A curcumina alivia a senescência das células-tronco mesenquimais da medula óssea canina durante a expansão in vitro

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Abstrato:A senescência em células-tronco mesenquimais (MSCs) não apenas dificulta a aplicação de MSCs na medicina regenerativa, mas também está intimamente relacionada ao envelhecimento biológico e ao desenvolvimento de doenças degenerativas. Neste estudo, investigamos os efeitos antienvelhecimento da curcumina (Cur) em MSCs derivadas da medula óssea canina (cBMSCs) e elucidamos ainda mais o potencial mecanismo de ação com base na modulação da autofagia. cBMSCs foram expandidos in vitro com procedimentos padrão para construir um modelo celular de senescência prematura.dosagem de cistache redditNossa evidência indica que, em comparação com a terceira passagem de cBMSCs, muitos fenótipos típicos associados à senescência foram observados na sexta passagem de cBMSCs. O tratamento com Cur pode melhorar a sobrevivência de cBMSC e retardar a senescência de cBMSC de acordo com as observações de que o tratamento com Cur(1 uM) pode melhorar a eficiência dos fibroblastos de unidade formadora de colônias (CFU-Fs) e regular a expressão de mRNA de fatores de transcrição pluripotentes (SOX{{5} } e Nanog), além de inibir as atividades da beta-galactosidase associada à senescência (SA- -gal) e a expressão de mRNA dos marcadores relacionados à senescência (pl6 e p21) e moléculas pró-inflamatórias (fator de necrose tumoral- (TNF-a) e interleucina-6(IL-6)). Além disso, Cur（0.1 uM~10μM） foi observado para aumentar a atividade autofágica, conforme identificado pela regulação positiva da proteína 1 cadeia leve 3 (LC3) associada a microtúbulos, unc51-como quinase ativadora de autofagia -1 (ULK1), gene relacionado à autofagia (Atg)7 e Atg12, e a geração do tipo II de cadeia leve 3(LC3-II), aumentando assim os vacúolos autofágicos e organelas vesiculares ácidas, como bem como causar uma diminuição significativa no nível da proteína p62. Além disso, o ativador de autofagia rapamicina (RAP) e Cur melhoraram parcialmente as características senescentes de cBMSCs, enquanto o inibidor de autofagia 3-metiladenina (3-MA) mostrou agravar a senescência de cBMSCs e o tratamento com Cur foi capaz de restaurar a autofagia suprimida e neutralizar a senescência de cBMSC induzida por 3-MA. Portanto, nosso estudo destaca o importante papel da autofagia induzida por Cur e seus efeitos na melhoria da senescência de cBMSC e fornece novos insights para retardar a senescência e melhorar o potencial terapêutico das MSCs.

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Palavras-chave:curcumina;senescência; autofagia; Células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea canina

1. Introdução

Envelhecimento e longevidade sempre foram temas sedutores para os organismos. Como um tipo de célula-tronco adulta com capacidade de autorrenovação, imunossupressão, diferenciação e migração, as células-tronco mesenquimais (MSCs) residem extensivamente em vários tecidos e órgãos, como medula óssea, tecido adiposo, líquido amniótico, placenta, tecido umbilical. medula e músculo [1,2], e desempenham um papel essencial na manutenção da homeostase do tecido ao longo da vida de um organismo [3,4]. O acúmulo de evidências revelou que o envelhecimento biológico e o desenvolvimento de muitas doenças degenerativas podem ser atribuídos à senescência das CTM [5,6]. Além disso, as MSCs são fontes promissoras de terapia regenerativa baseada em células, mas geralmente precisam ser expandidas in vitro para atingir o número mínimo de transplantes de MSCs (20-100 milhões) para tratamentos [7]. No entanto, a cultura in vitro não é capaz de simular completamente o microambiente in vivo das MSCs e, inevitavelmente, desencadeia a senescência celular [8,9] dano [11], estresse oxidativo [12] e ativação de oncogenes [13], e, finalmente, leva ao término da divisão celular. Além disso, as MSCs senescentes exibem um efeito negativo nas funções biológicas, incluindo imunomodulação, diferenciação e migração [14]. Muitos trabalhos tentaram estabelecer estratégias eficazes para retardar a senescência em MSCs. Recentemente, vários produtos derivados de ervas foram sugeridos para promover a saúde e a longevidade do organismo e podem ser ferramentas promissoras para retardar a senescência de MSC [15].

