectivamente.

A fração F7 (692,4 mg) da CC inicial eluída com EtOAc(100 por cento) e CHCl2-EtOAc (95:05,90:10,85:15 e 75:25,ofo) foi submetida a um novo gel de sílica CCusando a mesma metodologia descrita para CC inicial com os mesmos sistemas de solventes gerando 110 frações (30 mL cada). Após avaliação TLC usando uma mistura de CH2Cl2-MeOH nas proporções de 95:05, 90:10 e 85 :15 como o sistema eluente (o/o), as amostras semelhantes foram reunidas para dar 12 subfrações (F7.1 a F7.12).F7.8(147.4 mg) eluída com CH,Cl2- EtOAc (50:50,40:60 e 30:70,v/o por cento) foi submetido a uma TLC preparativa eluída com CHCl-MeOH (95:05, vfo, uma eluição) proporcionando 10(5,4 mg) e 11( 120,6 mg), respectivamente. F7.9(144,2 mg) eluído com CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 e 10:90, v/o por cento) também foi submetido a uma TLK preparativa eluída com CH,Cl,-MeOH( 95:05,vo, uma eluição) proporcionando 11 (91,2 mg) e uma mistura de 12 e 13 (39,4 mg), respectivamente.

Talifolina (1): Pó amorfo castanho;» H-NMR e 13C-NMR de acordo com a literatura [32]; LR-ESI(mais)-MS [M mais H]* mais m/z 208.

Anonaína (2): Pó amorfo castanho; 1H-NMR e 13C-NMR de acordo com a literatura [33]; LR-ESI(mais)-MS [M mais H] mais m/z 266.

Liriodenina (3): Cristais amarelos (CH,Cl-MeOH 3:1); 1H-NMR e 13C-NMR de acordo com a literatura [10,34]; LR-ESI(mais)-MS [M mais H] mais m/z 276.

(S)-( plus )-Reticulina(4): Pó amorfo castanho; [ ]p25 mais 71,60(c 0,05 g/100 mL, MeOH); 1H-NMR e 13C-NMR de acordo com a literatura [27;LR-ESI(mais)-MS [M mais H] mais m/z 30.

3,4-Dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinil)(3-hidroxi-4-metoxifenil)-metanona (Dehidro-oxonorreticulina)(5 ): Pó amorfo castanho; Dados de 'H e 13C-RMN, ver Tabela 1; LR-ESI(mais)-MS [M mais H] mais m/z 328.

( plus ){{0}}S,2R-Reticulina N-óxido(6): Pó amorfo castanho; [lp25 mais 136,4 (c0,146 g/100 mL, MeOH); 1Hand 13C-NMR dados, consulte a Tabela 1;LR-APCI(mais)-MS [M mais H] mais m/2346

( plus ){{0}}S,2S-Reticulina N.-óxido (7): Pó amorfo castanho; []p25 mais 394,5 (c 0,03 g/100 mL, MeOH);'H e 13C-NMR dados, ver Tabela 1;LR-APCI(mais)-MS [M mais H] mais m/z346.

Coreximina (8): Pó amorfo amarelo claro;[ ]p25 mais 201,1(c 0,08g/100mL, MeOH)'H-NMR e 13C-NMR de acordo com a literatura[34,35];LR- ESI(mais)-MS [M mais H] mais m/z 328.

Bisnorargemonina (9): Pó amorfo castanho; 1H-NMR e 13C-NMR de acordo com a literatura [36]; LR-APCI(mais)-MS [M mais H] mais m/z 328.

Isochamanetina (10):Pó amorfo amarelo claro; [p25-12.4(c 0,5 g/100 mL, MeOH)'H-RMNe 13C-RMN de acordo com a literatura[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanetina (11):Pó amorfo amarelo;[ ]D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH); 1H-NMR e 13C-NMR de acordo com a literatura [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Uma mistura de uvarinol(12) e isouvarinol(13): Pó amarelo amorfo; H-NMR e 13C-NMR de acordo com a literatura [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z 573.

