Métodos para o controle de qualidade de Cistanche deserticola

para mais informações:ali.ma@wecistanche.com

Shi Ziyi, Wu Yun, Zhu Yuemei & et al.

A medicina tradicional chinesaCistancheé o caule suculento daCistanche deserticolaYC Ma ou Cisanche tubulosa (Schenk) Wight com folhas escamosas secas. Tem as funções de tonificar o yang do rim, nutrir a essência e o sangue, umedecer os intestinos e laxantes, etc. É usado principalmente para deficiência de yang do rim, deficiência de essência e sangue, impotência e infertilidade, dor e fraqueza da cintura e joelhos, fraqueza de músculos e ossos, secura intestinal e prisão de ventre. A pesquisa farmacológica moderna mostra queCistanchetem muitas funções, como melhorar a função sexual, resistir à doença de Alzheimer e à doença de Parkinson, melhorar a capacidade de aprendizado e memória, antienvelhecimento, antifadiga, proteção do fígado e laxante [4]. Um grande número de estudos confirmou que os glicosídeos feniletanoides emCistanche deserticolatêm efeitos óbvios na melhoria da capacidade de aprendizagem e memória, resistindo à doença de Alzheimer e doença de Parkinson (4, oligossacarídeos e polióis têm o efeito de laxante e laxante 64). A "Farmacopéia da República Popular da China" mede apenas o conteúdo de glicosídeos feniletanoides equinacosídeo e verbascosídeo emCistanchedeserticola, mas não mede os componentes ativos de seu efeito laxante, por isso é difícil obter uma análise abrangente dos materiais medicinais deCistanchedeserticola. Controle de qualidade. Para superar essa limitação e estabelecer um sistema de avaliação de qualidade multi-índice relacionado às principais funções e indicações deCistanchedeserticola, este estudo utilizou HPLCELSDP4 para estabelecer um método de análise quantitativa para betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose em materiais medicinais deCistanchedeserticola. Além disso, 58 lotes deCistanchedeserticolamateriais medicinais de diversas origens e 10 lotes de materiais medicinais deCistanchena área de Hotan de Xinjiang foram testados, o que pode fornecer uma referência para o controle de qualidade abrangente e avaliação de materiais medicinais deCistanchedeserticolano futuro.

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1 Instrumento e reagentes

1.1 Instrumentos

Balança eletrônica Sartorius BT25 S, BS 124 S (Pequim Sartorius Balance Co., Ltd.); Cromatografia Líquida de Alto Desempenho Agilent 1100; Detector de Dispersão de Luz Evaporativa ALLTECH 2000ES (EISD); Limpador ultrassônico KQ 250 (Kunshan Ultrasonic Instrument Ltd). 1.2 Reagentes

Substância de controle: betaína (lote: {{0}}, pureza: 99,2 por cento), manitol (lote: 10053-201304, pureza: 99,0 por cento), D-frutose (lote: 111504-201703 , pureza: 99,8 por cento ), D - glicose anidra (número do lote: 110833-201506, pureza: 99,9 por cento ), sacarose (número do lote: 111507-201303, pureza: 99,8 por cento ), todos adquiridos do Instituto Nacional da China para Controle de Alimentos e Medicamentos.

Os materiais medicinais deCistanchedeserticolaforam coletados na Mongólia Interior, Xinjiang, Gansu e outros lugares, com um total de 58 lotes. Eles foram identificados pelo professor Tu Pengfei da Escola de Farmácia da Universidade de Pequim como as hastes carnudas secas deCistanchedeserticolaYCMa da planta Lidangaceae, conforme mostrado na Tabela 3.

Os materiais medicinais deCistanchedeserticolaforam coletados na área de Hotan, Xinjiang, em um total de 10 lotes. Eles foram identificados pelo professor Tu Pengfei da Escola de Farmácia da Universidade de Pequim como as hastes carnudas secas com folhas escamosas de Cistanche tubulosa (Schenk) Wight da planta Liedangaceae, conforme mostrado na Tabela 4.

1.3 Reagentes

O acetonitrilo é cromatográfico puro (Tianjin Boshiqi Technology Development Co., Ltd.), o metanol é cromatográfico (Tianjin Saifu Century Technology Development Co., Ltd.), e a água é água ultrapura.

