Suplementação dietética de arsênico induz estresse oxidativo ao suprimir o fator nuclear eritróide 2-fator 2 relacionado nos fígados e rins de galinhas poedeiras

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ABSTRATO

Este estudo investigou os efeitos da suplementação dietética de arsênio no desempenho de postura, qualidade dos ovos, histopatologia hepática e renal e estresse oxidativo nos fígados erins de galinhas poedeiras. Além disso, a via do fator nuclear eritróide {0}}relacionada ao fator 2 (Nrf2)-Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1) foi explorada para revelar o mecanismo molecular do estresse. Quinhentas e doze 40-galinhas poedeiras Hyline White foram alocadas aleatoriamente em 4 grupos com 8 baias por grupo e 16 galinhas por baia. As doses de arsênio administradas aos 4 grupos foram 0,95, 20,78, 40,67 e 60,25 mg/kg. Os resultados revelaram que a suplementação dietética de arsênico reduziu significativamente a produção de ovos de galinha (P, 0,05), peso médio do ovo (P, 0,05), unidades Haugh (P, 0,05), altura do albúmen (P, 0,05) e resistência da casca do ovo (P, 0,05). A suplementação dietética de arsênico também induziu o acúmulo de arsênico e danos histopatológicos no fígado erim. De acordo, a suplementação dietética de arsênio aumentou significativamente a alanina aminotransferase sérica (P, {{0}}.05), aspartato aminotransferase (P, 0.05) , níveis de nitrogênio ureico no sangue (P, {{10}}.05) e ácido úrico (P, 0.05). Após a exposição ao arsênico, as atividades da superóxido dismutase (SOD) (P, 0,05), catalase (P, 0,01), glutationa redutase (P, 0,05), glutationa peroxidase (P, 0,05) e conteúdo de glutationa (P, 0,05) foram diminuiu significativamente, enquanto o nível de malondialdeído foi significativamente aumentado (P, 0,05) no fígado e rim. Correlações positivas ocorreram entre as atividades de enzimas antioxidantes e a expressão gênica de enzimas antioxidantes no fígado e no rim, exceto para a expressão do gene da superóxido dismutase de manganês renal e a atividade da SOD. Além disso, a expressão hepática e renal de mRNA de Nrf2 foi positivamente correlacionada com a expressão de genes antioxidantes e negativamente correlacionada com a expressão de Keap1 mRNA. Em resumo, a suplementação dietética de arsênico induziu estresse oxidativo ao suprimir a via Nrf2-Keap1 nos fígados e rins de galinhas poedeiras.

Palavras-chave:arsênico, galinha poedeira, Nrf2-via Keap1, estresse oxidativo, rins

INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, os riscos ambientais têm ocorrido em concentrações crescentes. O arsênico é um tóxico altamente metalóide, mesmo em concentrações muito baixas em rações para aves. Seu papel fisiológico em aves está bem definido, pois é necessário para a síntese de metabólitos de metionina, incluindo a cisteína. As concentrações recomendadas de arsênico em alimentos para aves estão entre {{0}},012 e 0,050 mg/kg (Balo s et al., 2019). No entanto, uma investigação anterior mostrou que as concentrações de arsênico em alimentos para aves provavelmente estão além dos níveis de tolerância dos animais quando os alimentos para aves contêm algas marinhas, carbonato cúprico, sulfato cúprico pentahidratado, trihidróxido de cloreto de dicobre ou carbonato ferroso (Adamse et al., 2017) . Kazi et al. (2013) relataram que existe uma grande possibilidade de que o arsênico em rações para aves afete a saúde de frangos de corte. As quantidades excessivas de arsênico nos alimentos para aves e seus efeitos toxicológicos nas aves ainda são problemas sérios. Quando o excesso de arsênio entra em um animal, pode induzir uma variedade de efeitos adversos à saúde, como imunotoxicidade, toxicidade respiratória, toxicidade cardiovascular, hepatotoxicidade, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade, neurovirulência, toxicidade reprodutiva e genotoxicidade. Os efeitos toxicológicos do arsênico em órgãos viscerais foram documentados principalmente em estudos com mamíferos, sugerindo que o arsênico representa um risco para as funções hepática e renal (Waalkes et al., 2004; Mazumder, 2005; Zheng et al., 2014). No entanto, os efeitos toxicológicos da exposição ao arsênico na dieta sobre o fígado e o rim de galinhas poedeiras ainda não são claros. A toxicidade do arsênico em animais está intimamente relacionada ao estresse oxidativo, que perturba o equilíbrio pró/antioxidante (Flora, 2011). Quando o arsênio entra em uma célula, ele se liga à glutationa intracelular (GSH) ou a oxida, levando à geração de radicais livres. Como sabemos, os genes citoprotetores podem ser regulados por vários fatores de transcrição intracelular, incluindo fator nuclear eritróide 2-fator 2 relacionado (Nrf2), proteína ativadora 1 e fator nuclear kappa-B (Kwak et al., 2001 ). O fator de transcrição Nrf2 é uma molécula vital que regula os níveis de estresse nas células. Sob condições quiescentes, o Nrf2 interage com a proteína 1 associada a ECH do tipo Kelch (Keap1), que está localizada principalmente no citoplasma. Quando o estresse oxidativo é desencadeado, o Nrf2 transloca do citoplasma para o núcleo após a separação da molécula Keap1 e então ativa as expressões de genes citoprotetores (Motohashi e Yamamoto, 2004). Posteriormente, genes citoprotetores regulam ainda mais as atividades de enzimas antioxidantes a jusante, incluindo superóxido dismutase (SOD), glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase (CAT). Um estudo anterior mostrou que o fator de transcrição Nrf2 participa do estresse induzido por arsênico em mamíferos (Sinha et al., 2013). No entanto, os efeitos exatos da exposição ao arsênico sobre os efeitos do estresse oxidativo em galinhas poedeiras permanecem indefinidos. No presente estudo, investigamos o efeito da suplementação dietética de arsênio no desempenho de postura, qualidade dos ovos, índices bioquímicos séricos, alterações histopatológicas hepáticas e renais e estresse oxidativo em galinhas poedeiras. Além disso, a via Nrf2-Keap1 foi explorada para identificar o mecanismo molecular nos fígados erinsde galinhas poedeiras. Este estudo fornece alguns insights sobre a teoria biológica da toxicidade do excesso de arsênico na dieta no fígado erimde galinhas poedeiras.

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MATERIAIS E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Todos os procedimentos experimentais realizados em animais foram implementados de acordo com a Associação Chinesa de Ciências de Animais de Laboratório.

Animais, Dietas e Design Experimental

Quinhentas e doze {{0}} galinhas poedeiras Hyline White de semanas de idade com condições corporais semelhantes foram selecionadas aleatoriamente e separadas em 4 grupos. Cada grupo continha 8 repetições de 16 aves. Arsênio foi adicionado à dieta basal de milho e feijão em 4 concentrações diferentes (0, 20, 40 e 60 mg/kg; na forma de ácido arsanílico) (Tabela 1 do Suplemento). As concentrações de arsênio na alimentação foram medidas por espectrometria de absorção atômica com geração de hidretos de acordo com metodologia anterior (Dos Passos et al., 2012). As concentrações reais de arsênico nos 4 grupos foram 0,95, 20,78, 40,67 e 60,25 mg/kg. As aves foram mantidas em gaiolas (60 ! 50 ! 50 cm3) equipadas com 1 comedouro e 2 bebedouros tipo chupeta, sendo alojadas 2 galinhas por gaiola. Durante todo o período experimental, as galinhas tiveram livre acesso a ração e bebida. Todo o experimento durou 10 semanas, incluindo um período de ajuste de 1-semana e um período experimental formal de 9-semana.

Desempenho de postura e qualidade do ovo

Durante todo o período experimental, os índices de desempenho de postura foram registrados diariamente, incluindo consumo de ração, produção de ovos ao dia e peso do ovo (PE). As determinações do consumo de ração e EW em cada grupo foram realizadas usando uma balança de peso sensível (XS2002S, Mettler Toledo, Zurique, Suíça). A razão de conversão alimentar (TCA) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: FCR 5 ingestão de ração em gramas/massa de ovos em gramas. Um total de 40 ovos de cada grupo foram coletados aleatoriamente para medir os parâmetros de qualidade dos ovos dentro de 24 h após a oviposição no final do experimento. Os ovos foram pesados ​​em balança sensível (XS2002S, Mettler Toledo). Em seguida, a unidade Haugh, a altura do albúmen, a cor da gema e a resistência da casca do ovo foram determinadas por um testador de ovo digital (DET6000, Nabel Co. Ltd., Kyoto, Japão). A espessura da casca do ovo com a membrana interna foi determinada na região afiada, média e romba do ovo usando um micrômetro com relógio comparador(547-350, Mitutoyo, Kawasaki, Japão), e os valores médios foram usados ​​para a análise estatística.

Coleta de Amostras

Após o experimento de criação, 32 aves de cada grupo foram selecionadas aleatoriamente e sacrificadas por corte das veias do pescoço. Amostras de sangue foram coletadas em tubos de centrífuga estéreis e imediatamente transportadas ao laboratório para dosagem dos índices bioquímicos séricos. Em seguida, as aves foram dissecadas e o fígado erinsforam retirados da cavidade abdominal. O fígado erimamostras foram cortadas em 4 partes. Uma parte foi imediatamente fixada em paraformaldeído a 4% para exame histopatológico. As outras 3 partes foram imediatamente armazenadas em nitrogênio líquido para posterior determinação dos parâmetros de estresse oxidativo, deposição de arsênico e expressão gênica.

Ensaio de Deposição de Arsênico

Após a medição da qualidade do ovo, a gema foi separada do albúmen. O acúmulo de arsênio no albúmen e na gema foi medido por espectrometria de absorção atômica com geração de hidretos de acordo com metodologia anterior (Dos Passos et al., 2012). O acúmulo de arsênio no ovo inteiro foi calculado pela soma do teor de arsênio no albúmen e na gema. De maneira semelhante, a espectrometria de absorção atômica com geração de hidretos foi usada para determinar o acúmulo de arsênio no fígado erim de galinhas poedeiras(Dos Passos et al., 2012).

Determinação dos índices bioquímicos séricos

Os níveis de proteína total, albumina, globulina, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) são índices importantes para avaliar a função hepática. Esses parâmetros foram medidos usando kits de ensaio apropriados (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de nitrogênio ureico no sangue (BUN), ácido úrico (UA) e creatinina (CT) são índices importantes para avaliar a função renal e foram determinados usando kits de detecção (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).

Alterações Histopatológicas

Tecidos hepáticos e renais fixados em paraformaldeído a 4 por cento foram desidratados em etanol a 70, 80, 90, 95 e 100 por cento e finalmente incluídos em parafina. Os tecidos foram cortados em seções de 6-mm de espessura e depois corados com hematoxilina e eosina. A partir daí, observações de alterações histopatológicas no fígado erimtecidos foram realizados por um patologista sob um microscópio óptico (Olympus, Melville, NY).

Peroxidação lipídica (LPO) e ensaios de atividade enzimática antioxidante

As atividades de SOD, CAT, GR e GSH-Px, e os conteúdos de malondialdeído (MDA) e GSH no fígado e rim foram determinados por kits de análise apropriados (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Resumidamente, o conteúdo de MDA foi medido por um método espectrofotométrico baseado na reação entre ácido tiobarbitúrico e MDA (Janero, 1990). A atividade de GR e o teor de GSH foram determinados usando 5,5-ditiobis(2-ácido nitrobenzóico) (Carlberg e Mannervik, 1985; Abegg et al., 2012). A atividade da SOD foi determinada de acordo com a reação inibitória entre a redução do azul de nitro tetrazólio e a xantina oxidase. A atividade da CAT foi determinada com base na formação de um complexo estável de peróxido de hidrogênio e molibdato de amônio (Aebi, 1984). A atividade de GSH-Px foi determinada avaliando a redução de hidroperóxido de t-butila (Wheeler et al., 1990).

Isolamento total de RNA e PCR quantitativo em tempo real

O RNA total foi isolado dos tecidos do fígado e do rim com o Trizol RNAiso Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante. As amostras de RNA foram transcritas reversamente em cDNA usando o PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, Dalian, China). Os primers direto e reverso para superóxido dismutase de manganês (MnSOD), superóxido dismutase de cobre-zinco (CuZnSOD), CAT, GR, GSH-Px, Nrf2, Keap1 e o gene de manutenção (b-actina) são mostrados na Tabela Suplementar 2. A abundância de genes foi medida por um sistema StepOnePlus Real-Time PCR (ABI 7500, Applied Biosystems, Foster City, CA). As condições de ciclagem foram 95 C por 30 s seguido de 35 ciclos de 95 C por 5 s, 59 C por 10 s e 72 C por 30 s. A diferença de dobra na expressão de mRNA foi medida usando o método de quantificação relativa utilizando eficiências de PCR em tempo real e normalizado para o nível de b-actina, para comparar as alterações relativas de CT entre todos os grupos (Livak e Schmittgen, 2001).

Análise estatística

Todos os dados são expressos como a média 6 SE. A análise estatística foi realizada por ANOVA de uma via usando SPSS versão 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Quando as diferenças entre os grupos foram significativas (indicadas por P, 0.05), as médias foram comparadas com a diferença honestamente significativa de Tukey para comparações múltiplas post hoc. As correlações de Pearson foram analisadas por análise de correlação bivariada (SPSS versão 20.0, SPSS Inc.). Os coeficientes de significância e correlação são representados como "p" e "r", respectivamente.

RESULTADOS

Desempenho de postura e qualidade do ovo Em comparação com aqueles no grupo de {{0}},95 mg/kg de arsênico, a produção de ovos de galinha e EW foram significativamente diminuídos no grupo de 60,25 mg/ kg grupo arsênico (P, 0.05). No entanto, o arsênico na dieta não afetou o consumo de ração ou a taxa de conversão alimentar (Tabela 1). Comparada com a do grupo {{20}},95 mg/kg de arsênico, a unidade Haugh foi significativamente diminuída no grupo de 40,67 mg/kg (P, 0,05) e 60,25 mg /kg (P, 0,05) grupos arsênico. Além disso, tanto a altura do albúmen quanto a força da casca do ovo foram significativamente diminuídas no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênico (P, 0,05), estabilizado no grupo de 40,67 mg/kg de arsênio e diminuído acentuadamente no grupo de 60,25 mg/kg grupo arsênico (P, 0,05). O arsênico dietético não afetou a cor da gema ou a espessura da casca do ovo (Tabela 1)

Deposição de arsênico

A deposição de arsênico no albúmen (P, {{0}}.05), gema (P, 0.05) e no ovo inteiro (P, 0.05) aumentou significativamente à medida que a dose de arsênico na dieta aumentou de 0,95 para 60,25 mg/kg (Tabela 2). Da mesma forma, à medida que a dose de arsênico na dieta aumentou de 0,95 para 60,25 mg/kg, a deposição de arsênio no fígado (P, 0,05) e rim (P, 0,05) aumentou significativamente (Tabela 2)

Análise de correlação entre a qualidade do ovo e a deposição de arsênico no ovo

A deposição de arsênio no albúmen foi correlacionada negativamente com a unidade Haugh (r {{0}}.622, P, 0.{{10}}1), albúmen altura (r 5 20.878, P, 0.01) e força da casca do ovo (r 5 20.897, P, 0.{{ 30}}1). Enquanto isso, a deposição de arsênio na gema também foi negativamente relacionada à unidade Haugh (r 5 20,654, P, 0,01), altura do albúmen (r 5 20,893, P, 0,01) e força da casca do ovo (r 5 20,902, P, 0,01). Da mesma forma, foram encontradas relações negativas entre a deposição de arsênico no ovo inteiro e a unidade Haugh (r 5 20,640, P, 0,01), altura do albúmen (r 5 20,888, P, 0,01) e resistência da casca do ovo (r 5 20,902, P, 0,01) (Tabela 3)

Índices bioquímicos séricos

Em comparação com os do grupo {{0}},95 mg/kg de arsênico, os níveis de ALT foram significativamente aumentados no grupo de 20,78 mg/kg (P , 0.{ {16}}5), 40,67 mg/kg (P , 0,05) e 60,25 mg/kg (P , 0,05) grupos arsênico. Enquanto isso, os níveis de AST no grupo de 60,25 mg/kg de arsênico foram significativamente aumentados em comparação com os do grupo de 0,95 mg/kg de arsênico (P, 0,05). O arsênico dietético não afetou os níveis de proteína total ou albumina no soro (Tabela 4).

Em comparação com os do grupo {{0}},95 mg/kg de arsênico, os níveis de BUN e AU aumentaram significativamente no grupo de 60,25 mg/kg de arsênico (P, 0,05), enquanto a exposição ao arsênico na dieta não afetam o nível de CT no soro (Tabela 4).

Alterações Histopatológicas

A aparência do tecido hepático foi normal e inalterada no grupo {{0}},95 mg/kg de arsênico. No entanto, à medida que a dose de arsênico dietético aumentou de 20,78 para 60,25 mg/kg, a proliferação do ducto biliar, a esteatose dos hepatócitos e a deformação da veia central tornaram-se mais graves (Figuras 1A-1D). A aparência do tecido renal foi normal e inalterada no grupo de 0,95 mg/kg de arsênico. No entanto, houve encolhimento glomerular grave no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênico. À medida que a dose de arsênico na dieta aumentou de 40,67 para 60,25 mg/kg, o aumento dos túbulos renais, fibrose tubular e hialinização tornaram-se mais graves (Figuras 1E-1H).

Biomarcadores de Estresse Oxidativo

Comparado com os do grupo {{0}},95 mg/kg de arsênico, os níveis hepáticos de MDA foram significativamente aumentados no grupo de 60,25 mg/kg de arsênico (P , {{12} }.05), e os níveis renais de MDA foram significativamente aumentados em 20,78 mg/kg (P , 0,05), 40,67 mg/kg (P , 0,05) e 60,25 mg/kg (P , 0,05) arsênico grupos (Figura 2A). níveis de GSH no fígado erimdiminuiu significativamente no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com aqueles no grupo de 0,95 mg/kg de arsênico (P, 0.05) , e estabilizado nos grupos de arsênio 40.67 e 60.25 mg/kg (Figura 2B). A atividade da SOD hepática foi significativamente diminuída nos grupos de arsênio 40,67 mg/kg (P, 0,05) e 60,25 mg/kg (P, 0,05) em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio. A atividade renal de SOD foi significativamente diminuída no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio (P, 0,05) e estagnou nos grupos de 40,67 e 60,25 mg/kg de arsênio (Figura 2C). Atividade de CAT no fígado erimdiminuiu significativamente à medida que a dose de arsênico na dieta aumentou de {{0}},95 para 60,25 mg/kg (P, 0.05, Figura 2D). Em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio, a atividade de GR no fígado e rim foi significativamente diminuída no grupo de 60,25 mg/kg de arsênio (P, 0,05, Figura 2E ). Além disso, em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio, a atividade hepática de GSH-Px foi significativamente diminuída no grupo de 60,25 mg/kg de arsênico (P, 0,05), e a atividade renal de GSH Px diminuiu acentuadamente no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico (P, 0,05) e estabilizado nos grupos de arsênico 40,67 e 60,25 mg/kg (Figura 2F).

Expressões gênicas de enzimas antioxidantes, moléculas Nrf2 e Keap1

A expressão do gene CuZnSOD hepático foi significativamente diminuída no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio (P, 0).{{16} }5) e estabilizado nos grupos de arsênico 40.67 e 60.25 mg/kg. A expressão do gene CuZnSOD renal foi significativamente diminuída em 40,67 mg/kg (P , 0.05) e 60,25 mg/kg (P , 0.05) grupos arsênico em comparação com o grupo arsênico 0,95 mg/kg (Figura 3A). Em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio, a expressão hepática do gene MnSOD foi significativamente diminuída no grupo de 20,78 mg/kg de arsênio (P, 0).{{73 }}5) e estabilizado nos grupos 4{{80}},67 e 60,25 mg/kg de arsênico. A expressão do gene MnSOD renal não foi significativamente diferente entre os grupos (Figura 3B). A expressão do gene CAT hepático foi significativamente diminuída no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com o grupo de {{105}},95 mg/kg de arsênico (P, 0,05) e atingiu um platô nos grupos de 40,67 e 60,25 mg/kg de arsênico. A expressão do gene CAT renal foi significativamente diminuída no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio (P, 0,05) e atingiu um platô no grupo de 40,67 mg/kg de arsênio, e foi acentuadamente diminuído no grupo de 60,25 mg/kg grupo arsênico em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio (P, 0,05, Figura 3C). A expressão do gene GR no fígado e rim foi significativamente diminuída no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio (P, 0,05) e estabilizado nos grupos de 40,67 e 60,25 mg/kg de arsênio (Figura 3D). Além disso, a expressão do gene GSH-Px hepático diminuiu significativamente à medida que a dose de arsênico na dieta aumentou de 0,95 para 40,67 mg/kg (P, 0,05) e depois estabilizou no grupo de 60,25 mg/kg de arsênico. A expressão do gene GSH-Px renal diminuiu significativamente no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio (P, 0,05) e atingiu um platô nos grupos de 40,67 e 60,25 mg/kg de arsênio (Figura 3E). A expressão do gene Nrf2 no ​​fígado e rim foi significativamente diminuída no grupo de 20,78 mg/kg de arsênio em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio (P, 0,05) e estagnou nos grupos de 40,67 e 60,25 mg/kg de arsênio (Figuras 4A e 4C ). Em contraste, a expressão do gene Keap1 no fígado e no rim foi acentuadamente aumentada no grupo de 20,78 mg/kg de arsênico em comparação com o grupo de 0,95 mg/kg de arsênio (P, 0,05) e estagnou nos grupos de 40,67 e 60,25 mg/kg de arsênio (Figuras 4B e 4D).

Análises de correlação relacionadas ao caminho Nrf2- Keap1

A expressão gênica de CuZnSOD (fígado, r {{0}},613, P, 0,01;rim, r {{0}}.687, P , 0.{{10}}1), CAT (fígado, r 5 0.738, P , 0.01; rim, r 5 0.903, P , 0.01), GR (fígado, r 5 0,477, P, 0,05; rim, r 5 0,485, P, 0,05) e GSH-Px (fígado, r 5 0,450, P, 0,05; rim , r 5 0.767, P , 0,01) no fígado e rim, e a expressão do gene MnSOD hepático (r 5 0.707, P , 0,01) foram positivamente correlacionados com as atividades de seus correspondentes enzimas antioxidantes. Além disso, a expressão do gene Nrf2 foi positivamente correlacionada com as expressões do gene de CuZnSOD (fígado, r 5 0.756, P, 0,01;rim, r {{0}},736, P, 0,01), CAT (fígado, r 5 0,893, P, 0,01;rim, r {{0}}.740, P , {{10}}.01), GR (fígado, r 5 0 0,837, P, 0,01; rim, r 5 0,915, P, 0,01) e GSH-Px (fígado, r 5 0,822, P, 0,01; rim, r {{17}) }.722, P, 0,01) no fígado erim, e expressão do gene MnSOD hepático (r {{0}},720, P, 0,01). Houve uma correlação negativa entre a expressão de mRNA de Nrf2 e Keap1 (fígado, r 5 20.746, P, 0,01;rim, r {{0}}.771, P , 0,01) no fígado e rim. Além disso, não houve correlação entre a expressão do gene MnSOD e a atividade enzimática da SOD, ou a expressão do mRNA Nrf2 norins de galinhas poedeiras(Tabela 5).

DISCUSSÃO

O arsênico é um metalóide onipresente e tóxico na natureza. Induz várias toxicoses em humanos e animais, incluindo hepatotoxicidade, nefrotoxicidade, neurovirulência, imunotoxicidade, toxicidade cardiovascular, hepatotoxicidade e toxicidade reprodutiva (Mandal e Suzuki, 2002). O arsênico tem como alvo mais robusto o sistema reprodutivo dos animais. Estudos anteriores mostraram que a exposição à roxarsona na dieta perturba a taxa de postura e a produção de ovos (Chiou et al., 1999; Zhang et al., 2017). Neste estudo, a suplementação de arsênico na dieta diminuiu significativamente o desempenho de postura, incluindo a produção de ovos e EW. Estudos anteriores descobriram que a suplementação dietética de arsênico induz o acúmulo de arsênico nos ovos e reduz a qualidade do ovo (Chiou et al., 1998; Zhang et al., 2017). No presente estudo, a suplementação dietética de arsênico diminuiu significativamente a unidade Haugh, a altura do albúmen e a resistência da casca do ovo. Com exceção da cor da gema e da espessura da casca, foram encontradas correlações negativas entre a deposição de arsênio nos ovos e os parâmetros de qualidade dos ovos. Isso sugere que a unidade Haugh, a altura do albúmen e a resistência da casca do ovo podem ser afetadas pela deposição de arsênico no ovo. Como sabemos, a espessura da camada paliçada na casca do ovo é o determinante da espessura da casca (Ruiz e Lunam, 2000), enquanto a deposição de pigmento determina a cor da gema. Assim, especulamos que a suplementação dietética de arsênico pode não afetar a espessura da camada paliçada de deposição de pigmento nos ovos de galinhas poedeiras. Evidências emergentes indicam que distúrbios hepáticos e renais são comuns em mamíferos após exposição ao arsênico (Liu e Waalkes, 2008; Huang et al., 2009). Um estudo anterior mostrou que a exposição ao arsênico induz lesões histopatológicas no fígado, incluindo desorientação do tecido, peliose e vacuolização acompanhada de cariólise, apoptose e necrose de hepatócitos em Channa punctatus (Roy e Bhattacharya, 2006). Neste estudo, observamos alterações severas na proliferação do ducto biliar, esteatose dos hepatócitos e deformação da veia central do fígado à medida que a dose de arsênico dietético aumentou de 20,78 para 60,25 mg/kg. Roy e Bhattacharya (2006) também descobriram que a exposição ao arsênico induz o encolhimento do glomérulo, irregularidades no túbulo renal e um aumento no espaço de Bowman. Na presente investigação, como a dose de arsênico dietético

aumentou de 20,78 para 60,25 mg/kg, as alterações histopatológicas renais foram muito graves, incluindo aumento dos túbulos renais, encolhimento glomerular e fibrose tubular e hialinização, o que é consistente com um estudo anterior (Roy e Bhattacharya, 2006). De acordo com relatos anteriores, os níveis séricos de AST e ALT provaram ser marcadores substitutos da reação inflamatória hepática e fifibrose (Wang et al., 2008; Khattab et al., 2015). Neste estudo, os aumentos dos níveis séricos de AST e ALT implicaram que a resposta inflamatória hepática foi intensificada após a exposição ao arsênico, o que foi consistente com as alterações histopatológicas observadas nos fígados de galinhas poedeiras. Patel e Kalia (2013) também descobriram que a hepatotoxicidade induzida por arsênico se manifesta por um aumento nos níveis séricos de ALT e AST em ratos Wistar. A função renal é rotineiramente monitorada pelos níveis séricos de BUN, CT e AU. Descobrimos que os níveis séricos de BUN e AU aumentaram significativamente, e o nível sérico de CT tendeu a aumentar após a suplementação dietética de arsênico, o que implica querimdanosresultou da exposição ao arsênico em galinhas poedeiras, o que é consistente com pesquisas anteriores (Liu et al., 2000). Está bem estabelecido que o dano tecidual induzido pela exposição ao arsênico está intimamente relacionado ao estresse oxidativo (Jomova et al., 2011). Quando o estresse oxidativo é desencadeado, as espécies reativas de oxigênio intracelular (ROS) induzem LPO, que pode ser monitorado pelos níveis de MDA intracelular (Storey, 1996). Neste estudo, os níveis de MDA hepático e renal foram significativamente aumentados após a suplementação dietética de arsênico, implicando que houve aumento de LPO, o que pode ter indicado lesão oxidativa nos fígados erins de galinhas poedeiras.GSH também desempenha um papel vital na regulação do estresse oxidativo intracelular (Finkel e Holbrook, 2000). Comparado com aqueles no grupo de 0,95 mg/kg de arsênico, os níveis de GSH

diminuíram significativamente nos grupos tratados com concentrações mais altas de arsênio, o que sugere que o arsênio pode se ligar ao GSH para atenuar as capacidades antioxidantes do fígado erim.Flora et ai. (1997) relataram que a exposição ao arsênico reduz a concentração de GSH e produz lesões pronunciadas nos fígados erinsde ratos. Além disso, os sistemas enzimáticos antioxidantes intracelulares conferem funções protetoras contra o estresse oxidativo, incluindo SOD, CAT, GR e GSH-Px (Finkel e Holbrook, 2000). Neste estudo, a suplementação dietética de arsênio reduziu significativamente as atividades de SOD, CAT, GR e GSH-Px nos fígados e rins de galinhas poedeiras. Quando os sistemas antioxidantes não conseguem neutralizar o excesso de EROs intracelulares, ocorre dano oxidativo devido ao LPO, que pode, por sua vez, atenuar as atividades das enzimas antioxidantes. Um estudo anterior também relatou que o arsênico induz estresse oxidativo no rim de rato (Sener et al., 2016). Enzimas antioxidantes são proteínas e podem ser reguladas por genes no nível transcricional. No presente estudo, a exposição ao arsênico diminuiu significativamente a expressão de mRNA de CuZnSOD, CAT, GR e GSHPx. Além disso, a expressão gênica de CuZnSOD, CAT, GR e GSH-Px foi positivamente correlacionada com as atividades de enzimas antioxidantes, implicando que a exposição ao arsênico reduziu as atividades de enzimas antioxidantes por inibir a expressão de mRNA. Da mesma forma, relataram correlações entre as atividades de enzimas antioxidantes e a expressão gênica nos fígados e rins de galinhas poedeiras após exposição ao mercúrio. No entanto, a suplementação dietética de arsênio não afetou a expressão de MnSOD norim.Isso pode ter ocorrido porque a SOD possui várias isoenzimas e sua atividade não é afetada pelo gene MnSOD. Nrf2 desempenha um papel vital no sistema de defesa contra o estresse oxidativo. Sob condições basais, Nrf2 se liga a Keap1 no citoplasma. Uma vez que o nível de ROS intracelular é alto o suficiente para modificar os grupos tióis reativos de Keap1, o Nrf2 se transloca muito mais facilmente para o núcleo, onde irrita o antioxidante responsivo.

elemento e, em seguida, ativa genes protetores a jusante (Sinha et al., 2013). Neste estudo, descobrimos que a exposição ao arsênico reduziu significativamente a expressão do gene Nrf2 e a expressão de enzimas antioxidantes a jusante. A regulação negativa de genes de enzimas antioxidantes Nrf2 e downstream após a exposição ao arsênico sugeriu que o arsênico inibiu a expressão de genes de enzimas antioxidantes suprimindo a expressão do gene Nrf2 no ​​fígado erim. Além disso, o aumento da expressão do gene Keap1 foi negativamente correlacionado com a expressão do gene Nrf2 e da enzima antioxidante, implicando que a regulação positiva do Keap1 citoplasmático promove a translocação de Nrf2 do citoplasma para o núcleo (Kensler et al., 2007). Um estudo semelhante relatou que a via intracelular Nrf2-Keap1 é inativada em resposta à exposição ao arsênico (Janasik et al., 2018). No entanto, um estudo anterior também relatou que a exposição ao arsênico aumenta a via Nrf2-Keap1 para proteger contra danos oxidativos (Massrieh et al., 2006). Esses achados não são inconsistentes com este estudo. Nos estágios iniciais do estresse oxidativo, os efeitos protetores do Nrf2-Keap1 podem ser ativados para prevenir o estresse oxidativo. No entanto, a via Nrf2-Keap1 pode não resistir aos danos oxidativos induzidos pela exposição sustentada a uma alta dose de arsênico (Kensler et al., 2007). A partir daí, a via Nrf2- Keap1 pode ser inibida e danos oxidativos intracelulares ou mesmo apoptose podem ocorrer nos fígados e rins de galinhas poedeiras. Em vista dos presentes resultados, este estudo fornece algumas novas evidências para a defesa antioxidante hepática e renal sob exposição ao arsênico em galinhas poedeiras e elucida um papel central da via Nrf2-Keap1 no estresse oxidativo induzido por arsênico pela primeira vez . Em resumo, a suplementação dietética de arsênico reduziu o desempenho de postura e a qualidade dos ovos de galinhas poedeiras. Danos histopatológicos ocorreram no fígado erimapós exposição dietética ao arsênico. Além disso, a exposição ao arsênico na dieta induziu estresse oxidativo hepático e renal ao prejudicar a via Nrf2-Keap1 em galinhas poedeiras.