Absorção de citocinas durante a perfusão renal humana reduz a assinatura genética inflamatória associada à função do enxerto tardia

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

John R. Ferdinand1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomas Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Unidade de Imunidade Molecular, Departamento de Medicina da Universidade de Cambridge, Laboratório de Biologia Molecular, Cambridge, Reino Unido

2 National Institute of Health Research Blood and Transplant Research Unit in Organ Donation, Cambridge, Reino Unido

3 Departamento de Cirurgia da Universidade de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

O transplante é o tratamento ideal para a maioria dos pacientes com estágio terminalrimdoençamas a escassez de órgãos é um grande desafio. A máquina de perfusão normotérmica (NMP) tem sido usada para recondicionar órgãos marginais; no entanto, os mecanismos pelos quais a NMP pode beneficiar os órgãos não são bem compreendidos. Usando pares de rins humanos obtidos do mesmo doador, comparamos o efeito do NMP com o do armazenamento refrigerado norimtranscriptoma. Descobrimos que o armazenamento a frio levou a uma redução global na expressão gênica, incluindo genes de vias inflamatórias e aqueles necessários para processos de geração de energia, como fosforilação oxidativa (OXPHOS). Em contraste, durante a NMP, houve marcada regulação positiva dos genes OXPHOS, mas também de vários genes da via imune e inflamatória. Usando biópsias de rins submetidos a NMP que foram posteriormente transplantados, descobrimos que a maior expressão de genes inflamatórios ocorreu em órgãos com função de enxerto retardada prolongada (DGF). Portanto, usamos um hem-adsorber (HA) para remover citocinas pró-inflamatórias. Essa expressão gênica inflamatória atenuada aumentou os genes da via OXPHOS e teve efeitos clinicamente importantes na redução da expressão de uma assinatura gênica associada ao DGF. Juntos, nossos dados sugerem que a adsorção de mediadores pró-inflamatórios do perfusato representa uma potencial intervenção que pode melhorar a viabilidade do órgão.

PALAVRAS-CHAVE:pesquisa/prática clínica, função tardia do enxerto (DGF), doadores e doação: falecidos,rim(aloenxerto) função/disfunção,rimdoença: imune / inflamatório, rim

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1. INTRODUÇÃO

Rimtransplante representa o tratamento ideal para a maioria dos pacientes comestágio finalrimdoença, com benefícios tanto para a qualidade quanto para a quantidade de vida.1 A escassez de órgãos é um grande desafio, e várias estratégias têm sido empregadas para aumentar o número de rins disponíveis, incluindo o uso de doadores falecidos por morte circulatória (DCD) e doadores de critérios estendidos (ECD ), ambos estão associados a taxas mais altas de função tardia do enxerto (DGF) em comparação com doador falecido com morte de tronco encefálico (DBD).2,3 Em rins DCD, a exposição à isquemia quente durante o processo de cessação circulatória contribui significativamente para a DGF . O DGF ocorre devido a lesão ou morte de células tubulares isquêmicas, que podem estimular a ativação imune inata via montagem do inflamassoma NLRP3 levando à geração de interleucina (IL)1 e IL18.4-6 De fato, a presença de citocinas inflamatórias na urina tem sido utilizado como biomarcador deagudorimprejuízoe DGF.7-9

A máquina de perfusão normotérmica (NMP) permite que os órgãos transplantados sejam perfundidos com glóbulos vermelhos oxigenados e quentes, na ausência de componentes imunológicos circulantes, incluindo complemento e neutrófilos.10-14 Esse processo tem sido usado para avaliar órgãos marginais15 e para " recondicionar" órgãos para facilitar o transplante de rins que foram inicialmente recusados ​​após uma oferta por meio de um serviço nacional de alocação de órgãos. os mecanismos pelos quais a NMP pode beneficiar os rins de transplante não são totalmente compreendidos. Além disso, a questão de saber se a manipulação adicional dorimdurante a NMP, por exemplo, pela remoção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas do perfusato, pode oferecer benefícios adicionais na otimização do órgão antes do transplante não foi abordado em rins humanos, mas nosso estudo de NMP suíno demonstrou resultados promissores.18

Aqui, adotamos uma abordagem imparcial para abordar essas duas questões usando a análise transcriptômica derimbiópsias realizadas no início e no final do NMP para avaliar as mudanças globais na expressão gênica. Usamos pares de rins humanos de um único doador, permitindo a comparação do efeito de diferentes intervenções em órgãos com antecedentes genéticos idênticos e pudemos avaliar o impacto dessas alterações na previsão do resultado do enxerto.