Cistanche pode anti-envelhecimento

A curcumina (Cur), um polifenol hidrofóbico extraído da cúrcuma da medicina tradicional chinesa, tem atraído grande atenção devido aos seus efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes, antiapoptóticos, antitumorais e antienvelhecimento em células de tecidos e alguns modelos de doenças [{ {4}}]. Numerosos estudos demonstraram que o Cur tem benefícios relacionados à saúde em doenças relacionadas à idade, incluindo doenças osteoarticulares, neurológicas, reprodutivas e cardiovasculares [20-24]. O envelhecimento está associado a alterações musculoesqueléticas e ao início e progressão de doenças osteoarticulares. A intervenção dietética crônica com Cur foi encontrada para melhorar a função motora da mão e dos dedos em macacos de meia-idade e teve efeitos benéficos no músculo esquelético envelhecido [25,26]. Os dados disponíveis de Buhrmann e colegas revelaram que o Cur pode atenuar a osteoartrite derivada do ambiente, equilibrando a sobrevivência dos condrócitos e as respostas inflamatórias [27,28]. Além disso, o Cur exerce efeitos neuroprotetores através da mediação de autofagia e inflamação e pode, portanto, ser uma terapia eficaz para pacientes com doenças neurodegenerativas, como doença de Alexander, doença de Alzheimer e doença de Parkinson [29,30].

De fato, o fato de o Cur possuir atividade pleiotrópica pode ser atribuído aos seus efeitos de ativação e proteção nas MSCs [31,32]. Vários estudos confirmaram que o Cur está envolvido na regulação das capacidades imunomoduladoras; o potencial diferencial de MSCs para diferentes linhagens celulares (neurócitos, condrócitos, adipócitos e osteoblastos), e em múltiplos mecanismos de sinalização está envolvido neste processo [2831,33-35]. Além disso, o Cur também é considerado um bom antioxidante para melhorar a vida útil das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de rato (ADSCs) devido ao aumento da expressão do gene da transcriptase reversa da telomerase (TERT) [36]. Um estudo recente mostrou que a inibição de p65 por Cur pode prevenir a senescência celular e ativação inflamatória em MSCs derivadas do cordão umbilical humano [37].benefícios do extrato de cistacheObviamente, mais atenção tem sido focada nos efeitos antienvelhecimento do Cur em MSCs devido ao seu enorme potencial terapêutico, mas os mecanismos subjacentes a esse efeito ainda não estão claros. Algumas evidências de estudos in vitro confirmaram que os efeitos benéficos exercidos pelo Cur devem ser atribuídos à sua modulação da autofagia [29,38-41]. Han e colegas demonstraram que o Cur pode proteger as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) do dano oxidativo induzido por H2O2-e que os efeitos positivos ocorrem pelo aumento da autofagia via fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/Akt/ alvo mamífero da inibição da rapamicina (mTOR) [40]. Outro estudo mostrou que o Cur é capaz de promover a sobrevivência celular inibindo a apoptose induzida por hipóxia/reoxigenação (H/R) e autofagia excessiva entre cardiomiócitos [41]. Portanto, se Cur atua como um regulador positivo ou negativo da autofagia depende do estímulo produtor de estresse e da configuração celular, e mais detalhes são necessários para determinar se a modulação da autofagia por Cur é uma estratégia eficaz para retardar a senescência das MSC. Como princípio de degradação e via de reciclagem de substâncias intracelulares, a autofagia desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase celular e na resistência à pressão ambiental e tem demonstrado o enorme potencial para retardar a senescência celular e tratar doenças relacionadas à idade. Disfunção de organelas e acúmulo de metabólitos tóxicos são as principais características das MSCs senescentes [42], sugerindo assim uma ligação potencial entre autofagia e senescência. Ma e colegas descobriram que a atividade autofágica de BMSCs envelhecidas foi diminuída em comparação com BMSCs jovens e que o inibidor de autofagia 3-metiladenina (3-MA) poderia acelerar a senescência em MSCs jovens; em contraste, eles descobriram que o ativador de autofagia rapamicina (RAP) poderia restaurar parcialmente as propriedades biológicas de BMSCs envelhecidas [5]. Um estudo recente examinou o papel da autofagia modulada através do emprego de RAP e 3-MA na senescência de MSC induzida por D-galactose (D-gal) e mostrou que RAP aliviou notavelmente a senescência de MSC [43]. Curiosamente, vários estudos demonstraram que um aumento da autofagia é observado em MSCs senescentes e que a autofagia é indispensável para manter os processos de senescência de MSC [44,45]. Portanto, se a autofagia pode ser considerada um regulador positivo ou negativo da senescência em MSCs permanece conflitante e ambíguo. Consequentemente, seria interessante investigar a relação entre autofagia, senescência de MSC e Cur, o que poderia fornecer uma perspectiva mais ampla para retardar a senescência e melhorar o potencial terapêutico das MSCs.

Neste estudo, nosso objetivo principal foi elucidar se o tratamento com Cur poderia retardar a senescência de MSC (cBMSC) derivada da medula óssea canina e se o mecanismo subjacente estava correlacionado com a modulação da autofagia. Para tanto, avaliamos a caracterização fenotípica, atividade autofágica e expressão gênica após exposição ao Cur em cBMSCs senescentes, bem como se a relação entre autofagia e seus efeitos na senescência de cBMSCs é determinada usando 3-MA e RAP .

2. Resultados

2.1. Características dos cBMSCs

As cBMSCs foram expandidas in vitro com procedimentos padrão e mostraram ser passadas de forma estável ao longo de nove gerações (dados não mostrados). Os cBMSCs exibiram uma aparência aderente ao plástico e semelhante a fibroblastos ao longo do processo de cultura (Figura 1A). A capacidade de diferenciação de cBMSCs foi confirmada por indução adipogênica e osteogênica (Figura 1B, C). O imunofenótipo de cBMSCs foi avaliado por citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a população de células expressou positivamente CD90, CD105 e ITGB1 e expressou negativamente CD31, CD34 e CD45, sugerindo sua origem mesenquimal em vez de hematopoiética (Figura 1 e Tabela 1).

2.2.cBMSCs exibem progressivamente recursos senescentes ao longo da expansão in vitro

Os cBMSCs de passagem precoce (P1 e P3) exibem uma forma fusiforme ou triangular longa e são dispostos em um redemoinho após o crescimento in vitro (Figura 2A). Subsequentemente, as cBMSCs exibiram gradualmente fenótipos associados à senescência ao longo do cultivo de longo prazo in vitro, caracterizado por uma morfologia alargada e plana e uma redução na proliferação (Figura 2A, B). Além disso, os resultados de um ensaio de unidade-fibroblasto formador de colônia (CFU-F) mostraram que tanto o número de CFU-F quanto o tamanho das colônias foram significativamente diminuídos ao longo das passagens de cultura (Figura 2C), consistente com o mRNA regulado negativamente expressão de fatores de transcrição pluripotentes Nanog e SOX-2 na 6ª e 9ª passagem (Figura 2G).

A -galactosidase associada à senescência (SA- -gal) é uma enzima lisossomal, cuja atividade está fortemente correlacionada com a senescência celular [46]. Os resultados da coloração SA- -gal indicaram que o número de células positivas para SA- -gal cresceu de 7,5± 2,4 por cento (P3) para 65.0 ±5.0 por cento (P6) e 87,3± 3,3 por cento (P9), respectivamente (Figura 2D).cistanche genghis khanAlém disso, foram detectados aumentos na expressão de inibidores da quinase do ciclo celular (p21 e p16) e moléculas pró-inflamatórias (TNF- e IL-6), que atuam como componentes de um fenótipo secretor associado à senescência (SASP). na 6ª e 9ª passagem (Figura 2E, F). Portanto, as cBMSCs exibem um aumento dependente da passagem nos fenótipos senescentes e cessam a proliferação na 9ª passagem.

2.3. Cur alivia o estado de senescência de cBMSCs

As cBMSCs de 6ª passagem foram incubadas na ausência ou presença de Cur em doses de 0.1,0.5,1,5 ou 10μmol/mL（μM） para 12h, 24h, 48h e 72h, e sua viabilidade celular foi avaliada usando CCK-8. Os resultados mostraram que Cur (0.1-10 uM) não induz um efeito tóxico em cBMSCs e tem efeitos palpáveis ​​no aumento da viabilidade de cBMSCs após 24 h de tratamento (Figura 3A). Para avaliar o efeito do Cur na senescência celular, as cBMSCs foram expostas a diferentes concentrações de Cur(0,1,1 e 10 uM) por 24 h. O resultado mostrou que o número de células positivas para SA- -gal foi significativamente diminuído em cBMSCs após o tratamento com Cur（1 μM e 10uM） em comparação com o grupo controle (Figura 3B). Ensaios de UFC-F foram usados ​​para avaliar os efeitos do Cur na eficiência de autorrenovação de cBMSCs(P6). Verificou-se que a dose de 1 uM de Cur era a concentração mais eficaz para melhorar a eficiência do CFU-F de cBMSCs. No entanto, a dose de 10 μM de Cur teve efeitos adversos na eficiência de autorrenovação de cBMSCs (Figura 3C). IL-6 e TNF- e regulação positiva da expressão de Nanog e SOX-2 (Figura 3D-F).extensão de vida de cistacheTomados em conjunto, esses resultados indicam que o Cur em uma dose de 1 uM pode efetivamente exercer efeitos citoprotetores em cBMSCs senescentes.

2.4. Atividade Autofágica Melhorada com Tratamento Cur em cBMSCs

A ativação funcional do lisossomo desempenha um papel crítico no curso da autofagia, e os distúrbios da acidificação lisossomal são adversos à função de degradação lisossomal [38]. Portanto, a atividade autofágica foi detectada pela primeira vez pela coloração LysoTracker, que pode monitorar a acidificação lisossomal. O resultado indicou que o pré-condicionamento com Cur aumentou de forma dependente da dose a intensidade da fluorescência vermelha em cBMSCs, o que sugeriu que a acidificação do lisossomo havia sido aumentada (Figura 4D).

Para avaliar ainda mais os efeitos do Cur na autofagia de cBMSCs, fizemos uso dos marcadores de autofagossomo proteína associada a microtúbulos 1A/1Belight chain 3 (LC3) e p62/SQSTM1, que são marcadores fundamentais para avaliar o fluxo autofágico [47,48 ]. O aumento da atividade autofágica foi observado em cBMSCs após a exposição ao Cur, como mostrado por um aumento dependente da dose na conversão de LC{{10}}I para LC3-II, juntamente com a aceleração de p62 degradação (Figura 4A). Além disso, a expressão de mRNA de ATG7, ATG12.LC3. e ULK1 foram regulados positivamente após o tratamento com Cur (Figura 4B). A ultraestrutura de cBMSCs foi examinada usando microscopia eletrônica de transmissão. Em seguida, observamos um aumento na formação de autofagossomos e autolisossomos em cBMSCs após tratamento com Cur em doses de 0,1, 1 e 10 μM por 24 h（Figura 4C）.cistache nzA coloração de imunofluorescência também mostrou que o número de pontos fluorescentes pontuados característicos de LC3 foi significativamente aumentado pelo tratamento com Cur (Figura 4E). Esses resultados indicaram que o Cur pode promover acidificação lisossomal e ativação de autofagia de maneira dose-dependente.

Este artigo é extraído de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms