Avaliação abrangente da atividade antioxidante dos polissacarídeos Cistanche Deserticola por vários índices

Junjie1, Gao Lianchun1, Meng Xinrui1, Wang Menghan1, Liu Xiaohua1. 1. Escola de Farmacêutica, Universidade de Lanzhou, Lanzhou 730000, China; 2. Guangzhou Yuming Biological Technology Co,LTD,Guangzhou 511400,China Autor correspondente:Liu Xiaohua,E-mail:liuxiaoh@lzu.edu.cn

【Abstrato】 Objetivo:Avaliar a atividade antioxidante dos polissacarídeos Cistanche deserticola por vários índices in vivo e vitro. Métodos: Experiências antioxidantes in vitro focadas na taxa de eliminação de radicais livres de polissacarídeos Cistanche deserticola, incluindo eliminação de DPPH, eliminação de radical hidroxila (·OH), redução de ferricianeto de potássio e método de eliminação de nitrito. O peso corporal e o índice do baço de camundongos foram considerados, e os conteúdos de superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px) e malondialdeído (MDA) no soro, fígado e tecidos cerebrais foram detectados em camundongos modelo de envelhecimento d-galactose. Resultados: C80 teve melhor efeito de eliminação de DPPH e OH in vitro. A taxa de ganho de peso e índice de baço de camundongos（P<0.05）were improved,and the SOD,GSH-Px activities and MDA content in serum,liver and brain tissues had significant differences（P＜0.01）using C80 could in mouse aging model,but there was no difference between high and low dose groups（P＞0.05）. Conclusão:C80 tem boa atividade antioxidante in vivo e vitro.

【Palavras-chave】polissacarídeo cistanche deserticola;radicais livres;depuração;atividade antioxidante;modelo de envelhecimento

Nos últimos anos, a "economia da beleza" se desenvolveu rapidamente e a escala de consumo da indústria de cuidados com a pele da China vem se expandindo ano a ano. Os produtos antienvelhecimento para a pele tornaram-se gradualmente o foco do consumo. De acordo com dados do Euromonitor, o tamanho do mercado antienvelhecimento da China atingiu 64,6 bilhões de yuans em 2020, representando 28,8% da participação no mercado de cuidados com a pele da China, e está prestes a ultrapassar a hidratação para se tornar a maior categoria de produtos para a pele [1]. Os cosméticos antienvelhecimento referem-se a cosméticos que podem resistir ao envelhecimento, resistir à oxidação e resistir às rugas, também conhecidos como produtos antienvelhecimento para a pele.

Antioxidantes artificiais, como butil hidroxianisol (BHA) e butil hidroxitolueno (BHT), que dominam o mercado, têm fortes efeitos colaterais tóxicos e efeitos adversos em órgãos como fígado, baço e pulmões, causando danos. Comparados aos antioxidantes sintéticos, os antioxidantes naturais são mais seguros e mais facilmente aceitos pelo público, enquanto os polissacarídeos vegetais são considerados os antioxidantes naturais mais ativos que podem atuar direta ou indiretamente sobre os radicais livres [2].

Benefícios da cistanche tubulosa—Antioxidante

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Cistanche deserticola YCMa, uma planta de Orobanchaceae, toma caules carnudos secos com escamas como um remédio autêntico. É um medicamento chinês comumente usado para tonificar o rim e revigorar o yang. Tem as funções de tonificar o rim, tonificar a essência e umedecer a secura. Sua frequência de aparecimento em prescrições antienvelhecimento antigas perde apenas para o ginseng. A pesquisa médica moderna mostrou que os polissacarídeos de Cistanche deserticola têm efeitos farmacológicos, como aumento da imunidade e antioxidação [2]. Os componentes ativos da Cistanche deserticola, como glicosídeos feniletanóides e polissacarídeos, têm certos efeitos no retardo do envelhecimento da pele [3]. Atualmente, a pesquisa sobre o efeito antioxidante do polissacarídeo Cistanche deserticola se concentra no estudo antioxidação in vivo. Através do modelo experimental de envelhecimento de camundongos causado por D-neneneba galactose [5-11], a superóxido dismutase (SOD) e outros indicadores no pulmão, fígado, coração e outros tecidos de camundongos são detectados para verificar se Cistanche deserticola polissacarídeo tem um efeito anti-oxidação. Os polissacarídeos de Cistanche deserticola são frequentemente preparados usando métodos tradicionais de extração de água e precipitação de álcool, que apresentam baixas taxas de extração, baixa solubilidade e dificuldade na purificação posterior. Além disso, os polissacarídeos naturalmente estruturados obtidos possuem alto peso molecular, alta viscosidade e baixa biodisponibilidade.[12].