2 Métodos e resultados

2.1 Condições cromatográficas

A coluna cromatográfica foi uma coluna de gel de polímero ShodexAshaipak NH2P-50 4E (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); a fase móvel era acetonitrila-água (77∶23); a taxa de fluxo foi de 0,7 mL·min-1; a temperatura da coluna era de 25 graus; Detector de espalhamento de luz (ELSD): a temperatura do tubo de deriva era de 100 graus e a vazão do gás de arraste era de 3 L·min-1.

2.2 Preparação da solução de referência

Tome uma quantidade adequada de betaína, manitol, frutose, glicose e substância de referência de sacarose, pese-a com precisão, adicione água para fazer uma solução mista contendo 0,25 mg de betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose por 1 mL, agitar bem e tomar.

2.3 Preparação da solução de teste

Tome cerca de 1.0 g deCistanchepó medicinal (passado por uma peneira nº 4), pese-o com precisão, coloque-o em um balão volumétrico marrom de 100 mL, adicione 50 mL de metanol a 50% com precisão, tampe-o bem, agite-o, pese deixe de molho por 30 min e, em seguida, ultrassonicamente (potência 250 W, frequência 35 kHz) por 40 min, retire, deixe esfriar, pese novamente, adicione 50% de metanol para reduzir a massa, agite bem e deixe ele fica. Aspire com precisão 5 mL de sobrenadante, coloque-o em um balão volumétrico de 25 mL, dilua até a marca com 50 por cento de metanol, agite bem e filtre através de uma membrana microporosa de 0,2 μm.

2.4 Método de determinação

Desenhe com precisão 5 e 10 μL da solução de referência e 5 μL da solução de teste, respectivamente, injete-os no cromatógrafo líquido, registre a área do pico e calcule de acordo com a equação logarítmica do método de dois pontos padrão externo.

2.5 Teste de adequação do sistema

De acordo com as condições cromatográficas do item 2.1, extraia com precisão 5 μ da solução de referência e da solução teste, respectivamente, e injete-os na cromatografia líquida de alta eficiência, meça e registre o cromatograma, conforme mostrado na Figura 1. Os picos cromatográficos da amostra de teste apresentou o mesmo tempo de retenção que os picos cromatográficos da substância de referência, a resolução foi boa e as condições cromatográficas foram viáveis.

Nota: A. Substância controle; B.Cistancheamostra nº 49; 1. betatime; 2. funk; 3. manibol; 4. glicose; 5. suceve

Fig. 1 Perfis de HPLC da substância de referência e a amostra de Cistanche No. 49

2.6 Exame de Relações Lineares

Tome quantidades adequadas de betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose como substâncias de referência, pese-as com precisão e adicione água para fazer cada 1 mL contendo betaína 0.496 0 mg, manitol {{3} }.994 0 mg, fruta 1.0126 mg, glicose 1.0882 mg e sacarose 0,9922 mg. 0.0992, 0,2480, 0,4960), 0,9920, 1,9840, 2,9760 μ, manitol 0,1988, 0,4970 , 0,9940, 1,9880, 3,9760, 5,9640 μ, frutose 0,5063, 1.012 6. 2.025 2. 4.050 4. 5.063 0. As condições cromatográficas foram injetadas e detectadas, e a área do pico foi registrada; em seguida, o valor logarítmico X (ug) de cada quantidade de injeção de substância de referência foi usado como a abcissa, e o valor logarítmico Y da área do pico foi a ordenada, e a curva padrão foi desenhada. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1 Os resultados da investigação do relacionamento linear

2.7 Teste de precisão

Extraia com precisão a solução de teste (amostra nº 49), sob as condições cromatográficas acima, injete continuamente 6 vezes, meça a área do pico de cada pico cromatográfico e calcule seu valor RSD. Resultados Os RSDs das áreas de pico de betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose foram 0,84 por cento , 2,56 por cento , 1,27 por cento , 2,62 por cento e 1,52 por cento , respectivamente, indicando que a precisão do instrumento utilizado em este estudo foi bom. 2.8 Teste de repetibilidade

Pegue 6 amostras deCistanchedeserticola(amostra nº 49), prepare a solução de teste de acordo com o método do item 2.3, meça a área do pico de cada pico cromatográfico e calcule o conteúdo correspondente. Resultados Os teores médios de betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose (n=6) foram 7,93 por cento , 7,27 por cento , 8,74 por cento , 2,75 por cento e 4,81 por cento , e os RSDs foram 2,83 por cento , 1,94 por cento , {{ 18}},97 por cento e 2,60, respectivamente. percent , 1,40 por cento , indicando que o método tem boa repetibilidade. 2.9 Teste de estabilidade

Pegue a solução de teste (amostra nº 49), injete-a em 0, 4, 8, 12, 16 e 24 h após a preparação para medição e calcule o valor RSD de cada pico cromatográfico. Resultados Os RSDs de betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose foram 0,61 por cento , 1,92 por cento , 1,34 por cento , 2,83 por cento e 0,69 por cento , respectivamente, indicando que a solução de teste teve boa estabilidade em 24 horas. 2.10 Teste de recuperação

Pegue 6 amostras deCistanchedeserticolacom conteúdo conhecido (amostra nº 49), pese com precisão 0,25g, coloque-os em um balão volumétrico marrom de 50mL e extraia com precisão 25mL da solução de referência mista na concentração de 1: 1 (que contém {{10}},7900 mg de betaína). mL-, frutose 0,7236 mg"mL-1, manitol 0,8812 mg·mL-1, glicose 0,2708 mg·mL-1, sacarose 0,4883 mg'mL-') foram adicionados à amostra, e a solução de teste foi preparada de acordo com o método em 2.3 Detectado de acordo com as condições cromatográficas acima mencionadas, calculada sua recuperação, os resultados são mostrados na Tabela 2, indicando que o método tem boa precisão.

Tabela 2: Resultados da medição da taxa de recuperação da amostra de 5 componentes a serem testados (n=6)

3 Discussão

3.1 Seleção de componentes de índice

O total de oligossacarídeos deCistanchesão as partes efetivasCistanchepara laxantes. O autor analisou a composição química desta parte por LC-MS e a substância de referência, e determinou que esta parte é composta principalmente por betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose. Portanto, esses 5 componentes foram selecionados como os componentes do índice deCistanchedeserticola, e o método de determinação do conteúdo foi estabelecido.

3.2 Seleção de colunas cromatográficas

Os cinco componentes a serem testados, betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose, são relativamente polares e não podem ser retidos na coluna Cn de fase reversa. Geralmente, os picos aparecem em 1-2 minutos e os componentes não podem ser separados. Colunas de aminoácidos Waters Bonoapar NH, (300 mm × 4,6 mm, 10 μm) e Phenomenex Bondclone 10 NH, (300 mm × 3,9 mm, 10 μm) para separação de açúcar e poliol e colunas de aminoácidos à base de polímero Prevail Carbohydrate ES ( 250 mm ×4,6 mm, 5 μm), ShodexAshaipak NH2P-50 4E (250 mm×4,6 mm, 5 μm). Os resultados mostram que a coluna amino da matriz polimérica pode efetivamente separar esses cinco componentes.

3.3 Seleção do detector

Os cinco componentes a serem testados não têm absorção de UV óbvia e o conteúdo do detector de UV não pode ser determinado diretamente. Portanto, este trabalho estabeleceu um método de análise quantitativa para os componentes sucroalcooleiros deCistanchedeserticolausando HPLC-EISD. Os resultados mostram que o método possui alta sensibilidade, boa repetibilidade e alta precisão, podendo ser utilizado para o controle de qualidade deCistanchedeserticolae outros medicamentos contendo betaína e álcoois de açúcar.

3.4 Investigação do método de preparação da solução de teste

Diferentes solventes de extração, incluindo água, 30 por cento de metanol, 50 por cento de metanol, 70 por cento de metanol, metanol, etc. foram comparados respectivamente. Os resultados mostraram que, exceto pela taxa de extração ligeiramente inferior de 70 por cento de metanol e solvente de metanol, não houve diferença significativa em outros solventes, então a seleção direta foi feita. Metanol a 50 por cento foi usado como solvente sob o item "Determinação do Conteúdo" doCistanchena Farmacopeia da República Popular da China, e foi preparado de acordo com o método de preparação da solução de teste relevante e, em seguida, diluído 5 vezes para determinar os componentes do álcool de açúcar.