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2. RESULTADOS

2.1. Rins pareados são geneticamente semelhantes e um modelo útil para avaliar intervenções

Investigamos as alterações transcricionais associadas à preservação de órgãos e NMP em dois estudos independentes, cada um com cinco pares de rins, perfazendo um total de 10 pares/20 rins humanos. Destes, dois eram de DBD e oito de DCD (Tabela S1, S2 e Figura S1). Nesses estudos, realizamos biópsias corticais pré e pós-intervenção (armazenamento a frio ou NMP) e investigamos a paisagem transcricional usando sequenciamento de RNA (RNA-Seq). O uso de rins pareados e biópsias pareadas do mesmorimnos permitiu controlar a variação biológica e regredir esse fator de confusão para fora da análise (Figura S2A). Nós confirmamos querimpares começam com uma paisagem transcricional comum (Fig. S2B) e aplicando diferentes intervenções para cadarimem um par, podemos estudar o efeito de uma intervenção independente da variação biológica.

FIGURA 1 Rins expostos ao armazenamento refrigerado apresentam alterações limitadas na expressão gênica em comparação com aqueles submetidos a NMP. Obteve-se um par de rins que havia sido recusado para uso em transplante. Umrimfoi mantido em câmara fria estática e o outro submetido à perfusão em máquina normotérmica (NMP). As biópsias foram retiradas do córtex externo no início e após 2 horas. B, gráfico de Volcano indicando uma mudança na expressão gênica em 2 horas para o grupo indicado em comparação com o início. Os pontos vermelhos indicam genes expressos diferencialmente com um valor P ajustado<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

FIGURA 2 Correlação do transcriptoma após NMP com a duração da função do enxerto atrasada. A expressão do gene foi correlacionada com o comprimento de DGF em biópsias realizadas após NMP como parte de um ensaio clínico randomizado. Os níveis de expressão dos 1000 genes com maior correlação com o resultado foram plotados. B, GSEA foi realizado para a correlação de A contra o conjunto de dados de marcas registradas. Apenas vias significativas (valor FDR q<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP resulta em um aumento nos genes OXPHOS e da via inflamatória em comparação com o armazenamento a frio

Para investigar os mecanismos potenciais pelos quais o NMP pode afetar os rins, inicialmente levamos cincorimpares (n {{0}} doadores DCD e n=1 doador falecido com morte de tronco cerebral [DBD], Figura S1, Tabela S1) e realizou um tempo 0 (0 horas) biópsia cortical . Neste ponto, os rins foram randomizados para armazenamento refrigerado estático ou NMP, conforme descrito anteriormente 10 (Figura 1A). Após 2 horas, uma segunda biópsia foi feita de ambos os rins e o RNA-Seq foi realizado. Ao comparar a expressão gênica entre as biópsias de tempo 0- e 2-hora, descobrimos que os rins colocados em armazenamento a frio estático não tiveram alteração estatisticamente significativa na expressão de qualquer gene individual quando corrigidos para vários testes (Figura 1B , painel esquerdo). Em contraste, durante o curso de 2 horas de NMP, 956 genes foram regulados positivamente e 353 genes foram regulados negativamente (Figura 1B, painel direito). Em seguida, avaliamos as mudanças na expressão de grupos de genes dentro de uma via comum, comparando dezenas ou centenas de genes em vez de qualquer gene individual, reduzindo ainda mais o efeito da variação biológica interindividual na análise. Isso revelou mudanças em vias funcionalmente importantes, onde a expressão de cada gene individual dentro dessa via não foi alterada com magnitude suficiente para atingir significância estatística. Esta análise de enriquecimento do conjunto de genes (GSEA) demonstrou que o armazenamento a frio teve um impacto substancial em várias vias metabólicas (Figura 1C, painel esquerdo). Em particular, houve uma redução acentuada nos genes envolvidos na fosforilação oxidativa (OXPHOS), uma via chave necessária para gerar ATP. para a viabilidade celular e a restauração da homeostase celular. Além disso, várias vias envolvidas em processos imunológicos ou inflamatórios foram induzidas durante a NMP, com a "sinalização de TNF via NFkB" demonstrando o maior aumento. De acordo com isso, o TNF, bem como IL1B e as quimiocinas de recrutamento de neutrófilos CXCL8 (IL8) e CXCL2, estavam entre os genes mais regulados em 2-biópsias NMP de hora (Figura 1D). A análise de sequência dos 50 principais genes regulados positivamente revelou a regulação positiva de genes bioquimicamente relacionados que foram agrupados em quatro nós principais; IL8 e quimiocinas de recrutamento de neutrófilos, genes associados ao inflamassoma, sinalização de NFkB e regulação transcricional (Figura 1E). É importante notar que os rins DBD e DCD foram transcricionalmente semelhantes na linha de base (Figura S2C), e as vias genéticas que mudam durante a NMP foram semelhantes nos rins DBD e DCD (Figura S2D). Em conjunto, nossa análise demonstra que durante a NMP há um aumento da expressão de genes que promovem a geração de energia, com efeitos potencialmente benéficos para o órgão, mas uma indução simultânea de genes pró-inflamatórios, que podem ser deletérios.

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2.3. Genes de vias inflamatórias em rins NMP associados a função retardada prolongada do enxerto

A fim de vincular as alterações transcricionais que ocorrem durante o armazenamento a frio e NMP aos resultados clínicos, realizamos RNA-Seq em biópsias retiradas de 33 rins DCD que foram submetidos a NMP como parte de um ensaio clínico randomizado atualmente avaliando sua eficácia.17 As amostras estavam disponíveis em um subconjunto de rins randomizados para o braço NMP do estudo que foi posteriormente transplantado (Tabela S3, Figura S1). A DGF é mais comum em rins DCD e é classicamente definida como requisito para diálise na primeira semana pós-transplante. No entanto, no pós-transplante imediato, alguns pacientes recebem um único episódio de diálise para hipercalemia, o que não reflete necessariamente a presença de necrose tubular aguda significativa. Portanto, usamos um modelo correlacionando a expressão gênica com o tempo entre a cirurgia de transplante e a última sessão de diálise (ou seja, duração da DGF). Isso mostrou alterações transcricionais mais acentuadas em transplantes que requerem diálise além das primeiras 24 horas de pós-transplante (Figura 2A), bem como uma correlação positiva significativa entre a expressão de genes de vias inflamatórias, incluindo "sinalização de TNFA via NFkB" e vias de "resposta inflamatória" e o comprimento de DGF, com maior enriquecimento dessas vias em rins que sofreram DGF pós-transplante mais prolongado (Figura 2B). Por outro lado, o comprimento do DGF correlacionou-se negativamente com a magnitude da expressão dos genes da via "OXPHOS" (Figura 2B). Tomados, em conjunto, esses dados indicam que após a NMP, os rins que apresentam menor expressão de genes da via inflamatória e maior expressão de genes da via "OXPHOS" são menos suscetíveis a DGF pós-transplante prolongado. Isso apoiaria a conclusão de que as alterações moleculares que ocorrem durante a NMP podem ter efeitos benéficos (indução de genes da via OXPHOS) e deletérios (indução de genes das vias inflamatórias).

2.4. O débito urinário e o fluxo sanguíneo renal durante a NMP demonstram diferentes associações com OXPHOS e genes da via inflamatória

A quantidade de urina produzida durante a NMP é um dos vários parâmetros incluídos nos escores de avaliação da qualidade cirúrgica usados ​​para orientar as decisões de utilização de órgãos,15 mas se a alta produção de urina durante a NMP realmente pressagia um bom prognóstico para o rim e as vias moleculares subjacentes ativadas na rins com alto débito urinário não é claro. Em um total de 10 rim submetido a NMP (rins apenas NMP, Tabela S1 e S2, Figura S1), observamos uma faixa de débitos urinários de 0 a 340 ml durante o período de 2-hora de perfusão (Figura 3A painel esquerdo). É importante notar que, quando comparamos as vias que mudam durante a NMP em cinco rins em dois experimentos independentes, descobrimos que vias semelhantes foram induzidas (Figura S3A), confirmando a reprodutibilidade do nosso projeto experimental e a utilidade de comparar vias em vez de genes individuais. Nas biópsias de 2-hora pós-perfusão, a expressão de 11 genes correlacionou-se significativamente com o volume de urina produzido nesse período. Estes incluíram proteínas de choque térmico (HSPs), HSPA1A, HSPA1B e HSPH1, que se correlacionaram positivamente com o aumento da produção de urina (Figura 3A painel direito). A análise de enriquecimento do conjunto de genes mostrou que a produção de urina também se correlacionou positivamente com os genes da via "TNF sinalização via NFkB" e negativamente correlacionada com os genes OXPHOS em biópsias pós-perfusão (Figura 3B, S3C). Da mesma forma, em biópsias pré-perfusão, OXPHOS correlacionou-se negativamente com a produção de urina nesses rins, enquanto as vias associadas à ativação imunológica, incluindo "sinalização de TNF via NFkB" e "rejeição de aloenxerto", correlacionaram-se positivamente com a produção de urina, sugerindo que NMP teve pouco efeito sobre esses processos , ou em outras vias analisadas, em rins com alto débito urinário (Figura 3B, S3C-D). Uma vez que a indução de genes da via inflamatória foi observada em nossas amostras clínicas com DGF prolongado (Figura 2B), esses dados desafiam o dogma de que a alta produção de urina ocorre em rins mais viáveis ​​e "saudáveis" e sugerem que, de fato, esses rins podem ter mais potencial inflamatório, são menos capazes de gerar energia e que esta não é substancialmente alterada durante a NMP.

O fluxo sanguíneo renal durante a perfusão também foi avaliado como um parâmetro que pode refletir a função do transplante subsequente.15 Nos 10 rins estudados, o fluxo sanguíneo renal em 2 horas de perfusão variou de 14,1 a 168,8 ml/minuto (Figura 3C, painel esquerdo). Nas biópsias de 2-hora pós-perfusão, oito genes correlacionaram-se significativamente positivamente com o aumento do fluxo sanguíneo renal (Figura 3C painel direito), incluindo HSPA1L, mas não houve sobreposição direta entre esta lista de genes e aqueles correlacionados com a produção de urina (Figura 3A ). A análise de enriquecimento do conjunto de genes demonstrou que o fluxo sanguíneo renal alto se correlacionou positivamente com os genes OXPHOS em biópsias de 0-hora, mas em contraste com aqueles com maior débito urinário, a perfusão teve um impacto significativo, resultando em uma correlação negativa com "OXPHOS" genes da via em 2 horas (Figura 3D, Figura S4A-B). Os fluxos de sangue renal correlacionaram-se negativamente com várias vias de genes imunes e inflamatórios em biópsias de 0- e 2-hora (Figura 3D, Figura S4B), em contraste com a produção de urina (Figura 3B, Figura S3C). Juntos, esses dados sugerem que o fluxo sanguíneo renal e a produção de urina podem não ser indicadores equivalentes de um rim mais viável, mas que o primeiro pode identificar mais fielmente um rim.rimmenos provável de ter DGF prolongada.

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2.5. A adição de um hem-adsorber ao circuito de perfusão não tem efeito sobre os parâmetros de perfusão, mas reduz significativamente a expressão de genes inflamatórios, incluindo NLRP3 e IL1B

Análises derimperfusate demonstraram um aumento substancial na concentração de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas durante o curso de hipotermia e NMP.20,21 Essas moléculas bioativas recirculam no rim, com potencial para induzir mais inflamação. Dado que nossa análise de transplantesrimas amostras indicaram que a indução de genes dependentes de TNF em rins NMP foi associada com DGF (Figura 2B), hipotetizamos que a remoção de citocinas e quimiocinas do circuito de perfusão pode atenuar a indução de genes inflamatórios, com potenciais efeitos benéficos para o rim. Tal abordagem mostrou alguma eficácia em pacientes com síndrome da resposta inflamatória sistêmica,22,23, e foi associada ao aumento do fluxo sanguíneo renal em rins suínos submetidos a NMP.18 Para testar isso em rins humanos, pegamos mais cinco pares de rins e realizamos NMP por 4 horas com biópsias feitas em 0, 2 e 4 horas (Figura S1). Em cada caso, um citosol hem-adsorber (HA) que remove moléculas com peso molecular de 10-50 kDa foi adicionado ao circuito de perfusão de um rim dentro de cada par (NMP mais HA) (Figura 4A). Conforme antecipado, a adição do HA resultou em concentrações mais baixas de uma variedade de citocinas no perfusato (Figura 4B), mas não teve efeito sobre o fluxo sanguíneo renal, produção ou composição da urina, consumo de oxigênio e homeostase ácido-base (Figura 4C, Tabela S4, S5). Assim, ao longo de 4 horas de NMP, o AH não teve impacto nos parâmetros de perfusão atualmente usados ​​clinicamente para gerar escores de avaliação de qualidade, mas teve um efeito substancial na expressão gênica; Após NMP, 1794 e 4026 genes foram regulados positivamente em 2 e 4 horas, respectivamente, incluindo TNF e IL6 (Figura 4D, E). mas apenas metade desse número (n=898 e n=2606) aumentou quando o HA estava presente (Figura 4D, Figura S5A e B). O número de genes regulados negativamente também foi reduzido pela adição de HA (Figura 4D). Após 4 horas de NMP, 46 genes foram significativamente upregulated e 181 downregulated com a adição do HA (Figura 4F). Essa resposta transcricional atenuada incluiu genes associados à ativação do inflamassoma NLRP3, como IL1B, NLRP3 e CASP1 (Figura 4G, Figura S4B) e algumas quimiocinas de recrutamento de neutrófilos (Figura S5C), previamente associadas à lesão renal em modelos animais.24,25 Isso demonstra que os mediadores solúveis liberados dorimrecircular e conduzir a expressão de novo de genes inflamatórios dentro do órgão, mas que isso pode ser aliviado por sua remoção do circuito de perfusão.

FIGURA 4 A adição de um hem-adsorber ao circuito de perfusão da máquina normotérmica tem efeitos substanciais no nível de citocinas no perfusato e no transcriptoma, mas não nos parâmetros físicos registrados no equipamento. Um par de rins humanos foi retirado do mesmo doador, um dos pares foi submetido ao protocolo padrão de perfusão normotérmica (NMP) por 4 horas e o outrorimfoi submetido a NMP com a adição de um hem-adsorber ao circuito. As amostras foram coletadas para RNA-Seq antes da perfusão (0 horas), após 2 horas e no final (4 horas). B, Concentração de citocinas chave no perfusato após 4 horas de NMP. A linha indica pares de rins. As medições de citocinas foram normalizadas para o conteúdo total de proteína perfusada. O valor P indicado é de um teste t pareado para a redução de citocinas com a adição de HA. C, Produção de urina e fluxo sanguíneo renal (FSR) ao longo do tempo de perfusão. A linha verde indica NMP sozinho e laranja com a adição de hem-adsorber. D, diagrama de Venn mostrando o número de genes significativamente expressos diferencialmente ao comparar as amostras 2-hr ou 4-hr com as amostras pre(0-hr). Os diagramas vermelhos são genes regulados positivamente e os azuis regulados negativamente. A interseção são os genes que são expressos deferencialmente em ambos os pontos de tempo na mesma direção. E, valores de expressão normalizados log2 para os genes indicados através da perfusão do transcriptoma do tecido, são indicadas barras de erro padrão. F, gráfico de Vulcão para comparação de pares de NMP sozinho com NMP mais HA em 4 horas. Vermelho indica genes expressos diferencialmente com um valor P ajustado<0.05. g,="" as="" for="">

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2.6. HA associado a uma redução na assinatura gênica associada à função do enxerto tardia

A análise de enriquecimento do conjunto de genes mostrou uma diminuição significativa na via de "sinalização de TNF via NFkB" em rins NMP mais HA em comparação com NMP sozinho (Figura 5A-B). Notavelmente, a presença do HA não só reduziu a expressão do gene inflamatório dentro dorimmas também aumentou as vias de metabolismo de OXPHOS e ácidos graxos, que contribuem para a geração de energia (Figura 5A-B). Portanto, as alterações nas vias de expressão gênica que ocorrem com o HA apoiariam a conclusão de que seus efeitos são clinicamente benéficos, uma vez que reduziu os genes da via "TNFA sinalização via NFkB" e aumentou os genes da via "OXPHOS", ambos associados a um menor duração da DGF (Figura 2B).

Para explorar ainda mais a relação entre as alterações transcricionais no NMP e os resultados clínicos, procuramos curar uma assinatura gênica presente em rins com DGF. Identificamos os 100 principais genes regulados positivamente (UP) e negativamente (DOWN) (classificados por alteração logarítmica) que se correlacionaram com o comprimento de DGF nas 33 amostras de ensaios clínicos (Figura 5C, Dados S1). Encontramos um enriquecimento significativo da assinatura gênica associada ao aumento do comprimento de DGF em amostras com maior produção de urina (Figura 5D), sugerindo que a alta produção de urina durante a NMP identifica rins em risco de DGF mais prolongada. Não houve correlação estatisticamente significativa entre a assinatura DGF e os genes associados ao maior fluxo sanguíneo renal (Figura 5E). Em seguida, avaliamos se e como a adição do HA ao circuito NMP afetou a expressão das assinaturas gênicas DGF "UP" e "DOWN". Notavelmente, isso mostrou que a expressão da assinatura gênica associada ao aumento do comprimento de DGF foi significativamente reduzida pela adição de HA, e a assinatura associada à diminuição do comprimento de DGF foi significativamente aumentada pela adição de HA (Figura 5F).

No geral, as alterações transcricionais que identificamos sugerem que o NMP tem benefícios potenciais sobre o armazenamento a frio em termos de seus efeitos na geração de energia no rim. No entanto, durante a perfusão, algumas moléculas bioativas são liberadas do rim para o circuito de perfusão, gerando uma alça de amplificação que impulsiona a inflamação quando reentram no rim. A remoção dessas moléculas interrompe esse loop e pode ser útil para reduzir a inflamação e aumentar a geração de energia, potencializando ainda mais os efeitos benéficos da NMP e reduzindo a suscetibilidade ao DGF (Figura 6).

FIGURA 5 A adição do adsorvedor de presunto reduz uma assinatura genética associada a DGF. Uma análise GSEA do efeito da adição de HA ao transcriptoma após 4 horas de NMP contra a via de características dos conjuntos de genes. Apenas caminhos significativos são traçados. Pontos vermelhos indicam enriquecimento positivo e azul negativo, o tamanho do ponto é inversamente correlacionado com o valor FDR q e a posição indica o escore de enriquecimento normalizado (NES). B, Gráficos de enriquecimento de GSEA para vias-chave do banco de dados Hallmark para comparação de A. A linha indica a pontuação de enriquecimento em execução e o gráfico de violino indica a distribuição dos genes membros do conjunto de genes em toda a lista de genes classificados usada em cada análise. C, Mapa de calor das quatro maiores correlações positivas (UP) e negativas (DOWN) com o comprimento de DGF e usado como parte da assinatura de expressão gênica para DGF. Assinatura DGF completa fornecida em dados suplementares. DF, assinatura gênica associada a DGF foi usada com GSEA para investigar a expressão da assinatura na correlação de 2-h produção de urina com 2-hr transcriptoma (D), correlação de 2-hr RBF com o transcriptoma 2-hr (E), e o efeito da adição de HA no transcriptoma às 4 horas (F). Parcelas como para A

FIGURA 6 Resumo gráfico. A, Durante o armazenamento a frio, há uma redução global na transcrição. Durante a NMP, a expressão de genes em várias vias é regulada positivamente, incluindo fosforilação oxidativa (OXPHOS) e genes de vias inflamatórias, como TNF, IL8 e NFkB. B painel esquerdo, Durante a NMP, os mediadores inflamatórios (círculos amarelos) são liberados dorimna solução de perfusão. Eles recirculam e estimulam a transcrição de genes pró-inflamatórios no rim e estão associados a uma redução nos genes de produção da via energética, reduzindo o ATP. Painel direito, A presença do hem-adsorber (HA) quebra esse loop de amplificação inflamatória

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3. DISCUSSÃO

Nossos dados mostram que o armazenamento a frio é eficaz na limitação de mudanças substanciais na expressão gênica. Isso está de acordo com os modelos de roedores, onde os rins armazenados por até 18 horas em armazenamento a frio mostraram pouca alteração na expressão de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL1, TNF e IL6.26 Nosso uso de perfis transcricionais globais imparciais em vez de a medição de um pequeno número de genes candidatos permitiu analisar a expressão de grupos de genes encontrados em vias específicas. Isso revelou uma redução significativa na expressão dos genes OXPHOS e da via da glicólise em rins armazenados a frio, potencialmente reduzindo a capacidade desses rins de gerar ATP, em linha com um estudo anterior mostrando ATP reduzido em rins humanos armazenados a frio.27 Vários de vias pró-inflamatórias também foram reguladas negativamente durante o armazenamento a frio, incluindo a ativação de TNF via NFkB e vias de espécies reativas de oxigênio que podem ser potencialmente benéficas. No entanto, pode ser que o armazenamento a frio apenas suspenda temporariamente essas vias e que, após a reperfusão no receptor, ocorram alterações semelhantes na expressão do gene inflamatório, conforme observado no NMP.

A NMP teve efeito contrário ao armazenamento refrigerado nos genes OXPHOS e da via da glicólise, aumentando sua expressão, com potencial para aumentar a capacidade celular de gerar ATP e restaurar a homeostase. É importante notar que a perfusão oxigenada hipotérmica de rins humanos também demonstrou aumentar os níveis de ATP em comparação com o armazenamento a frio 27, portanto, a restauração da oxigenação pode ser o principal estímulo para esses processos, em vez da normotermia. No entanto, essas alterações provavelmente serão benéficas para o órgão, dada nossa observação de uma correlação negativa entre o aumento da expressão dos genes da via OXPHOS e o DGF prolongado.

Um artigo recente de Hameed e cols.28 também realizou uma análise transcriptômica de NMP em três rins submetidos a NMP. Infelizmente, os autores não disponibilizaram seus dados publicamente, portanto, uma comparação aprofundada com nosso conjunto de dados não é possível. No entanto, seu manuscrito indicou a indução de genes relacionados à resposta imune durante a NMP, incluindo IL1B, CXCL2 e TNF, o que está de acordo com nossos achados.

Em nossa análise de rins submetidos a NMP no contexto de um ensaio clínico, correlacionamos assinaturas de expressão gênica com um comprimento de DGF em vez de incidência de DGF (definida como uma necessidade de diálise na primeira semana pós-transplante). Notavelmente, os rins com duração de DGF de 1 dia ou menos foram altamente transcricionalmente semelhantes àqueles sem DGF, provavelmente refletindo a necessidade de diálise devido à hipercalemia associada ao perioperatório, em vez de DGF genuíno. Descobrimos que um DGF mais longo foi associado a maior expressão de sinalização de TNFA via genes da via NFkB e menor expressão de genes associados a OXPHOS. Esses dados sugerem que rins com aumento de OXPHOS e diminuição da sinalização imunológica podem apresentar melhor potencial como rins de doadores, mas essa conclusão requer validação em um estudo prospectivo maior.

Também avaliamos os processos moleculares que se correlacionam com a produção de urina e sangue renal durante a NMP. Esses parâmetros foram usados ​​anteriormente, juntamente com várias outras medidas, para gerar um escore de avaliação de qualidade de rins perfundidos. Valores elevados de débito urinário e fluxo sanguíneo renal foram considerados como reflexo de um enxerto mais viável.15 Nossos dados revelam que as vias correlacionadas com débito urinário elevado e fluxo sanguíneo renal elevado diferem e, de fato, esses parâmetros demonstram associações opostas com vias inflamatórias . A alta produção de urina foi associada à maior expressão de genes da via imune, enquanto o alto fluxo sanguíneo renal foi negativamente correlacionado com essas vias. Também descobrimos que a assinatura do gene DGF que geramos foi enriquecida em rins com alta produção de urina durante a NMP, sugerindo que esse parâmetro pode identificar rins em risco de um DGF mais longo, em contraste com o dogma atual. Uma possível explicação é que uma produção de urina muito alta reflete rins com mais danos tubulares que não têm a capacidade de concentrar a urina. Assim, pode haver um "efeito Cachinhos Dourados" em relação ao débito urinário, onde rins com débito urinário baixo/pouco são aqueles com anormalidades substanciais na geração de filtrado, aqueles com débito urinário muito alto apresentam dano tubular substancial impedindo a concentração de urina. Essa hipótese precisaria ser testada em um número maior de rins que foram posteriormente transplantados.

Durante 4 horas de NMP, houve indução de genes inflamatórios no rim. No entanto, vale ressaltar que a prática clínica atual envolve apenas 1 hora de NMP, e esse efeito pode não ser evidente em um tempo de perfusão menor. No entanto, perfusão mais longa pode trazer benefícios em termos de restauração da oxigenação e geração de energia e, em nosso experimento, os efeitos negativos da indução de genes imunes podem ser substancialmente negados pela introdução de um citosol HA no circuito de perfusão. Esses dados indicam que mediadores inflamatórios gerados pelo rim durante o curso da NMP entram no circuito de perfusão e são capazes de exacerbar a inflamação estéril e que sua remoção melhora a indução de genes da via da inflamação observada durante a NMP. É importante ressaltar que mostramos que a adição do AH afeta a expressão de genes que estão associados a piores desfechos clinicamente. Nossa assinatura do gene DGF foi derivada de amostras submetidas a NMP como parte de um ensaio clínico avaliando sua eficácia, permitindo-nos vincular de forma robusta as alterações observadas em nossos estudos renais pareados com desfechos clínicos em rins submetidos a transplantes. No entanto, sua aplicação no contexto de um ensaio clínico será necessária para provar definitivamente a utilidade de sua aplicação em pré-transplante renal. O AH é inespecífico e pode remover moléculas úteis, além daquelas prejudiciais ao órgão. Descobrimos que o efeito líquido do HA no transcriptoma renal parecia benéfico, mas pode ser que um refinamento para remover especificamente mediadores deletérios comprovados possa ser ainda mais eficaz.

Os pares de rins que usamos eram do mesmo indivíduo e, portanto, eram geneticamente idênticos e haviam experimentado um ambiente semelhante ao longo da vida do doador. Confirmamos que seu transcriptoma de tempo 0 era extremamente semelhante (Figura S2 A, B). No entanto, essas biópsias amostram uma pequena parte do rim e os pares de rins podem ser afetados assimetricamente por patologia, por exemplo, cistos ou doença de pequenos vasos. Uma advertência adicional é que todos os rins usados ​​nos experimentos de intervenção apresentados aqui foram recusados ​​para transplante e alguns representam órgãos transplantados na extremidade inferior do espectro de qualidade. No entanto, observamos resultados altamente reprodutíveis ao comparar as vias gênicas em grupos de cinco rins. Também fomos capazes de demonstrar que rins de DCD e DBD tiveram uma resposta semelhante à perfusão. Ao combinar isso com nossa assinatura DGF pós-NMP com curadoria, fomos capazes de prever potenciais benefícios clínicos. Essa abordagem experimental pode ser empregada como uma ferramenta pré-clínica para rastrear futuras intervenções quanto à eficácia terapêutica potencial para permitir a seleção racional de intervenções candidatas para ensaios clínicos.

Em resumo, nosso estudo fornece o primeiro perfil transcricional global de rins humanos submetidos a NMP, resolvendo as diferentes vias moleculares que são ativadas em NMP em comparação com armazenamento refrigerado, e mostrando que os efeitos deletérios de moléculas bioativas produzidas ou liberadas do rim durante a NMP podem ser revertida pela adição de um HA. Além disso, esta intervenção reduziu a expressão de genes associados à DGF prolongada, fornecendo uma forte justificativa mecanicista para aplicar tal intervenção a um futuro ensaio clínico. Nossos dados também têm implicações para estratégias de perfusão além do rim, inclusive em transplantes de fígado e pulmão, sugerindo que a remoção de moléculas bioativas de perfusatos deve ser investigada nesses contextos onde a NMP é cada vez mais utilizada. Finalmente, nosso estudo destaca a utilidade do perfil transcricional global emrinspara avaliar novas intervenções em órgãos perfundidos; mudanças transcricionais precedem mudanças na abundância de proteínas (tradicionalmente usadas como biomarcadores derimlesão) e dezenas de milhares de transcritos de genes podem ser facilmente medidos. Assim, a medição de RNA tem o potencial de fornecer uma leitura precoce e sensível da função celular de órgãos humanos recuperados para transplante que pode ser aplicado a estudos futuros.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a todos os doadores de órgãos e suas famílias. O Clatworthy Lab agradece as principais instalações fornecidas pelo MRC Laboratory of Molecular Biology. Este trabalho foi realizado usando recursos fornecidos pelo Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3) operado pelo Serviço de Computação de Pesquisa da Universidade de Cambridge, fornecido pela Dell EMC e Intel usando o financiamento Tier-2 da Engineering and Physical Sciences Research Council (subvenção de capital EP/P020259/1) e financiamento DiRAC do Science and Technology Facilities Council (www. Dirac. ac. Reino Unido).

DIVULGAÇÃO

Os autores não têm conflito de interesse para divulgar conforme descrito pelo American Journal of Transplantation.

CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR

JRF, SH, MLN e MRC projetaram o estudo e interpretaram os dados. JRF, SH, TM, CJW, AF e TCD realizaram os experimentos. JRF, SH e MRC criaram figuras e tabelas. MRC escreveu o manuscrito principal. JRF e SH criaram os métodos e legendas das figuras, JRF, SH e MLN editaram o manuscrito.

Benefício Cistanche: melhora a função renal

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