Efeitos do cistanche - antioxidante

Este experimento usou a tecnologia composta de ultrassom assistida por enzimas [13] para extrair polissacarídeos de Cistanche deserticola. De acordo com a concentração do álcool precipitado, os polissacarídeos foram divididos em três partes para obtenção dos polissacarídeos Cistanche deserticola. Este experimento também combina experimentos antioxidantes in vivo e in vitro para avaliar de forma abrangente vários indicadores e elucidar cientificamente a atividade antioxidante dos polissacarídeos Cistanche deserticola.

1 Material e Métodos

1.1 Instrumentos e drogas de teste

Espectrofotômetro UV visível UV-1700 (Shimadzu Company, Japão), microscópio óptico BX43 (sistema de imagem DP27) (Olympus Corporation). Cistanche deserticola vem da Gansu Huiqin Biotechnology Co., Ltd. Após ser identificado pelo professor associado Yang Zhigang da Escola de Farmácia da Universidade de Lanzhou, este produto é seco,caule suculento de Cistanche deserticola YCMa, uma planta da família Orobaceae. 1,1-Difenil-2-picrilfenilhidrazina (DPPH), sulfato ferroso, cloridrato de naftaleno etilenodiamina, rodamina B, ácido ascórbico e vitamina E foram adquiridos da McLean Biochemical Technology Co., Ltd. O kit GSH Px, o kit malondialdeído, o kit T-SOD e o kit Coomassie Brilliant Blue foram adquiridos da Nanjing Jiancheng Instituto de Pesquisa em Bioengenharia.

Principais constituintes químicos de Cistanche deserticola

1.2 Animais experimentais:

50 camundongos Kunming machos de grau limpo, fornecidos pelo Animal Center da Universidade de Lanzhou, com número de qualificação de qualidade: SCXK (Gan) 2013-0002.

1.3 Preparação de polissacarídeos Cistanche deserticola [13]

O pó medicinal de Cistanche deserticola foi extraído 3 vezes com acetato de etila e etanol na proporção de 8, 8 e 6 vezes e desengordurado por 2 horas de cada vez; Após o desengorduramento, adicione papaína (2 por cento), celulase (2 por cento) e pectinase (0,4 por cento) ao pó, adicione água para fazer a proporção de material para líquido 1 ∶ 20, extraia em três vezes ( 8, 7, 5 vezes), temperatura 54,1 graus, pH 5,2, enzimólise por 2 horas e, em seguida, conduza a extração ultrassônica, cada vez por 45 minutos, extraia duas vezes, filtre e combine o filtrado, depois centrifugue o sobrenadante e concentre-o para um décimo do volume original. Goteje 95 por cento de etanol na solução concentrada enquanto mexe até que a concentração total de etanol do filtrado atinja 30 por cento. Em seguida, deixe repousar e centrifugue para obter o precipitado correspondente. Liofilizar para obter o polissacarídeo 1 Cistanche deserticola ma correspondente (C30). O sobrenadante continua a precipitar com etanol até que a concentração total de etanol do filtrado atinja 50%. Centrifugar para obter o polissacarídeo Cistanche deserticola 2 (C50) e, em seguida, continuar a precipitar com etanol até que a concentração total de etanol do filtrado atinja 80 por cento. Obtenha o polissacarídeo Cistanche deserticola 3 (C80 para abreviar).

Estudo Experimental sobre Cistanche deserticola

1.4 Método experimental de oxidação in vitro

A capacidade de eliminação de radicais livres do DPPH é medida pela absorbância a 517 nm [14]. A capacidade de eliminação do radical hidroxila foi determinada por espectrofotometria rodamina B [15]. Com base no princípio de que o radical hidroxila pode oxidar rapidamente a rodamina B para fazê-la desaparecer, a capacidade antioxidante do polissacarídeo foi determinada em 545nm de acordo com o grau de desbotamento. A força de redução foi determinada usando o método de redução de ferrocianeto de potássio [16]; A determinação da capacidade de eliminação de radicais livres de nitrito foi realizada usando o método de cloridrato de naftaleno etilenodiamina [17].

1.5 Métodos de teste de antioxidantes in vivo

50 camundongos machos Kunming foram divididos aleatoriamente em 5 grupos e alimentados de forma adaptativa por 7 dias. Eles foram pesados. Todas as manhãs, os camundongos do grupo C80, grupo modelo e grupo positivo foram injetados com solução de D-neneneba galactose de acordo com 150mg/kg para fazer o modelo de envelhecimento, enquanto os camundongos do grupo branco foram injetados com solução salina normal de acordo com o mesmo volume. Todas as tardes, os camundongos do grupo positivo foram alimentados com suspensão de vitamina E na dose de 50mg/kg. O grupo C80 de alta concentração foi administrado por gavagem com uma dose de 400 mg/kg, o grupo de baixa dose C80 foi administrado por gavagem com uma dose de 200 mg/kg, e os grupos branco e positivo foram alimentados com solução salina fisiológica no mesmo volume. A pesagem foi realizada a cada sete dias, e o experimento durou vinte e oito dias [18-19].

Os camundongos foram usados ​​para colher sangue dos globos oculares, dissecar os camundongos, retirar o fígado, baço e tecidos cerebrais, medir o índice do baço e detectar o conteúdo de superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH Px) e malondialdeído ( MDA) no soro, tecidos hepáticos e tecidos cerebrais.

1.6 Métodos Estatísticos

O software estatístico SPSS 20 foi usado, a análise de fator único (ANOVA) foi usada e o método LSD foi usado para comparação pareada. P<0.05 indicates a statistically significant difference.

2 resultados

2.1 Resultados do experimento de oxidação in vitro

À medida que a concentração de polissacarídeos Cistanche deserticola aumenta, as taxas de depuração dos radicais C30, C50, C80, DPPH, radicais hidroxila, método de redução do ferricianeto de potássio e capacidade de eliminação do radical nitrito de sódio aumentam com o aumento da concentração. Em comparação com a vitamina C, as taxas de depuração dos radicais livres DPPH e dos radicais livres hidroxila foram melhores. Na mesma concentração, diferentes experimentos antioxidantes in vitro mostraram que a taxa de depuração de C80 foi significativamente maior que a de C50 e C30, indicando que C80 teve um melhor efeito de eliminação de radicais livres, seguido por C50. A partir da análise abrangente de quatro experimentos antioxidantes in vitro, pode-se concluir que o C80 tem a melhor atividade antioxidante in vitro. Portanto, C80 foi selecionado para experimentos antioxidantes in vivo. Consulte a Figura 1-4.

Figura 1 Taxa de eliminação de radicais livres DPPH de polissacarídeos Cistanche deserticola

Figura 2 Taxa de eliminação do radical hidroxila dos polissacarídeos Cistanche deserticola

Figura 3 Método de redução de ferrocianeto de potássio de polissacarídeos Cistanche deserticola

Figura 4 Taxa de depuração de nitrito de sódio dos polissacarídeos Cistanche deserticola

2.2 Resultados de experimentos antioxidantes in vivo

2.2.1 O efeito de C80 na taxa de ganho de peso e índice de baço em camundongos.

Houve uma diferença estatisticamente significativa na taxa de ganho de peso e índice do baço entre os grupos (P<0.01). The weight gain rate of the blank group was significantly higher than that of the model group, and the difference was statistically significant (P. After administering the medication, the weight of each group of mice increased. The spleen is an important immune organ in mice. Compared with the spleen index of the model group, the spleen index of the blank group is higher, and the difference is statistically significant (P<0.01), indicating successful modeling. The spleen index of each administration group significantly increased compared to the model group (P<0.01), indicating that C80 has a certain recovery effect on the immune function of aging model mice. See Table 1.

Tabela 1 Taxa de ganho de peso e índice de baço de camundongos

Nota: Em comparação com o grupo modelo, * P<0.05, * * P<0.01

2.2.2 O efeito de C80 no conteúdo de MDA, GSH-Px e SOD no soro.

No soro, houve diferenças estatisticamente significativas em MDA, GSH-Px e SOD entre os grupos (P<0.01). Compared with the model group, the blank group showed a significant increase in the activity of SOD and GSH-Px in the serum, while the level of MDA was significantly reduced, with statistical significance (P<0.01), indicating the successful construction of the anti-aging model in mice. Compared with the model group, the activity of SOD and GSH-Px in the high and low concentration groups of C80 significantly increased, while the level of MDA significantly decreased, and the difference was statistically significant (P<0.01); Compared with the positive group, the high-dose, and low-dose C80 groups showed better enhancement of SOD, GSH-Px activity, and decreased MDA levels compared to the low-dose C80 group. This indicates that C80 in serum has good antioxidant activity in mice, and the effect of high concentrations is better. See Table 2.