3.5 Detecção e análise de amostras com diferentes bases

Neste estudo, o conteúdo de 5 componentes em 58 lotes deCistanchedeserticolae 10 lotes deCistanchedeserticolamateriais medicinais foram determinados. As frações mássicas de betaína, manitol, frutose, glicose e sacarose em 58 lotes deCistanchedeserticolaas amostras foram 2,73% -17,65% , 2,46% -16,34% , 2,52% {{10}}},74% , 0,97% -14,06% , 3,15 por cento -27,16 por cento ; Manitol, frutose e glicose foram 1,00 por cento -13,04 por cento , 2,98 por cento -8,85 por cento , 1,09 por cento -5,33 por cento nos 10 lotes deCistancheamostras, respectivamente, e betaína e sacarose não foram detectadas. O conteúdo dos materiais medicinais difere muito entre os lotes, e não há regra a ser seguida, sugerindo a necessidade de se estabelecer o padrão de determinação do conteúdo para controlar a qualidade dos materiais medicinais. Além disso, este método pode efetivamente distinguir dois tipos deCistancheplantas de base, nomeadamente,Cistanchenão contém betaína e sacarose, enquanto o teor desses dois componentes é maior emCistanche deserticola. Isso também fornece uma base para analisar as diferenças de textura e habitat dos dois materiais medicinais deCistanche deserticola. Comparado com o material medicinal deCistanche deserticola, a textura é mais suave, e é conhecida localmente como "Soft Dayun", enquantoCistancheé chamado de "Chai Dayun" porque contém sacarose (3,15% ~ 27,16%). ).Cistanche deserticolaé distribuído principalmente em Alxa na Mongólia Interior, enquantoCistancheé distribuído principalmente na área de Hotan de Xinjiang, onde a temperatura é mais alta do que na área de Alxa, e a irrigação por gotejamento é frequentemente usada na área local, mas uma vez que a temperatura cai,Cistanchesofrerá sérios danos. O dano por congelamento, por um lado, tem uma certa relação com seu alto teor de água e, por outro, tem algo a ver com os ingredientes que contém. A betaína 243 é uma importante substância de ajuste osmótico, que desempenha um papel importante no aumento da resistência ao estresse das plantas, como resistência à salinidade, seca, baixa temperatura e luz forte. É justamente por causa do alto teor de betaína contido naCistanche deserticolaque tem melhor resistência ao sal-álcali, seca e danos de congelamento do queCistanche, e tem uma distribuição relativamente ampla.

3.6 Análise deCistanchedeserticolaamostras de diferentes origens

Entre os 58 lotes de desertocistacheamostras de material medicinal, 45 lotes foram produzidos a partir de Alxa League, Mongólia Interior, 3 lotes eram de Wangyedi (Dengkou County), Mongólia Interior, e 1 lote era desconhecido. Todos os 49 lotes de materiais medicinais tinham diferentes conteúdos de 5 componentes. No entanto, não há diferença significativa. A razão para a análise pode ser que os materiais medicinais são todos produzidos na mesma área desértica, a ecologia e o ambiente geográfico são semelhantes e a qualidade do produto é relativamente uniforme e estável. Existem 3 lotes produzidos no condado de Minqin, Gansu, e 6 lotes de Xinjiang. De acordo com a análise da Figura 2, em comparação com os materiais medicinais produzidos na Mongólia Interior, a principal diferença se reflete no teor de frutose e sacarose. O teor de sacarose dos materiais medicinais foi relativamente maior, mas dada a baixa quantidade de amostras das duas origens, esta conclusão precisa ser verificada através da coleta de mais amostras. 3.7 Resumo

Neste estudo, o HPLC Wang ISD foi estabelecido para a determinação simultânea de 5 ingredientes ativos de laxantes, o que proporcionou um método mais conveniente, eficiente e preciso para o controle de qualidade deCistanche deserticola, e forneceu uma base para melhorar o padrão de qualidade e um maior desenvolvimento deCistanchedeserticola. referência significativa.

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