3.4. Ensaio Citotóxico In Vitro

3.4.1.Células

HL-60 (leucemia promielocítica humana), MCF-7 (adenocarcinoma de mama humano), HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), HCT116 (carcinoma de cólon humano) e MRC-5 (fibroblasto de pulmão humano) as linhas celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e foram cultivadas conforme recomendado pelo guia de cultura de células animais ATCC. Todas as linhagens celulares foram testadas para micoplasma usando um kit de coloração de micoplasma (Sigma-Aldrich) para validar o uso de células livres de contaminação.

3.4.2. Ensaio de citotoxicidade

Para o ensaio de citotoxicidade, a viabilidade celular foi quantificada pelo método Alamar blue, conforme descrito anteriormente [{{0}}]. Para todos os experimentos, as células foram plaqueadas em 96-placas de poços. Os constituintes químicos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brasil) e adicionados a cada poço e incubados por 72 h. Doxorrubicina (cloridrato de doxorrubicina, pureza maior ou igual a 95 por cento, Laboratório IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) foi usado como controle positivo. Ao final do tratamento, 20 μL de uma solução estoque (0,312 mg/mL) de resazurina (Sigma-Aldrich Co.) foi adicionado a cada poço. Absorvâncias a 570 nm e 600 nm foram medidas usando um leitor de microplacas SpectraMax190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). A concentração semi-inibitória (IC50) foi obtida por regressão não linear com intervalos de confiança de 95 por cento (IC95 por cento) usando o software GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; San Diego, CA, EUA).

4. Conclusões

A investigação fitoquímica da casca de D.calycina levou ao isolamento e identificação de treze compostos(1-13); nove alcalóides derivados de isoquinolina (1-9) e quatroflavonóides(10-13). Os alcalóides pertencem às seguintes subclasses: isoquinolina simples, thali online(1);aporfina, anonaína (2); oxoaporfina, liriodenina (3); benzil-tetrahidroisoquinolinas, (mais )-reticulina(4), de hidro-oxonorreticulina(3,4-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinil)({{13} }hidroxi-4-metoxifenil)-metanona)(5), 1S,2R-reticulina Ng-óxido(6), e 1S,2S-reticulina N.-óxido (7); tetra-hidroprotoberberina, coreximina (8); e pavina, bisnorargemonina(9). Enquanto os flavonóides pertencem às dihidroflavonas benziladas, isorhamnetina (10), dichamanetina (11) e uma mistura de uvarinol (12) e isouvarinol (13). Os compostos isolados são descritos pela primeira vez em D.calycina, bem como no gênero Diclinanona.

A atividade citotóxica dos compostos isolados (exceto anonaína, liriodenina, 1,2-dihidro-oxonorreticulina e coreximina) foi avaliada contra o câncer (HL-60, MCF-7, HepG2 e HCT116) e linhas de células não cancerosas (MRC-5). Entre eles, os resultados mais promissores foram observados para dihidroflavonas benziladas dichamanetina (10), e

a mistura de uvarinol(12) e isouvarinol (13) que mostrou atividade citotóxica moderada contra as linhagens de células cancerígenas testadas （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetina (11) mostrou atividade citotóxica contra HL-60 e HCT116 com valores de IC50 de 15,78ug·mL-1 （33,70 μmol-L-1）e 18,99 ug·mL-I（40,56 μmol .L-1）, respectivamente, enquanto a mistura de uvarinol （12） e isouvarinol (13) demonstrou atividade citotóxica contra HL-60, com valor de IC50 de 9,74 ug∶mL-I, e HCT116, com IC50 valor de 17,31 ug·mL-1. Esses resultados nas linhagens de células tumorais também são descritos pela primeira vez para as dihidroflavonas benziladas. As atividades citotóxicas da reticulina, anonaína e liriodenina foram previamente estabelecidas, sendo a liriodenina o composto mais potente.

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que as espécies da família Annonaceae são uma fonte promissora de compostos biologicamente ativos com propriedades citotóxicas, e sugerem a continuação de sua investigação em outros modelos de ensaios biológicos.

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