Tabela 2 Efeito de C80 nos níveis de MDA, GSH-Px e SOD no soro

Nota: Em comparação com o grupo modelo, * P<0.05, * * P<0.01

2.2.3 O efeito de C80 no conteúdo de MDA, GSH-Px e SOD no fígado.

No fígado, houve diferenças estatisticamente significativas nos níveis de MDA, GSH-Px e SOD entre os grupos (P<0.05). Compared with the model group, there was a statistically significant difference in the content of SOD, GSH-Px, and SOD in the liver homogenate between the blank group and the model group (P<0.01). The enzyme activity increased and the MDA level decreased, and there was a statistical difference (P<0.01), indicating that the construction of the anti-aging model in mice was successful. The SOD and GSH-Px enzyme activities in the liver of each treatment group were significantly increased compared to the model group (P<0.05), while the MDA level was significantly reduced (P<0.05). Compared with the positive group, there was a significant difference in the model group, while there was no difference between the high-dose group and the low-dose group (P>0.05). Portanto, pode-se concluir que o C80 pode regular a alta concentração e o desequilíbrio de espécies reativas de oxigênio no tecido hepático de camundongos modelos envelhecidos e possui boas propriedades antioxidantes.

Tabela 3 Efeito de C80 no conteúdo de MDA, GSH-Px e SOD no fígado

Nota: Em comparação com o grupo modelo, * P<0.05, * * P<0.01

2.2.4 O efeito de C80 no conteúdo de MDA, GSH-Px e SOD no tecido cerebral.

No tecido cerebral, houve diferenças estatisticamente significativas em MDA, GSG-Px e SOD (P<0.01). In brain tissue, compared with the model group, the activity of SOD and GSH-Px enzymes in the blank group increased, while the level of MDA decreased, with significant differences (P<0.01), indicating the successful construction of the anti-aging model in mice. Compared with the model group, the activity of SOD and GSH-Px enzymes in the brain homogenate of each treatment group increased, while the level of MDA decreased, with significant differences (P<0.01). Comparison between each administration group, model group, and the positive group showed significant differences between the model group and the positive group, while there was no difference between the high-dose group, low-dose group, and positive group. This indicates that C80 and vitamin E have similar therapeutic effects, both have good antioxidant activity and can pass the blood-brain barrier. See Table 4.

Tabela 4 O efeito de C80 no conteúdo de MDA, GSH-Px e SOD no tecido cerebral

Nota: Em comparação com o grupo modelo, * P<0.05, * * P<0.01

3 Discussão

Os polissacarídeos vegetais têm atraído grande atenção devido à sua universal e excelente atividade imunológica e relativamente baixa toxicidade. Métodos tradicionais de extração de água e precipitação de álcool têm sido usados ​​para obter polissacarídeos de Cistanche deserticola, que, como compostos macromoleculares, têm baixa biodisponibilidade após administração oral [20]. Ao contrário do método tradicional de extração de água e precipitação de álcool, este experimento usou uma combinação de enzimas compostas e um método físico de quebra de cadeia ultrassônica para extrair polissacarídeos de Cistanche deserticola e, em seguida, usou precipitação graduada de álcool para obter três tipos de polissacarídeos: C30, C50 e C80. Devido à extração ultrassônica, as cadeias ultralongas de polissacarídeos foram quebradas e transformadas em polissacarídeos de cadeia curta, de modo que o C80 atravessou facilmente a barreira hematoencefálica de camundongos, o que pode desempenhar suas vantagens.

Chá Cistanche - Antioxidante

Neste estudo, experimentos antioxidantes in vitro foram conduzidos para rastrear a atividade antioxidante de três polissacarídeos de Cistanche deserticola usando quatro métodos experimentais: radical livre DPPH, radical livre hidroxila, método de redução de ferricianeto de potássio e método de redução de nitrito. Os três polissacarídeos mostraram efeitos significativos sobre o radical livre DPPH e o radical livre hidroxila, com o polissacarídeo Cistanche deserticola C80 apresentando o melhor desempenho, seguido pelo C50. De acordo com os resultados do experimento antioxidante in vitro, C80 foi selecionado para construir o modelo de estresse oxidativo de camundongos D-neneneba galactose. Os tecidos de sangue, fígado e cérebro dos camundongos foram coletados e os conteúdos de MDA, GPH Px e SOD foram detectados. Os resultados mostraram que C80 teve uma função de reparo nos camundongos feridos por estresse oxidativo e teve melhor atividade antioxidante in vivo.

Este experimento combina métodos químicos in vitro com experimentos in vivo em animais e avalia a atividade antioxidante de polissacarídeos Cistanche deserticola obtidos por enzima composta combinada com método de ultrassom usando múltiplos indicadores. Os resultados mostram que o C80 obtido por este processo possui boa atividade antioxidante. A enzima composta combinada com o método de ultrassom apresenta vantagens como processo simples, operação rápida e baixo consumo de energia, além de apresentar boas perspectivas de aplicação na extração de ingredientes eficazes de plantas naturais.

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