Perfil Abrangente de Formulações de Secretoma de Células-Tronco do Fluido Amniótico Humano Fetal e Perinatal

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Além disso, a partir dos gráficos de barras nas Figuras 5B e 6B, a distribuição de proteína distinta de acordo com o pré-condicionamento hipóxico da célula secretora é apreciável. Nesse caso, para informações completas, também foram relatadas proteínas que não ultrapassam o limite do conjunto DAve e DCI. Fetal tem resultados secretomas enriquecidos com a proteína de choque térmico de 60 kDa (HSPD1, Figura 5B, painel esquerdo) em sua formulação hipóxica, enquanto a contraparte perinatal altamente expressa polipeptídeo de luz [52] regulador de miosina contrátil de células musculares lisas 9 (MYL9, Figura) 5B, painel direito). Uma parte importante da diferença entre os estágios gestacionais parece depender mais do pré-condicionamento hipóxico na SAFh. VEs; f-have-EVs obtidos de priming de células hipóxicas foram encontrados enriquecidos com fatores, incluindo Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Subunidade de Laminina -5 e -1(LAMA5 e LAMB1), Trombospondina{{17 }} (THBS1, Figura 6B, painel esquerdo). Os p-hAFS-EVs hipóxicos continham Cadeia Pesada de Ferritina (FTH1), proteínas de andaimes como Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Anexina A6 (ANXA6), Rab GDP inibidor de dissociação beta (GDI2), juntamente com Thy -1 glicoproteína de membrana (THY1), Neuropilina-1(NRP1) e Matrix Metalloprotein 14 (MMP14, Figura 6B, painel direito).

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As proteínas foram encontradas com uma frequência de pelo menos 2 em cada condição examinada em f-hAFS. EVs e p-hAFS-EVs foram ainda comparados com o banco de dados Vesciclepedia [53]. Como esperado, a maioria das proteínas identificadas (96 por cento) foram descritas anteriormente em EVs e exossomos no banco de dados de referência (Figura S3A).benefícios do cistacheA este respeito, a análise de enriquecimento Gene Ontology (GO) foi realizada por meio de FunRich [54]. A abundância de termos GO no conjunto de dados foi comparada com sua quantidade natural no banco de dados de referência para encontrar grupos de proteínas estatisticamente super-representados, de acordo com seu envolvimento em processos biológicos, função molecular e componentes celulares (para este último aspecto, os dados não são mostrado, mas disponível a pedido). Em relação à análise das funções moleculares associadas às proteínas identificadas, as frações de hAFS-CM indicaram enriquecimento em um constituinte estrutural da matriz extracelular e citoesqueleto, ligação a proteínas do citoesqueleto e atividade estrutural da molécula (Figura S2), enquanto as hAFS-EVs foram enriquecidas com um componente estrutural constituinte do citoesqueleto e ribossomo, ligação de DNA e RNA e fatores de ligação de GTPase e chaperona (Figura S3C).

A análise de enriquecimento de processos biológicos para hAFS-CM e ter-EVs indicou que a maioria das proteínas moduladas nas frações de secretoma de hAFS fetal e perinatal pertencem ao crescimento/manutenção celular e metabolismo de proteínas (Figuras 5C e 6C). Dentro dos hAFS-EVs, notamos que o termo "constituintes estruturais da matriz extracelular" estava associado exclusivamente a f-hAF-EVs hipóxicos; os termos "ligação de íons de cálcio" e "atividade molecular estrutural" foram enriquecidos principalmente em amostras hipóxicas de f-hAFS e p-hAFS (Figura S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10,4I e um DCI (confiança da expressão diferencial) Maior ou igual a I5I passaram pelos filtros e foram considerados diferencialmente expressos; consulte a Tabela S3 para obter a lista completa e os parâmetros detalhados das proteínas relatadas. (C) Análise de enriquecimento de processos biológicos de proteínas identificadas com uma frequência de pelo menos 2 em f-hAFS-EVs (painel esquerdo) e p-hAFS-EVs (painel direito) após pré-condicionamento hipóxico. Com base na ferramenta FunRich, os termos de ontologia de genes são mostrados em gráficos de barras informando a porcentagem de genes enriquecidos para cada categoria (barras amarelas escuras para f-hAFS-EVsnormo, barras vermelhas para f-hAFS-EVShypo, barras verdes claras para p-hAFS -EVsnormo e barras verdes escuras para p-hAFS-EVShypo). Apenas termos de ontologia genética com Bonferroni corrigido*p<0.05 are="">

Cistanche pode anti-envelhecimento

2.6. O perfil de citocinas e quimiocinas de Fetal vs. Perinatal tem-CM e tem-EVs revelaram diferentes padrões de distribuição

Nós validamos anteriormente a capacidade regenerativa de f-hAFS-CMhypo em células cardiovasculares lesadas por meio de efeitos parácrinos [34,35,49]. Aqui comparamos o conteúdo de citocinas e quimiocinas de f-hAFS-CMHypo com o correspondente p-hAFS correspondente (Figura 7A, Figura S4A e Tabela S4) e encontramos alguns fatores discriminantes.

ANGIOGENINA, Indutor de Metaloproteinase de Matriz Extracelular (EMMPRIN), Interleucina 8 (IL-8) e Proteína Quimioatraente de Monócitos-1 (MCP-1) foram encontrados exclusivamente enriquecidos com inf-hAFS-CMNypo e não foram detectado em p-hAFS-CMhypo. A proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGFBP2) e a osteopontina (OPN) foram significativamente aumentadas em f-hAFS-CMhypo sobre p-hAFS-CMHypo em 3.5-e 3.8-vezes (" p<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Enquanto feto-versus perinatal têm-CM mostrou expressão diferencial em seu perfil de citocinas e quimiocinas, os correspondentes EV fetal versus perinatal foram distribuídos de forma mais homogênea, embora com perfis de expressão mais baixos (Figura 7B, Figura S4B e Tabela S5). No entanto, algumas diferenças podem ser observadas: DiPeptidil-Peptidase IV (DPPIV), fator de crescimento/diferenciação 15 (GDF-15) e IL-8 foram expressos apenas por f-hAFS-EVSHypo, embora em baixas níveis; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND e Vitamin D-binding Protein (VDBP) foram encontrados apenas em p-hAFS-EVShypo, apesar de mais uma vez detectados em baixas quantidades. Outras citocinas, como Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, Proteína 3 de Ligação do Fator de Crescimento Semelhante à Insulina (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, Fator Derivado do Estromal{ {23}} alfa (SDF-1a), foram encontrados em f-hAFS-EVShypo e p-hAFS-EVSHvpo, com PAI-1 e EMMPRIN sendo mais altamente expressos (Figura 7B)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 e SDF-lo foram exclusivamente enriquecidos em todos os EVs hipóxicos em comparação com o hAFS-CM correspondente, independentemente do estágio gestacional. Além disso, enquanto EMMPRIN não foi detectado dentro de p-hAFS-CMhypo, foi encontrado enriquecido na fração correspondente de EV; inversamente, OPN foi mais abundante em f-have-CMhypo do que em f-have-EVShypo, enquanto foi comparável entre as frações de secretoma p-hAFS correspondentes. FGF-19,MIF e PTX3 foram expressos de forma semelhante em CM fetal e perinatal e nos hAFS-EVs correspondentes. PAI-1 foi altamente enriquecido em frações secretomas hipóxicas.

Figura 7. Perfil de citocinas e quimiocinas em formulações de secretoma de hAFS fetal e perinatal. (A) Expressão de citocinas e quimiocinas detectadas dentro da hipóxia fetal versus perinatal ter-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) são relatadas em densidade de pixels por unidade arbitrária [AU]. Os valores são expressos como média ±sem de experimentos independentes e relatados na Tabela S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B)Conteúdo de citocinas e quimiocinas detectado no feto hipóxico- versus hAFS-EVs perinatais (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) e expresso pela densidade de pixels em unidades arbitrárias [AU].colesterol cistancheOs valores são expressos como média±sem de n=3 experimentos independentes e relatados na Tabela S5. CST3: Cistatina C;EMMPRIN: Indutor de Metaloproteinase de Matriz Extracelular;FCFF-19: Fator de Crescimento de Fibroblastos-19;IGFBP2:Fator de Crescimento Semelhante à Insulina (IGF) Proteína de Ligação 2;IL-8:Interleucina -8;IL-17a:Interleucina-17a; MCP-1: Proteína Quimioatraente de Monócitos-1;MIF:Fator Inibitório de Migração de Macrófagos; PTX3: Pentraxina 3; PAI-1: Inibidor do Ativador de Plasminogênio-1; BDNF: Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro; DPPIV: Dipeptidil Peptidase IV; GDF-15:Fator de diferenciação de crescimento-15;IGFBP3:Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)Proteína de ligação 3;SDF-1a: Fator derivado do estroma-1 alfa; VDBP: Proteína de ligação à vitamina D.

2.7. Os EVs fetais e perinatais são enriquecidos com informações de RNA em sua carga

Uma vez que pequenos RNAs não codificantes foram considerados reguladores mestres da influência parácrina de EV nas células-alvo [4,55], focamos principalmente a análise de sequenciamento de RNA no conteúdo de microRNA (miRNA) dentro de f-hAFS-EVs e p-hAFS-EVs. O perfil de RNA pequeno mostrou enriquecimento de miRNA em hAFS-EVs fetais e perinatais (cerca de 35-36 por cento) quando comparado à quantidade total de RNA pequeno (Figura 8A). O componente miRNA estava de fato entre as duas espécies de RNA mais representadas em ambas as formulações de EV, juntamente com rRNA(***p) p < 0.0001).="" os="" seguintes="" mirnas="" foram="" os="" mais="" enriquecidos="" nas="" amostras="" de="" ev="" analisadas:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,="" deixe-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" e="" mir-221-3p.="" é="" importante="" notar="" que="" os="" evs="" fetais="" e="" perinatais="" compartilharam="" a="" maioria="" desses="" mirnas="" (ou="" seja,="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47="" }}f-5p,="" deixe-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54)="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" e="" mir-221-3p,="" figura="" 7b).="" as="" 15="" espécies="" de="" mirnas="" mais="" enriquecidas="" cobriram="" mais="" de="" 60="" por="" cento="" do="" conteúdo="" total="" de="" mirna="" em="" cada="" amostra.="" por="" outro="" lado,="" cerca="" de="" 100="" mirnas="" foram="" encontrados="" nos="" 30%="" restantes="" do="" conteúdo="" de="" mirna="" vesicular="" (figura="">

Para caracterizar ainda mais o conteúdo de miRNA dentro de hAFS-EVs, investigamos se o estágio gestacional de hAFS ou o pré-condicionamento de células hipóxicas in vitro poderiam influenciar o enriquecimento de miRNAs específicos. A modulação mais forte foi encontrada entre os estágios gestacionais, onde quase todos os miRNAs modulados foram enriquecidos em f-hAFS-EVs sobre a contraparte perinatal (Figura 9A e Tabela 1). O pré-condicionamento hipóxico teve um efeito mais suave na carga de miRNA, enquanto nesta comparação a modulação foi em qualquer direção, com alguns miRNA enriquecidos em condições hipóxicas e outros em condições de controle normóxico (Figura 9A).

Como análise complementar, focamos na identificação de miRNAs investigados com a menor variabilidade entre os diferentes doadores e pré-condicionamento de cultura, para EVs derivados de ambos os estágios gestacionais investigados. Os miRNAs resultantes desta análise variaram de níveis de expressão altos a baixos (Figura 9B). Dentro do núcleo de miRNA mais estável da carga de hAFS-EVs, alguns miRNA compartilhados entre f-hAFS-EVs e p-hAFS-EVs foram identificados (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p em nível alto; miR-221-3p,miR-221-5p e miR-22-3p em nível de escurecimento, Tabela 2).

Figura 9. Análise do enriquecimento diferencial de miRNAs em hAFS-EVs fetais e perinatais. (A) Gráficos de vulcão para enriquecimento diferencial da carga de miRNA hAFS-EV de acordo com o estágio gestacional (painel esquerdo) e pré-condicionamento hipóxico in vitro de células secretoras (painel direito). Para detalhes do miRNA, consulte a Tabela 1. (B) Gráfico de dispersão da correlação entre variabilidade (eixo X) e nível de enriquecimento (eixo Y) de miRNAs estáveis ​​dentro de hAFS-EVs fetais (painel esquerdo) e hAFS-EVs perinatais (painel direito) de acordo com alto (pontos amarelos), enriquecimento dim (pontos verdes) e baixo (pontos roxos escuros). Para detalhes de miRNA, consulte a Tabela 2.RPM: leituras por milhão.

3. Discussão

Amostras descartadas de líquido amniótico humano foram identificadas como uma fonte valiosa de células estromais com potencial promissor em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. As preocupações éticas associadas ao seu isolamento são mínimas, uma vez que podem ser obtidas a partir de amostras de sobras de amniocentese pré-natal de rotina, durante o segundo trimestre de gestação (SAF fetal), ou de líquido amniótico descartado como resíduo clínico em cesarianas programadas no terceiro trimestre (hAFS perinatal). Nos últimos anos, o hAFS tem sido proposto como potencial terapêutico para reparo e regeneração de tecidos humanos, dadas as evidências animadoras obtidas a partir de modelos experimentais de doenças. Curiosamente, eles também foram propostos para terapia in utero de doenças neurológicas fetais-neonatais; de fato, estudos pré-clínicos sugeriram que o hAFS administrado no pré-natal via parto intra-amniótico protegeu a medula espinhal durante a gestação por meio de atividade parácrina em um modelo de mielomeningocele em ratos [56-58], e reduziu o dano do intestino exposto em gastrosquise experimental de roedores[59] ]. De uma perspectiva translacional, o transplante in utero de hAFS pode ser substituído pela administração da preparação mais adequada de seu secretoma (hAFS-CM ou hAFS-EVs).efeitos colaterais do cistanche deserticolaEssa estratégia permitiria uma intervenção rápida e oportuna durante a gestação, superando as limitações da terapia celular canônica (ou seja, a expansão celular in vitro demorada), ao mesmo tempo em que fornece formulações farmacêuticas prontas para uso e prontas para uso.

O desenvolvimento recente de técnicas de diagnóstico pré-natal menos invasivas pode resultar em uma diminuição dos procedimentos de amniocentese em um futuro próximo, defendendo assim a hAFS perinatal como a opção mais acessível. No entanto, como os hAFS fetais são mais imaturos no desenvolvimento, eles podem abrigar um potencial parácrino mais eficaz. Dentro deste cenário, aqui comparamos c-KITt hAFS fetal e perinatal e nos concentramos em perfilar suas frações secretomas. Destacamos distinções relevantes a serem levadas em consideração para a possível tradução clínica de sua capacidade parácrina.

De acordo com estudos independentes anteriores, mostramos que o estágio gestacional não influenciou a morfologia heterogênea da hAFS e seu perfil de antígeno mesenquimal [25,26]. Em seguida, avaliamos os parâmetros mais propensos a impactar a atividade secretora e parácrina das células além do imunofenótipo estromal canônico. Notavelmente, a presença de uma subpopulação CD146-positivo, CD107a-high dentro de progenitores mesenquimais da medula óssea foi recentemente mostrado para se correlacionar com notável atividade parácrina modulatória e terapêutica [47]. Aqui nós revelamos que tanto o hAFS fetal quanto o perinatal são fortemente caracterizados por essa assinatura molecular que suporta sua potência secretora com implicações translacionais relevantes. Além disso, os hAFS fetais foram caracterizados por metabolismo aeróbico ineficiente, enquanto os perinatais mais maduros apresentaram maior taxa de consumo de oxigênio e síntese de ATP. Isso pode sugerir um perfil metabólico mais imaturo do hAFS do segundo trimestre que se assemelha às células estromais do cordão umbilical de recém-nascidos prematuros, que mostraram a mesma tendência [60].

Para desencadear o potencial parácrino, os hAFS foram expostos a 24 h de iniciação hipóxica sem soro, uma estratégia que desenvolvemos anteriormente com sucesso [34,35,37] para células fetais e que aqui investigamos em sua contraparte perinatal pela primeira vez. O pré-condicionamento de hAFS fetal e perinatal sob hipóxia resultou em uma tendência positiva no aumento de sua concentração de secretoma e na quantidade de EVs liberadas, enquanto o estágio gestacional não exerceu nenhum efeito sobre a produção de secretoma celular nem sobre a morfologia e distribuição de tamanho de EVs.

Notavelmente, a caracterização da carga parácrina de hAFS revelou algumas diferenças específicas, de acordo com as diferentes condições que avaliamos. O perfil proteômico do secretoma hAFS fetal revelou distribuições de fatores discerníveis com base no estágio gestacional e pré-condicionamento hipóxico celular. Isso indica que o potencial parácrino de hAFS pode adquirir uma identidade distinta durante a maturação de Ⅱ a Ⅲ trimestre de gestação que, por sua vez, pode ser modulado estimulando as células secretoras in vitro. A análise de enriquecimento de processos biológicos de hAFS-CM e hAFS-EVs sugeriu que a maioria das proteínas moduladas pode concorrer para o crescimento/manutenção celular e metabolismo de proteínas, apoiando assim os efeitos parácrinos benéficos para as células relatados até agora. Em particular, o secretoma total de hAFS fetal hipóxico foi encontrado enriquecido com a proteína de choque térmico HSPD1 (HSP60), que demonstrou apoiar a cicatrização de feridas em um modelo de lesão de pele de camundongo diabético e promover a distorção pró-resolução de macrófagos no fenótipo M2 [61] . Da mesma forma, os hAFS-EVs fetais hipóxicos foram enriquecidos por fatores que promovem a neurogênese (HSPG2[62], autorrenovação celular e desenvolvimento cerebral e cardiovascular (LAMA5[63] e LAMB1[64] e migração (THBS1 [2])). O proteoglicano AGRN também foi encontrado em EVs após iniciação hipóxica de hAFS fetal.dosagem de cistache redditNossos achados estão de acordo com evidências anteriores de AGRN sendo regulado positivamente no proteoma de células estromais mesenquimais sob estímulos instrutivos inflamatórios e hipóxicos [65]. AGRN também demonstrou estar implicado na sinalização de sinapses imunes [66] e concordar com a regeneração cardíaca neonatal de camundongos [67], apoiando assim uma predisposição pronunciada de hAFS fetal em desenvolvimento para efeitos parácrinos regenerativos. Além disso, o hAFS fetal foi confirmado como sendo mais responsivo ao pré-condicionamento hipóxico, como demonstrado pelo enriquecimento de preditores de eficácia regenerativa vascular, como ANGIOGENINA, EMMPRIM, IL-8 e MCP-1 citocina[68], em seu meio condicionado. Isso apóia evidências anteriores da potência parácrina do hAFS-CM fetal em aumentar a neo-arteriogênese endógena em modelos pré-clínicos de roedores de infarto do miocárdio, isquemia de membros posteriores e retalho fasciocutâneo isquêmico [34,{10}}]Além disso, o hAFS fetal O secretoma total foi encontrado significativamente mais enriquecido com IGFBP2 e OPN quando comparado ao perinatal, sugerindo assim um perfil modulatório pró-resolução e antienvelhecimento mais pronunciado[72-75]. O ter-MC perinatal, embora menos acentuado em fatores parácrinos, foi similarmente suplementado com fatores neurotróficos e imunomoduladores, como CST3[76,77] e MIF[78].

Comparado ao hAFS-CM total, os correspondentes EVs fetais e perinatais hipóxicos apresentaram menor expressão de citocinas e quimiocinas, com exceção do mediador de remodelação vascular EMMPRIN [79], que foi principalmente enriquecido no compartimento da vesícula. O perfil cardioativo e pró-regenerativo relatado anteriormente de hAFS-EVs fetais [34,37] foi confirmado aqui pela evidência de sua expressão exclusiva de IL cardioprotetora-8 [80] e GDF-15, um fator parácrino chave que desencadeia a neurogênese endógena do hipocampo adulto[81,82], bem como neutraliza a cardiotoxicidade induzida por antraciclinas [78]. Ambos os hAFS-EVs fetais e perinatais mostraram expressão semelhante para o progenitor/regulador de tráfego de células-tronco SDF-1 [83-85]. A análise proteômica relatou aumento da expressão de proteínas relacionadas à angiogênese, como NRP1 [86] e MP14[87] em hAFS-EVs perinatais hipóxicos; tal perfil estimulatório pode explicar os resultados anteriores sobre as propriedades regenerativas endoteliais de Ⅲ trimestre hAFS em um modelo de camundongo pré-clínico de lesão isquêmica do músculo esquelético [25], apesar da evidência de seu hAFS-CM ser menos pró-angiogênico do que o fetal correspondente. Notavelmente, o fator de crescimento neural BDNF foi encontrado na carga de EV fetal e perinatal, embora em pequenas quantidades, sugerindo assim uma atividade neurotrófica putativa para hAFS-EVs na sobrevivência neuronal e nos processos de desenvolvimento neurológico, como também observado para vesículas extracelulares secretadas pelo osso humano medula e sangue do cordão umbilical-MSC[8889]. Ambas as formulações de secretoma de hAFS fetal e perinatal submetidas a estimulação hipóxica mostraram-se enriquecidas com PAI-1, um facilitador da ativação endotelial [90] que também esteve envolvido na polarização de macrófagos M2 no coração e dotado de cardioproteção e potencial antifibrótico [91].

MicroRNAs (miRNAs) têm sido amplamente abordados como reguladores cruciais da atividade parácrina de células-tronco e células estromais mesenquimais-EV [92,93]. Aqui descobrimos que as 15 espécies de miRNA mais enriquecidas dentro dos hAFS-EVs cobrem mais de 60 por cento do conteúdo total de miRNA em cada amostra. Esses miRNAs foram relatados para caracterizar a carga molecular de EVs de células estromais mesenquimais (deixe-7a-5p [4,95]), proteger contra isquemia miocárdica, influenciando a regeneração vascular e inibindo a fibrose (deixe -7b-5p, deixe-7f-5p, miR-21-5p e miR-155-5p [96,97]), promover cicatrização de feridas regulando a função dos queratinócitos (miR-16-5p [98]) e neutralizando a morte neuronal após isquemia do prosencéfalo (miR-29a-3p [99.100]). Por outro lado, cerca de 1.000 miRNAs foram encontrados nos 30% restantes do conteúdo de miRNA vesicular. Essa distribuição desequilibrada é consistente com estudos anteriores [4] e destaca os miRNAs mais enriquecidos como os responsáveis ​​pela principal atividade biológica dos hAFS-EVs. Curiosamente, os hAFS-EVs fetais e perinatais compartilharam a maioria dos 15 miRNAs. É importante notar que também observamos que tanto os hAFS-EVs fetais quanto os perinatais continham um conjunto de miRNAs muito estáveis ​​em diferentes níveis de enriquecimento. Tal evidência pode sugerir uma ampla gama de candidatos de "limpeza" a serem usados ​​como um controle de referência interno em experimentos de qPCR em hAFS-EVs. Além disso, um subconjunto consistente de tais miRNAs estáveis ​​(miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) é compartilhado entre os dois estágios gestacionais e se sobrepõe aos 15 mais enriquecidos, sugerindo um comportamento ainda mais constante e uma assinatura molecular pré-resolvida confiável([96,{{45 }}]). É importante notar que alguns candidatos dentro desse núcleo distinto foram relatados recentemente como miRNAs de referência dentro de EVs neuroprotetores obtidos de células estromais mesenquimais derivadas do líquido amniótico do segundo trimestre (miR-29a-3p e miR{{ 49}}p[95]). No entanto, também notamos que a idade gestacional pode modular a carga de miRNA mais do que o pré-condicionamento hipóxico. EVs mais juvenis de desenvolvimento obtidos de hAFS fetal do terceiro trimestre foram enriquecidos com miRNAs previamente demonstrados para apoiar a viabilidade de células-tronco embrionárias (miR-302-3p [101]), proliferação celular e diferenciação osteogênica de células estromais da medula óssea (miR -217 [102]), além de abrigar potencial supressor de tumor (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

Com base em nossos resultados, aqui confirmamos que hAFS fetal e perinatal podem representar fontes parácrinas atraentes a serem exploradas para medicina regenerativa. Embora seu fenótipo e atividade secretora fossem semelhantes, destacamos alguns aspectos peculiares em suas formulações de secretoma como insights úteis para sua futura tradução terapêutica.

4. Materiais e Métodos

4.1. Isolamento de células-tronco de fluido amniótico humano e cultura in vitro

Células-tronco do líquido amniótico humano (hAFS) foram isoladas de amostras de sobras de líquido amniótico (AF) coletadas por triagem pré-natal de rotina via amniocentese de Ⅱ trimestre (hAFS fetal, f-hAFS) ou como resíduos clínicos durante cesariana programada durante Ⅲ trimestre (perinatal hAFS,p-hAFS) na Unidade de Diagnóstico Pré-natal e Medicina Perinatal do Hospital IRCCS San Martino, na Unidade Médica e Cirúrgica Fetal e perinatal e no Laboratório de Genética Humana do hospital IRCCS Istituto Gaslini (Génova, Itália). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores de acordo com a autorização do comitê de ética local (protocolo PR428REG2015) e em conformidade com as diretrizes da Declaração de Helsinque. As amostras de FA fetal do segundo trimestre foram obtidas de doadoras com idade média de cerca de 37,42±0,32 anos (n=15 variando de 36-até 41 anos);Ⅲ amostras de FA perinatal do trimestre foram obtidas de doadoras do sexo feminino com idade média de 34,25±1,31 anos (n=10 variando de 26- até 42 anos). hAFS fetal e perinatal foram obtidos de amostras validadas para cariótipo normal e isoladas por triagem imunomagnética para expressão de c-KIT (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Itália) de células estromais mesenquimais AF aderentes [16].benefícios do extrato de cistachec-KIT* hAFS foram cultivados em Meio Essencial Mínimo (MEM)-alfa com 15% de FBS (Soro Fetal Bovino, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália), 18% Chang B e 2% Chang C Medium (Irvine Scientific , Santa Ana, CA, EUA) com 1% de L-glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália), em uma incubadora a 37 graus com 5% de CO2 e 20% de atmosfera de Oz e cultivadas a 5 passagens in vitro antes de serem usadas para isolar seu secretoma.

4.2. Avaliação Bioquímica do Metabolismo de hAFS

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) células foram usadas para cada experimento. Para avaliar a respiração basal, hAFS foram permeabilizados com 0,03 mg/mL digitonina por 10 min e suspensos em tampão fosfato salino (PBS). Piruvato 10 mM mais malato 5 mM ou succinato 20 mM foram adicionados para estimular o caminho -vias compostas pelos Complexos I, II e IV ou Complexos Ⅱ e IV, respectivamente [60].

Para avaliar as contribuições relativas para a respiração de glutamina, oxidação de ácidos graxos de cadeia longa e glicose, após a permeabilização com digitonina, as células foram suspensas em um meio de crescimento e 4 uM de BPTES, 4 uM de Etomoxir e 4 uM de UK5{{22} } 99 foram adicionados para inibir a glutaminase, carnitina palmitoil-transferase 1A (CPT1A), ou o transportador de piruvato mitocondrial (MPC), respectivamente. A atividade da Fi-F.ATP sintase (ATP sintase) foi detectada medindo a produção de ATP pelo método luciferina/luciferase altamente sensível. Os ensaios foram conduzidos a 37 graus, por 2 min, e os dados foram coletados a cada 30 s. Em um primeiro conjunto de experimentos, células de 10 graus foram incubadas por 10 min em meio contendo 50mM KCl,1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0.6mMouabain,1mM P1P5-Di (adenosina-5') penta-fosfato, 0,040 mg/mL de ampicilina e 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Posteriormente, a síntese de ATP foi induzida pela adição dos substratos respiratórios (10 mM de piruvato mais 5 mM de malato ou 20 mM de succinato) e 0,1 mM de ADP. A reação foi medida usando o kit de ensaio de bioluminescência ATP de luciferina/luciferase CLSII (Roche, Basel, Suíça) em um Luminômetro (Luminômetro GloMax 20/20, Promega, Milão, Itália) soluções padrão de ATP (Roche, Basel, Suíça) variando {{ 42}}/M foram usados ​​para calibração. No segundo conjunto de experimentos, a síntese de ATP foi avaliada na presença de 4 uM de BPTES, 4 uM de Etomoxir ou 4 uM de UK5099. Neste caso, 10 células foram incubadas por 10 min em um meio de crescimento na ausência ou presença de um inibidor do metabolismo e a síntese de ATP foi induzida com 0,1 mM de ADP. A eficiência de OxPhos (fosforilação oxidativa) (relação P/O) foi calculada como a razão entre a concentração de ATP produzido e a quantidade de oxigênio consumido na presença de substrato respiratório e ADP. Quando o consumo de oxigênio é totalmente dedicado à produção de energia, a razão P/O deve ser de aproximadamente 2,5 e 1,5 após a adição de piruvato mais malato ou succinato, respectivamente [48] no meio de crescimento. O consumo de glicose foi avaliado pelo sistema de acoplamento hexoquinase (HK) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), seguindo a redução de NADP em 340 nm. O meio de ensaio continha 100 mM de Tris-HCl, pH 7,4,2 mM de ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12,2 IU de hexoquinase e 2 IU de glicose -6-fosfato desidrogenase. A liberação de lactato foi testada após a redução de NAD mais a 340 nm. O meio de ensaio continha 100 mM de Tris-HCl (pH8), 5 mM de NAD mais 1 IU/mL de lactato desidrogenase. As amostras foram analisadas antes e após a adição de 4 ug de lactato desidrogenase purificada. Em ambos os casos, os dados foram normalizados para o número de células e expressos como mM de glicose/células de 10 graus ou mM de lactato liberado/células de 10 graus, respectivamente[107].

4.3. Caracterização de Citometria de Fluxo de hAFS

Cem mil (105)células fetais e p-hAFS foram destacadas e incubadas com anti-humano-CD107a-Alexa Fluor 647-e anti-humano CD146-FITC- anticorpos conjugados (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália). A apoptose celular foi avaliada usando um Kit de Detecção de Apoptose de Anexina V FITC (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Milão, Itália) seguindo as instruções do fabricante. Os eventos foram adquiridos em um classificador e analisador BD Bioscience FACS Aria II, equipado com software FACS Diva (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milão, Itália). Os dados foram analisados ​​usando o software FlowJo V9.0 (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milão , Itália). 4.4. Coloração de Senescência

O fenótipo de senescência de hAFS cultivado até a passagem 5 em condições in vitro padrão foi avaliado com Senescence -Galactosidase Staining Kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA): f-hand p-hAFS foram fixados com 1x solução fixadora a 70 por cento confluência e corado para SA- -gal a 37 graus durante a noite, de acordo com as instruções do fabricante. Os eventos senescentes foram adquiridos em um microscópio Leica DMil (equipado com o software Leica Acquire V3.4.4, Leica Microsystems, Milão, Itália) e avaliados como uma porcentagem de células SA{11}}gal-positivas sobre o total de células por campo.

4.5. Separação e Concentração das Frações de Secretoma de hAFS

f-hAFS e p-hAFS foram cultivados por 24 h em meio sem soro (SF) em 1 por cento O2 hipóxia versus 20 por cento O2 normóxia (controle), o último dos quais foi usado como referência de linha de base. Essa estratégia de pré-condicionamento foi usada para aumentar a liberação de fatores parácrinos bioativos, como relatamos anteriormente [34,35,37,49]. hAFS foram cultivados por 24h em meio sem soro (SF) (meio de Eagle modificado por Dulbecco de alta glicose, DMEM, com 1 por cento de L-glutamina e 1 por cento de penicilina/estreptomicina, todos da Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália), sob normóxia (20 por cento O2 e 5 por cento CO2 a 37 graus) ou hipóxico (1 por cento O2 e 5 por cento CO2 a 37 graus nas incubadoras CellXpert C170i e Galaxy 48R CO2, de Eppendorf, Milão, Itália).

f-hAFS-CM e p-hAFS-CM foram coletados e centrifugados a 4 graus a 300x g por 10 min e 2000× g por 20 min para remover detritos celulares; hAFS-CM foi concentrado usando membranas de ultrafiltração com um corte seletivo de 3 kDa (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Alemanha) a 4 graus a 3000 × g por 90 min e depois concentrado a 4 grau em 3000× g por 30 min. hAFS-EVs foram separados e concentrados por ultracentrifugação em série de hAFS-CM. Resumidamente, o hAFS-CM foi coletado e centrifugado a 4 graus a 300 x g por 10 min e 2000 x g por 20 min para remover detritos celulares. O sobrenadante foi então processado a 10.000 x g por 40 min. O pellet foi descartado e o sobrenadante foi posteriormente processado por ultracentrifugação em Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milão, Itália) a 10.000 × g por 120 min usando rotores de centrífuga SW55Ti de balde oscilante da Beckman Coulter. O pellet contendo hAFS-EVs heterogêneos foi lavado em PBS com centrifugação final a 100.000 x g por 120 min e depois ressuspenso em PBS filtrado com uma membrana de filtro de poro de 0,22 µm. As concentrações de proteína em hAFS-CM e na superfície de hAFS-EVs foram medidas usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália). As amostras foram adquiridas em um leitor de microplacas Gen5 a 570 nm para avaliar o rendimento de hAFS-CM e hAFS-EVs em termos de µg de solução/células produtoras de 10 graus.

4.6. Caracterização de hAFS-EVs por Microscopia Eletrônica de Transmissão e Análise de Rastreamento de Nanopartículas

A análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi realizada em um microscópio Hitachi TEM (série HT7800, Hitachi High Technologies, Monza, Itália). As imagens digitais foram obtidas com uma câmera Mega view 3 e software Radius (EMSIS, Muenster, Alemanha). f-hAFS e p-hAFS foram fixados em solução de paraformaldeído (PA) a 3,7 por cento diluída 1:1 com meio completo de hAFS, lavados em tampão de cacodilato 0.1 M e, em seguida, imediatamente incubados por 1 h em temperatura ambiente em Tampão cacodilato 0,1 M contendo 2,5 por cento de glutaraldeído (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, EUA). Os pellets de células foram pós-fixados em tetróxido de ósmio por 1h e em solução de acetato de uranila a 1% por 1h. As amostras foram desidratadas por 24 horas a 42 graus e 48 horas a 60 graus através de uma série de etanol graduada e embutidas em resina epóxi (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Alemanha). Cortes ultrafinos (50 nm) foram cortados com micrótomo Leica Ultracut (Leica Microsystems, Milão, Itália) e contracorados com acetato de uranila a 5 por cento em solução de etanol a 50 por cento. f-hAFS-EVs e p-hAFS-EVs foram ressuspensos em 20 µL de solução de PBS e fixados pela adição de um volume igual de 2 por cento de paraformaldeído em solução de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4). Os EVs foram então adsorvidos por 10 min em grades de cobre revestidas com formvar-carbono, flutuando as grades em gotas de 5 μL em parafilme. Subsequentemente, as grades com EVs aderentes foram lavadas em PBS e coradas negativamente por solução de acetato de uranila a 2 por cento por 5 min em temperatura ambiente. Grades manchadas foram incorporadas em 2,5 por cento de metilcelulose para melhor preservação e secas ao ar antes do exame. A análise morfométrica de hAFS-EVs foi medida em 10 micrografias tiradas aleatoriamente em 40.000× g de ampliação. O tamanho foi calculado usando a função de linha arbitrária incorporada na caixa de diálogo de medição do software Radius (EMSIS, Muenster Germany). Para visualizar a distribuição de tamanho de hAFS-EVs, os resultados foram plotados como gráfico de pontos de dispersão e como distribuição de frequência em que cada tamanho é representado como um ponto junto com linhas para o valor mediano e o intervalo.

f-hAFS-EVs e p-hAFS-EVs também foram analisados ​​por Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA) para avaliar partículas liberadas por células de 10 graus. Os hAFS-EVs foram diluídos 1:100 em solução de PBS e adquiridos em um NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) que registrou pelo menos 3 quadros diferentes de 60 s cada. Três diferentes aquisições de cada amostra foram analisadas usando a opção Batch Process no software. 4.7. Análise de LC-MS/MS de hAFS-CM e hAFS-EVs 4.7.1. Digestão em solução

A análise proteômica foi realizada em 3 réplicas biológicas de hAFS-CM e hAFS. EVs de f-hAFS e p-hAFS após pré-condicionamento normóxico ou hipóxico (n=24 condições diferentes). Amostras de hAFS-CM e hAFS-EVs foram suspensas em 0.1M NHCO3 pH 7,9 e tratadas com RapigestIM Reagente SF (Waters Co, Milford, MA, EUA) na concentração final de 0,25 por cento (p/v). As suspensões resultantes foram incubadas com agitação a 100 graus por 2{{40}} min. A digestão foi realizada em cada amostra adicionando Tripsina Modificada de Grau de Sequenciamento (Promega Inc, Madison, WI, EUA) a uma razão enzima/substrato de 1:50 (p/p) durante a noite a 37 graus em 0,1 M NH4HCO3 pH 7,9 tampão com 10 por cento de CHSCN. Uma alíquota adicional de tripsina (1:100 p/p) foi adicionada pela manhã e a digestão continuou por 4h. Além disso, a adição de 0,5 por cento de ácido trifluoroacético (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, EUA) interrompeu a reação enzimática e uma incubação subsequente a 37 graus por 45 minutos completou a hidrólise ácida RapiGest[108]. Os produtos de degradação imiscíveis em água foram removidos por centrifugação a 13,{37}} rpm por 10 min. Finalmente, as misturas de digestão tríptica foram dessalinizadas usando colunas de spin PierceTM C-18 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália), de acordo com o protocolo do fabricante, e foram ressuspensas em ácido fórmico 0,1 por cento (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, EUA) em água (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, EUA) na concentração de 0,1 ug/μL.

4.7.2. Cromatografia Líquida

As misturas digeridas com tripsina foram analisadas por meio de uma plataforma composta por um sistema cromatográfico nano-líquido, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent, parte da AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, EUA) configurado no modo trap-elute, acoplado a um espectrômetro de massa de alta resolução. Resumidamente, as amostras (0,8 ug injetadas) foram primeiro carregadas em uma armadilha de peptídeos (200 um × 500 um ChromXP C18-) CL,3 um,120 A) e lavado com a bomba de carregamento funcionando em modo isocrático com 0,1 por cento de ácido fórmico em água por 10 min a um fluxo de 3 μL/min. A comutação automática de uma válvula de dez portas eluiu a mistura aprisionada em uma coluna de fase nano-reversa (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL,3 um,120 A) através de um gradiente de 150 min do eluente B (eluente A, 0,1 por cento de ácido fórmico em água; eluente B, 0,1 por cento de ácido fórmico em acetonitrilo) a um caudal de 300 nL/min. Em profundidade, o gradiente era: de 5-10 por cento Bin 3min,10-40 por cento Bin 130min,40-95 por cento Bin 10 min e mantendo a 95% B por 7min. 4.7.3. Espectrometria de Massa

As análises MS/MS foram realizadas em um espectrômetro de massa LTQ-OrbitrapXL (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália) equipado com uma fonte de íons nanospray. A voltagem capilar de pulverização foi fixada em 1,7 kV e a temperatura capilar de transferência de íons foi mantida em 22{11}} graus. Os espectros de MS completos foram registrados em uma faixa de 400-1600 m/z no modo de íons positivos, com um poder de resolução de 60.000 (largura total na metade do máximo) e uma taxa de varredura de 2 espectros/s. Esta etapa foi seguida por cinco eventos MS/MS de baixa resolução que foram gerados sequencialmente de maneira dependente de dados nos cinco principais íons selecionados do espectro MS completo (com 35% de energia de colisão), usando a exclusão dinâmica de 0,5 min para Análise MS/MS. As funções de varredura de espectrômetro de massa e gradientes de solvente de cromatografia líquida de alta eficiência foram controlados pelo sistema de dados Xcalibur versão 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália).

4.7.4. Processamento de Dados Proteômicos e Mineração de Dados

Todos os dados gerados foram pesquisados ​​usando o mecanismo de busca Sequest HT contido no software Thermo Scientific Proteome Discoverer, versão 2.1. Os espectros MS/MS experimentais foram correlacionados com sequências peptídicas trípticas por comparação com os espectros de massa teóricos obtidos por digestão in silico do banco de dados de proteoma Uniprot Homo Sapiens (74600 entradas), baixado em 2 de janeiro 020 (www.uniprot.org, acessado em 10 2 de março021). Os seguintes critérios foram usados ​​para a identificação de sequências peptídicas e proteínas relacionadas: tripsina como enzima, três clivagens perdidas por peptídeo, tolerâncias de massa de ±50 ppm para íons precursores e ±0,8 Da para íons fragmentos. O nó Percolator foi usado com uma estratégia alvo-decoy para fornecer uma taxa final de falsa descoberta (FDR) no nível Peptide Spectrum Match (PSM) de 0,01 (estrito) com base em valores q, considerando um deltaCN máximo de 0,05 [109]. Apenas peptídeos com comprimento mínimo de 6 aminoácidos e rank1 foram considerados. Agrupamento de proteínas e princípios de parcimônia estritos foram aplicados. Os dados MS foram depositados no ProteomeXchange Consortium através do repositório PRIDE [10]parceiro (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, acessado em 10 de março de 2021) As 48 proteínas obtidas do algoritmo SEQUEST foram alinhadas, normalizadas , e comparação sem rótulos. Um algoritmo interno, a saber, o Multidimensional Algorithm Protein Map (MAProMa) foi empregado para este fim, usando as correspondências de espectro de peptídeos médios (aPSM) [111,112] que correspondem à média de todos os espectros identificados para uma proteína e, consequentemente, , à sua abundância relativa, em cada condição analisada. Em profundidade, para selecionar proteínas diferencialmente expressas, subgrupos (para ambos feto- vs perinatal-hAFS-CM e hAFS-EVs, considerando também estimulação de pré-condicionamento de células hipóxicas), foram comparados aos pares aplicando um limiar de 0,4 e 5 nos dois MAProMa índices DAve (Média Diferencial) e DCI (Índice de Confiança Diferencial), respectivamente. DAve, que avalia as mudanças na expressão de proteínas, foi definido como (XY)/(X＋Y)/0,5, enquanto DCI que avalia a confiança da expressão diferencial, foi definido como (X mais Y)×(XY)/2 O X e Y termos representam o PSM de uma determinada proteína em duas amostras comparadas. Além disso, as listas de proteínas médias, obtidas de cada condição examinada, foram submetidas à análise discriminante linear (LDA), e as proteínas com maior razão F (maior ou igual a 4,5) e menor valor p (menor ou igual a 0,001) foram retidos e processados ​​por agrupamento hierárquico, aplicando o método de Ward e a métrica de distância de Euclides usando o software JMP 15.2. Especificamente, a razão F representou o quadrado médio do modelo dividido pelo quadrado médio do erro, enquanto o valor de p indicou a probabilidade de se obter um valor F maior que o calculado se, na realidade, não houvesse diferença entre as médias dos grupos populacionais. 4.8. Perfil de citocinas e quimiocinas de hAFS-CM e have-EVs

O perfil de citocinas e quimiocinas de hAFS-CM e have-EVs obtido por f-hAFS e p-hAFS após pré-condicionamento hipóxico foi avaliado por meio do kit Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array (R&D System, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com o instruções do fabricante. Vinte µg das amostras de hAFS-CM e hAFS-EVs foram usadas. As imagens das membranas foram adquiridas por um Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, UK) O conteúdo específico de citocinas/quimocinas foi avaliado pela quantificação da intensidade de pixel positiva (por meio da unidade arbitrária) para cada citocina detectável usando o software ImageJ (disponível em https: //imagej.nih.gov/ij/, acessado em 10 de março de 2021 [13]). 4.9. Extração de RNA de hAFS-EVs e Próximo

Sequenciamento de Geração

O RNA foi isolado de f-hAFS-EVs e p-have-EVs com o kit miRNeasy Micro (Qiagen, Milão, Itália) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do RNA e a distribuição de tamanho foram avaliadas usando o Agilent Small RNA Kit com o chip de RNA não codificante pequeno para avaliar o conteúdo de RNAs pequenos variando de 6 a 150 nucleotídeos (nt). O Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itália) foi usado para quantificar o conteúdo de microRNAs (miRNAs), seguindo as instruções do fabricante. Bibliotecas de sequenciamento de miRNAs foram preparadas e amplificadas usando o kit QIAseq miRNA Library (Qiagen, Milão, Itália) usando 18,5 ng de miRNAs isolados como entrada e seguindo as instruções do fabricante. As bibliotecas foram agrupadas após uma verificação de qualidade e a quantificação por TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, EUA) foi realizada usando Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. As bibliotecas agrupadas foram avaliadas para controle de qualidade por qPCR em tempo real seguindo o guia "Sequencing Library qPCR Quantification" (Illumina Inc, San Diego, CA, EUA) e sequenciadas pela plataforma Illumina NextSeq usando High Output Hit v2.5 (75 ciclos) ( Illumina Inc, San Diego, CA, EUA). A chamada de base foi realizada com o fluxo de trabalho padrão Illumina NextSeq500.

4.10. Análise de dados bioinformáticos de sequenciamento de miRNA

Os arquivos Fastq foram processados ​​pela primeira vez aparando o adaptador de 3' e as bases de baixa qualidade usando Cutadapt [114]. Após o corte, as sequências de inserção e as sequências de UMI foram identificadas. As leituras sem sequência do adaptador, as leituras com menos de 16 bp de sequências de inserção e as leituras com menos de 10 bp de sequências UMI foram descartadas. Para anotar as sequências de inserção, as leituras foram alinhadas à montagem do genoma humano GRCh38 usando Bowtie [15]Para cada amostra, todas as leituras atribuídas a um miRNA específico foram contadas e as UMIs associadas foram agregadas para contar moléculas únicas. A análise secundária foi realizada por scripts R personalizados disponíveis mediante solicitação razoável. A análise de enriquecimento diferencial foi realizada usando os pacotes Limma [116] e EdgeR Bioconductor [117].

4.11. Análise estatística

Os resultados são apresentados como média ±sem de pelo menos três (n{{0}}) experimentos independentes. As comparações foram feitas por ANOVA de uma via seguida pelo teste posthoc de comparações múltiplas de Tukey ou pelo teste t de Student. As análises foram realizadas usando o Graph-Pad Prism Versão 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, acessado em 10 de março de 2021) com significância estatística definida em * p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

Em conclusão, hAFS fetal e perinatal foram encontrados fenotipicamente equivalentes com potência secretora comparável e enriquecimento EV em tamanho e distribuição; no entanto, algumas distinções em seu perfil secretoma podem ser apreciadas. Especificamente, o perfil de desenvolvimento imaturo de hAFS fetal pode ser recapitulado por suas formulações de secretoma dotadas de um secretoma pró-vasculogênico, pró-regenerativo e rejuvenescedor mais pronunciado. No entanto, o hAFS perinatal ainda mantém um perfil parácrino relevante por meio da expressão de fatores relacionados à migração de células endoteliais, potencial imunomodulador, anti-inflamatório e neurotrófico semelhante ao hAFS fetal. Esses achados podem fornecer informações úteis para uma futura terapia parácrina de doenças relacionadas a lesões e doenças inflamatórias/isquêmicas. Portanto, a seleção de hAFS fetal ou perinatal como a fonte celular mais ideal deve ser avaliada considerando o cenário clínico específico.

Este artigo é extraído de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms