A atividade do complemento é regulada na glomerulopatia C3 por proteínas de fusão IgG-fator H com e sem domínios de direcionamento de properdina

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Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² e Matthew C. Pickering

'Centro de Doenças Inflamatórias, Imperial College London, Reino Unido; e²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, EUA

C3 glomerulopatiaé caracterizada pelo acúmulo de complemento C3 nos glomérulos. As causas incluem, mas não estão limitadas a, anormalidades no fator H, o principal regulador negativo da via alternativa do complemento. Camundongos deficientes em fator H (Cfh-/-) desenvolvem C3glomerulopatiajuntamente com uma redução nos níveis plasmáticos de C3. Usando este modelo, avaliamos a eficácia de duas proteínas de fusão contendo os domínios reguladores da via alternativa do fator H (FH1-5)

ligado a uma imunoglobulina de camundongo não direcionada (IgG-FH1-5) ou a um anticorpo anti-propedina de camundongo (Anti-P-FH1-5). Ambas as proteínas aumentaram o C3 plasmático e reduziram a deposição glomerular de C3 em uma extensão equivalente, sugerindo que o direcionamento de properdina não foi necessário para que o FH{10}} alterasse a ativação do C3 no plasma ou nos glomérulos. Após a administração de IgG-FH1-5, os níveis plasmáticos de C3 correlacionaram-se temporalmente com alterações nos níveis de fator B, enquanto os níveis plasmáticos de C5 correlacionaram-se com alterações nos níveis plasmáticos de properdina. Notavelmente, os aumentos no plasma

Os níveis de C5 e properdina persistiram por mais tempo do que os aumentos em C3 e fator B. Em camundongos Cfh-/- IgG-FH1-5 reduziu a lesão renal durante a nefrite nefrotóxica sérica acelerada. Assim, nossos dados demonstram que IgG-FH1-5 restaurou a atividade da via alternativa circulante e reduziu a deposição glomerular de C3 em camundongos Cfh-/- e que os níveis plasmáticos de properdina são um marcador sensível da atividade da C5 convertase na deficiência do fator H. A proteína FH{12}} conjugada com imunoglobulina, por meio de sua meia-vida plasmática comparativamente longa, pode ser uma terapia potencial para C3glomerulopatia.

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Declaração de tradução

C3 glomerulopatia(C3G) é uma doença renal caracterizada pelo acúmulo anormal de complemento C3 dentro dos glomérulos e dano glomerular. É devido à ativação descontrolada da via alternativa do complemento. Proteínas de fusão, compostas por domínios funcionais do regulador da via alternativa, fator H (FH), ligados a um anticorpo, restabeleceram a regulação do complemento e reduziram o C3 glomerular em um modelo de camundongo C3G. A conjugação de anticorpo não direcionado resultou em uma meia-vida de plasma de proteína de fusão comparativamente longa, e este, ou métodos de conjugação semelhantes, podem ser usados ​​para aumentar a função de FH na terapia de C3G.

C3 glomerulopatia(C3G) é um distúrbio renal mediado pelo complemento caracterizado por quantidades anormais de C3 nos glomérulos.1 Pode progredir para insuficiência renal e não tem tratamento definitivo.2 O C3G está associado à ativação anormal da via alternativa do complemento (PA). A ativação de AP resulta na produção de C3bBb (C3 convertase), uma enzima que cliva C3. Após a adição de outra molécula C3b, o complexo C3bBbC3b resultante (C5 convertase) pode clivar o complemento C5. Descontrolado

A ativação de AP em C3G pode estar associada a uma redução de C3, C5, fator B (FB) e properdina circulantes. As causas da ativação descontrolada de AP incluem alterações de perda de função nos reguladores do complemento e ganho de alterações de função nos ativadores do complemento.2 O principal regulador negativo de AP é o fator H (FH), e a deficiência de FH em humanos, porcos e camundongos está associada ao C3G. 3 O fator nefrítico C3, um anticorpo que estabiliza a AP C3 convertase é frequente em C3G.4 O fator nefrítico C3 pode resultar em uma redução em C3 sozinho (fator nefrítico C3 independente de properdina) ou redução em ambos C3 e C5 (fator nefrítico properdina) fator nefrítico C3 dependente).5,6

Embora a deficiência de properdina não tenha melhorado os níveis plasmáticos de C3, os níveis de C5 aumentaram, sugerindo que a properdina era necessária para a atividade da C5, mas não da C3 convertase.8,9

A administração de camundongo10 ou FH11,12 humano a camundongos Cfh–/– reduziu a coloração glomerular de C3 e aumentou os níveis circulantes de C3. Construções que contêm apenas os domínios reguladores e de direcionamento de FH (moléculas mini-FH) também são eficazes nesse modelo.13 Outras abordagens incluem proteínas que têm como alvo os locais de ativação do complemento. Estes incluem TT30,14 uma proteína contendo os domínios reguladores do complemento de FH (FH1-5) ligados aos domínios de ligação ao complemento do receptor 2 do complemento, e moléculas FH homodiméricas,15 moléculas mini-FH que contêm domínios de ligação ao complemento da proteína 1 relacionada ao fator H.

Como a utilidade terapêutica de inibir a ativação do complemento C3 está sob investigação em C3G,2 é importante entender a cinética da deposição glomerular de C3 e sua relação com a ativação de AP tanto nos glomérulos quanto na circulação. Em modelos de glomerulonefrite mediada por imunocomplexos, o C3c glomerular foi eliminado em 24 horas após a prevenção da ativação do complemento, enquanto o C3d glomerular persistiu por semanas. , enquanto o C3d glomerular permanece inalterado.11

Neste estudo, investigamos a eficácia de 2 novas proteínas de fusão com atividade reguladora do complemento no modelo de camundongo Cfh–/– de C3G. As proteínas continham os domínios reguladores de FH de camundongo (FH1-5), que foi conjugado com Ig de camundongo para prolongar a meia-vida biológica. Uma das proteínas de fusão, denominada IgG-FH1-5, foi conjugada com um anticorpo monoclonal de camundongo não direcionado. O outro, denominado anti-P-FH1-5, foi conjugado com um anticorpo monoclonal para a properdina de camundongo. Isso foi feito para testar a hipótese de que direcionar essa proteína de fusão para locais de ativação do complemento, interagindo com a deposição de properdina, aumentaria a regulação do complemento tecidual. Nossos dados demonstram que tanto as proteínas não direcionadas (IgG-FH1-5) quanto as proteínas direcionadas a properdina (anti-P-FH1-5) restauraram a regulação do plasma e C3 glomerular em camundongos Cfh–/–. Estudos ao longo do tempo mostraram que a restauração dos níveis de C3 e FB espelhava os níveis das proteínas de fusão na circulação. Em contraste, os aumentos no C5 plasmático persistiram após as proteínas de fusão terem sido eliminadas da circulação. Mostramos que IgG-FH1-5 melhorou a lesão glomerular durante nefrite nefrotóxica sérica acelerada em camundongos Cfh–/–.

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RESULTADOS

Geração de proteínas de fusão e avaliação in vitro e in vivo da atividade As proteínas de fusão foram criadas ligando os primeiros 5 domínios de repetição curta de consenso (SCR) de FH de camundongo (FH1-5) a um anticorpo anti-propina de camundongo (anti -P-FH1-5) ou um anticorpo com um domínio Ig não direcionado (IgG-FH1- 5, Figura Complementar S1). A atividade das proteínas foi avaliada usando um ensaio hemolítico específico para AP (Figura 1a). Anti-P-FH1-5 e IgG-FH1-5 inibiram a hemólise de maneira dose-dependente com maior potência para anti-P-FH1-5. A antiproperdina (anti-P) também reduziu a hemólise de forma dose-dependente, mas o controle IgG não teve efeito. Após injeções equimolares das proteínas em camundongos Cfh–/–, a proteína IgG-FH1-5 foi detectável até 11 dias após a injeção, enquanto o anti-P-FH1-5 foi detectável até 4 dias após injeção (Figura complementar S2). Para determinar se IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5 poderiam restaurar a regulação de AP no plasma em camundongos Cfh–/–, primeiro medimos os níveis plasmáticos de C3 após a injeção das proteínas de fusão (Figura 1b) . A administração de IgG-FH1-5 ou anti-P-FH1-5 aumentou significativamente a C3 plasmática em 24 horas e, em menor grau, em 96 horas após a injeção (Figura 1b). Esses dados demonstraram que tanto IgG-FH1-5 quanto anti-P-FH1-5 poderiam restaurar temporariamente a regulação de AP no plasma em camundongos Cfh–/–. Em seguida, realizamos uma análise detalhada dessas alterações, caracterizando o curso temporal das alterações não apenas no C3 plasmático, mas também no C5 plasmático e nas proteínas da via alternativa FB e properdina. Os aumentos nos níveis circulantes de C5 e properdina persistem por mais tempo do que os aumentos em C3 e FB após a administração de IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5 em camundongos Cfh–/–

Comparamos a cinética das alterações em C3, C5, FB e properdina medindo proteínas em intervalos de até 27 dias após uma única injeção de IgG-FH1-5 ou anti-P-FH1-5 ( Figura 2). Após a administração de IgG-FH1-5, o pico de aumento em C3, C5, FB e properdina ocorreu no dia 1 pós-injeção. O tempo para essas mudanças caírem aos níveis pré-tratamento foi diferente. O retorno aos níveis de pré-tratamento ocorreu entre os dias 1 e 4 para FB, entre os dias 7 e 11 para C3 e entre os dias 14 e 21 para properdina e C5 (Figura 2a, c, e e g). Após a administração de anti-P-FH1-5, os níveis de pico de C3 ocorreram no dia 1, mas caíram para os níveis de pré-tratamento entre os dias 4 e 7 (Figura 2b). Os níveis de pico de C5 ocorreram no dia 4 e retornaram aos níveis de pré-tratamento entre os dias 7 e 11 dias (Figura 2d). O pico de aumento no FB ocorreu no dia 1 e caiu para os níveis de pré-tratamento entre os dias 1 e 4 (Figura 2f). Como esperado, a properdina do plasma livre foi esgotada após a injeção de anti-P-FH1-5 ou anti-P (Figura 2h). Os níveis plasmáticos de properdina livre permaneceram baixos por até 7 dias após anti-P-FH1-5 e até 14 dias após anti-P (Figura 2h). Embora ambas as proteínas de fusão tenham restaurado temporariamente a regulação do AP no plasma, a duração da melhora nos níveis de C3, FB e C5 refletiu a duração de sua detecção no plasma, que foi menor para anti-P-FH1-5 (Figura S2 complementar) . Em resumo, as alterações nos níveis de C3 e FB após a injeção de qualquer proteína foram menores do que as de C5 e properdina. Esses dados sugerem que o FB no plasma é um marcador sensível da atividade da convertase C3 nesse cenário, enquanto a properdina é um marcador da atividade da convertase C5. Notavelmente, após a injeção de anti-P, houve um aumento de C5 em 24 e 96 horas e no dia 7

Figura 1| (a) Complementar o ensaio de hemólise dependente de via alternativa. Os anticorpos foram titulados em diluições de 2-vezes de 60 nM até 0,5 nM. Os reagentes IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 e anti-P reduziram a hemólise de eritrócitos de coelho de maneira dose-dependente. Não foi utilizada inibição da proteína IgG-controle. As barras horizontais denotam valores médios e as barras de erro representam SD. (b) Complemento plasmático C3 em camundongos Cfh–/– após injeção de proteínas de fusão. O plasma C3 foi medido antes e 24 horas e 96 horas após a administração de IgG-FH1-5 (triângulos vermelhos, n ¼ 5) Anti–P–FH1-5 (triângulos roxos, n ¼ 6), Anti -P (pontos verdes, n=5) e IgG-controle (pontos azuis, n=5). As barras horizontais denotam valores médios e os bigodes denotam SD. ***P # 0,001 versus valor de pré-tratamento e derivado de 2-way ANOVA com teste de comparações múltiplas de Bonferroni. FH, fator H; P, propriedade.

(Figura 2d). Conforme relatado,8,9 indica que a C5 convertase é dependente de properdina em camundongos Cfh–/–.

IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5 reduziram C3c glomerular, mas não alteraram a coloração de C3d em camundongos Cfh–/–

Em seguida, avaliamos a influência de IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5 nas proteínas glomerulares C3b/iC3b/C3c, C3d, properdina e FH-relacionadas (FHR). Às 96 horas após a injeção de IgG-FH1-5, a coloração glomerular C3b/iC3b/C3c foi reduzida, mas a coloração glomerular C3d (Figura 3a) e FHR (Figura 3b) não foi. O C3b/iC3b/C3c glomerular permaneceu inalterado com IgG-controle ou anti-P. O padrão linear anormal de coloração de properdina glomerular em camundongos Cfh–/– não tratados9 permaneceu 96 horas após o controle de IgG. Em camundongos Cfh–/– injetados com anti-P ou IgG-FH1-5, o nível glomerular de properdina era quase indetectável em 96 horas (Figura 3b). Inesperadamente, a injeção de anti-P-FH1-5 resultou em um padrão de coloração glomerular granular usando anticorpos anti-properdina, anti-FH/FHR e anti-IgG (Figura 3b). Esse achado sugeriu que a proteína anti-P-FH1-5 estava sendo depositada nos glomérulos. A injeção de proteína anti-P-FH1-5 em camundongos de tipo selvagem resultou em coloração glomerular com anticorpos anti-properdina, anti-FH/FHR e anti-IgG em 96 horas (Figura complementar S3), indicando que isso reagente interage com glomérulos normais. No entanto, especulamos que a proteína anti-P-FH1-5 também poderia interagir com a properdina glomerular pré-existente em camundongos Cfh–/–. Quando injetamos o reagente em camundongos Cfh–/– que foram pré-tratados com anti-P para remover a properdina glomerular, houve uma redução nos padrões de coloração granular usando anticorpos antiproperdina, anti-FH/FHR e anti-IgG. Figura suplementar S4). Essas observações indicam que a interação glomerular da proteína anti-P-FH1-5 em camundongos Cfh–/– é parcialmente dependente da properdina glomerular.

IgG-FH1-5 melhorou a lesão renal durante nefrite nefrotóxica sérica acelerada em camundongos Cfh–/–

Em pacientes com C3G, a lesão renal aguda pode se desenvolver no contexto de infecções intercorrentes. Por exemplo, a perda da função renal na nefropatia FHR5 está associada a episódios de hematúria macroscópica sinfaringítica.17 A desregulação C3 subjacente em pacientes C3G provavelmente resulta em lesão renal mediada pelo complemento aumentada após um gatilho que resulta em inflamação renal. Para modelar isso, induzimos nefrite nefrotóxica sérica acelerada, um complexo imunológico

Figura 2| Evolução do tempo do perfil do complemento plasmático em camundongos Cfh–/– injetados com IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5. Plasma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) e properdina (P; g,h) desde o início experimental até 27 dias após injeção única de IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; triângulos vermelhos, n ¼ 5) ou anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; triângulos roxos, n ¼ 6). Os controles incluíram anti-P (pontos verdes, n=5) e um anticorpo monoclonal com isotipo correspondente (controle IgG; pontos azuis, n=5). As barras horizontais denotam valores médios e os bigodes denotam SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 versus valor de pré-tratamento e derivado de 2-análise de variância de vias com teste de comparações múltiplas de Bonferroni. FB, fator B; FH, fator H.

modelo de glomerulonefrite que envolve as vias mediadas pelo complemento e pelo receptor Fc,18,19 nos camundongos Cfh–/–. Anteriormente, mostramos que camundongos Cfh–/– são hipersensíveis à lesão renal nesse cenário7 e levantamos a hipótese de que a proteína FH1-5, aumentando a regulação AP, poderia melhorar a lesão renal mediada pelo complemento neste modelo. Como nossos dados indicaram que a proteína anti-P-FH1-5 foi depositada em glomérulos normais, usamos IgG-FH1-5 durante a nefrite nefrotóxica sérica acelerada. Vinte e quatro horas antes da injeção de soro nefrotóxico de ovelha, os camundongos receberam uma injeção ip de IgG-controle (n ¼ 7) ou IgG-FH1-5 (n ¼ 8). O protocolo experimental está representado na Figura 4a. Os camundongos foram abatidos 6 dias após a administração de soro nefrotóxico de ovelha. Todas as 3 medidas histológicas de patologia glomerular (escore de gravidade, número total de células e número de macrófagos) foram significativamente menores no grupo IgG-FH1-5 (Figura 4b). A lesão tubulointersticial também foi menor no grupo IgG-FH1-5 (Figura 4b). A uréia sérica foi significativamente elevada em

Figura 3| Imunocoloração do complemento glomerular em camundongos Cfh–/– 96 horas após a injeção de IgG-FH1-5 ou anti-P-FH1-5. (a) Imagens representativas juntamente com quantificação de C3b/iC3b/C3c glomerular e C3d nos 4 grupos experimentais: IgG-FH1-5 (triângulos vermelhos, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (triângulos roxos, n ¼ 6), anti-P (pontos verdes, n ¼ 5) e controle IgG (pontos azuis, n ¼ 5). Os níveis plasmáticos de C3 estavam no momento das lentes mostradas na Figura 1. (b) Os pontos de dados representam valores medianos e os bigodes denotam um intervalo interquartil. Valores de p derivados do teste de Kruskal-Wallis com teste de comparações múltiplas de Dunn. (b) Imagens representativas de IgG glomerular, FCF e coloração nos 4 grupos experimentais. Barra ¼ 100 mm. AFU, unidades fluorescentes arbitrárias; FH, fator H; P, propriedade. Para otimizar a visualização desta imagem, consulte a versão online deste artigo emwww.kidney-international.org.

o grupo IgG-controle, mas as alterações na albumina sérica e na relação albumina-creatinina na urina não diferiram (Figura 4b). Como esperado, C3b/iC3b/C3c glomerular foi significativamente reduzido no grupo IgG-FH1-5 (Figura 4b), mas IgG de camundongo glomerular (Figura 4b) e IgG de ovelha (dados não mostrados) não diferiram entre os grupos .

Figura 4| O pré-tratamento com IgG-FH1-5 melhorou a lesão renal durante a nefrite nefrotóxica sérica acelerada em camundongos Cfh–/–. (a) Esquema do protocolo de nefrite nefrotóxica sérica acelerada. Os camundongos pré-imunizados com IgG de ovelha receberam IgG-FH1-5 (grupo de tratamento, n ¼ 8) ou IgG-controle (grupo controle, n ¼ 7) 24 horas antes da administração do soro nefrotóxico de ovelha. (b) Função renal e histologia 6 dias após a indução de nefrite nefrotóxica sérica acelerada em camundongos tratados com IgG-FH1-5 (tratamento; triângulos vermelhos, n=8) ou controle de IgG (controle; círculos azuis, n ¼ 7). As barras horizontais denotam valores medianos e os bigodes denotam um intervalo interquartil. *P # 0.05, **P # 0.01, ***P # 0,001 versus controle e derivado do teste de Mann-Whitney. FH, fator H; P, propriedade.

DISCUSSÃO

Ambos IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5 normalizaram os níveis de C3, FB e C5 em camundongos Cfh–/–. Essa descoberta é consistente com o fato de que os domínios reguladores do complemento de FH de camundongo estão localizados dentro dos domínios SCR 1 a 5 (um sítio de ligação a C3b e a atividade do cofator para a clivagem mediada pelo fator I de C3b).20 Domínios de reconhecimento de superfície, que influenciam a ligação à heparina e células endoteliais e incluem um segundo sítio de ligação C3b, estão presentes nos domínios SCR 18 a

20 (FH18-20) e, portanto, não estão presentes nas proteínas de fusão.20 No entanto, ambas as proteínas reduziram o iC3b/C3b/C3c glomerular, indicando que o FH18-20 não foi necessário nesse cenário. Esta descoberta é consistente com dados anteriores mostrando que camundongos Cfh–/– expressando uma proteína FH mutante consistindo em domínios SCR 1 a 15 (Cfh–/– .FHD16-20) não desenvolveram deposição glomerular anormal de C3.21,22 No entanto, os animais Cfh–/–.FH D16-20 foram incapazes de regular a ativação de C3 ao longo do endotélio renal e desenvolveram microangiopatia trombótica. É possível que, devido à falta de domínios FH18-20 direcionados à superfície, a administração de proteínas de fusão contendo FH1-5 na deficiência de FH possa resultar em suscetibilidade à microangiopatia trombótica. Também é possível que o aumento da avidez pela ligação de C3b, sob a estrutura dimérica das proteínas de fusão, seja suficiente para compensar a ausência dos domínios FH{18}} direcionados à superfície. No entanto, o reconhecimento de superfície de C3b também é influenciado por alterações conformacionais em FH.23 Uma proteína de ligação a FH de Streptococcus pneumoniae (PspCN, que se liga ao domínio SCR 9), desencadeia uma mudança conformacional de FH, e o complexo FH-PspCN aumentou a ligação de C3b e maior atividade aceleradora de decaimento. O sítio de ligação FH20 C3d não é exposto em FH, mas fica exposto no complexo FH-PspCN. Isso pode explicar por que FH19-20 interage com a superfície C3d, mas FH não.24,25 Especulamos que nossos agentes, por meio de mudanças conformacionais, podem interagir eficientemente tanto com a fase fluida quanto com a superfície C3b. Notavelmente, tanto IgG-FH1-5 quanto anti-P-FH1-5 protegeram eritrócitos da lise em um ensaio de hemólise dependente de AP.

Nenhuma das proteínas de fusão reduziu a coloração glomerular de C3d, talvez devido à natureza persistente de C3d glomerular. Na nefrite por imunocomplexos experimental, o C3c glomerular foi resolvido dentro de 24 horas após a interrupção da ativação do complemento, mas o C3d persistiu por semanas.16 Além disso, o C3d glomerular é persistente na nefrite lúpica.26 Isso provavelmente reflete sua interação covalente com as superfícies glomerulares. Injeções repetidas de FH humano em camundongos Cfh–/– mostraram uma redução no C3d glomerular ao longo de 10 dias.11 É provável que a dosagem repetida de IgG-FH1-5 possa reduzir o C3d glomerular neste modelo. Também não houve alteração na coloração da FCF glomerular. Pouco se sabe sobre as funções das proteínas FHR de camundongo, mas elas podem interagir com C3b27,28 e C3d.27 Na verdade, a afinidade aparente de FHR-A e FHR-B para C3d é mais forte do que a de FH.27 Especulamos que as proteínas glomerulares da FHR provavelmente serão eliminadas dos glomérulos apenas quando o C3d for removido. Nesse contexto, é notável que no C3G humano, a proteína 5 relacionada ao fator H se associa ao C3d glomerular.29

A proteína anti-P-FH1-5 depletou os níveis plasmáticos de properdina livre como esperado porque a parte anti-properdina dessa proteína de fusão pode bloquear a atividade de AP (devido à depleção de properdina) por 8 dias após uma única injeção.30 No entanto, nossos dados mostraram que a eficácia de FH1-5 em aumentar os níveis plasmáticos de C3 e reduzir a coloração glomerular de C3b/iC3b/C3c foi comparável entre as 2 proteínas de fusão (ou seja, foi independente do direcionamento de properdina). Além disso, a coloração de properdina glomerular anormal foi significativamente reduzida após a administração de anti-P ou IgG-FH1-5. Evidentemente, em contraste com as proteínas C3d e FHR, a properdina glomerular é prontamente eliminada após a restauração da regulação C3. A properdina glomerular mudou de padrão após a administração da proteína anti-P-FH1-5, mas isso foi complicado pela observação de que detectamos a deposição dessa proteína de fusão em ambos os glomérulos Cfh–/– e do tipo selvagem. Isto foi parcialmente devido a uma interação com a properdina glomerular, mas a deposição em glomérulos de tipo selvagem indicou que também era em parte totalmente independente do complemento glomerular e provavelmente relacionada às propriedades físico-químicas da proteína de fusão.

Nossos dados cinéticos demonstraram novos achados sobre as mudanças temporais em FB, C5 e properdina que acompanham aumentos em C3 em camundongos Cfh–/– após a injeção das proteínas de fusão. Os níveis de FB aumentaram rapidamente após a injeção

e retornou aos níveis basais em um momento em que os níveis de C5 e properdina permaneceram elevados. Os níveis de properdina em camundongos Cfh–/– foram reduzidos na linha de base e aumentados para níveis normais (20 mg/ml30) após a injeção de IgG-FH1-5 e permaneceram nesses níveis por pelo menos 14 dias. Um curso de tempo semelhante foi observado para o aumento dos níveis plasmáticos de C5. Surpreendentemente, IgG-FH1-5 estava ausente da circulação em 11 dias, indicando que a formação da C5 convertase em camundongos Cfh–/– é mais lenta do que a da C3 convertase (porque os níveis de C3 retornaram à linha de base entre 7 e 11 dias). Plasma C5 aumentou após o tratamento anti-P e aumentou ainda mais com a proteína anti-P-FH1-5. Assim, tanto o direcionamento de properdina quanto os efeitos de FH{20}} estavam contribuindo para o aumento dos níveis de C5 e indicam que a convertase C5 é parcialmente dependente de properdina em camundongos Cfh–/–. Esta descoberta é consistente com a melhora da desregulação de C5 em camundongos com deficiência combinada de FH e properdina.8,9 Os níveis circulantes de properdina podem ser reduzidos em C3G e parecem se correlacionar com a atividade da convertase C5 de superfície em contraste com C5 plasmático ou C5b solúvel{ {30}}.31,32 Nossos dados suportam uma ligação íntima entre os níveis de properdina e a atividade da convertase C5 e apoiam o uso dos níveis de properdina como um biomarcador da ativação glomerular C5 em andamento.

Notavelmente, a proteína IgG-FH1-5 ainda era detectável na circulação até 11 dias após uma única injeção. Isso é muito mais longo do que o relatado anteriormente para a proteína FH1-5 de camundongo não conjugada, que foi removida da circulação em 24 horas.14 Esse achado indica que a meia-vida plasmática mais longa da IgG-FH{ {9}} proteína é derivada da conjugação do anticorpo. A meia-vida plasmática da proteína IgG-FH1-5 também foi maior do que o observado anteriormente para HF de comprimento total.10,11 Por exemplo, a HF humana foi removida da circulação em 96 horas após uma única injeção em camundongos Cfh–/–.11 Combinado com nossos dados que demonstram a eficácia da proteína IgG-FH1-5 na regulação do complemento, consideramos que a conjugação da proteína FH1-5 para prolongar seu perfil farmacocinético tem potencial terapêutico utilitário em C3G.

Em resumo, mostramos que, apesar de não possuírem domínios de reconhecimento de superfície, as proteínas de fusão FH1-5 foram eficazes em reduzir a ativação glomerular de C3 e restaurar a regulação do complemento plasmático na deficiência de FH. Não houve vantagem óbvia na conjugação dos domínios FH1-5 à antipropriedade, e a proteína IgG-FH1-5 reduziu a lesão renal na nefrite experimental. Em contraste com os desafios na produção de preparações de FH em larga escala para uso terapêutico, a produção em larga escala de terapias baseadas em anticorpos está bem estabelecida, o que torna o IgG-FH{10}} um potencial terapêutico atraente para C3G.

MÉTODOS

Proteínas de fusão

IgG-FH1-5. Os primeiros 5 domínios FH SCR de camundongo (mFH1-5) ligados

a uma Ig de camundongo IgG1 não direcionada (um anticorpo anti-idiotípico criado contra um anticorpo monoclonal de camundongo).

Anti-P-FH1-5. FH murino1-5 ligado ao anticorpo anti-properdina de camundongo (anti-P),30 fornecido a Alexion por W. Song, Universidade da Pensilvânia).

Controles. Os controles foram Ig de camundongo sem direcionamento compatível com isotipo (controle de IgG) e anti-properdina de camundongo (anti-P) (Figura S1 complementar). As proteínas foram geradas usando vetores pVEK e células Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), purificadas usando proteína A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

Ensaio hemolítico específico de AP

Vinte por cento de soro de camundongo normal titulado de 60 nM a 0,5 nM foi incubado com eritrócitos de coelho (1.5 106 células/ml) a 37°C por 30 minutos. A liberação de heme foi quantificada espectrofotometricamente (densidade óptica 415 nm); 100 por cento de lise era soro sem inibidor.

Plasma FB e FH

O plasma foi obtido após centrifugação do sangue coletado em tubos contendo ácido etilenodiamino tetraacético (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Alemanha). As proteínas foram medidas por imunoensaio de eletroforese capilar (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Os anticorpos utilizados foram anticorpo policlonal anti-FH de camundongo (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) e anticorpo anti-FH de camundongo (Abcam, Cambridge, Reino Unido); O módulo de detecção anti-coelho WES (ProteinSimple, San Jose, CA) foi usado. Os sinais quimioluminescentes foram analisados ​​com o software Compass for SW (ProteinSimple, versão 5.0.1), quantificados como áreas de pico e normalizados para o controle do ensaio.

Ratos

Todos os camundongos foram alojados em condições específicas livres de patógenos; os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo United Kingdom Home Office. Camundongos C57BL/6 de tipo selvagem foram adquiridos do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), e camundongos Cfh–/– foram gerados conforme descrito anteriormente.7 Os camundongos foram pareados por idade e sexo; doses equimolares de proteínas foram administradas via injeção ip (1 mg para anti-properdina e IgG-controle; 1,4 mg para IgG-FH1-5 e anti-P-FH1-5). A nefrite nefrotóxica sérica acelerada foi induzida por injeção iv de soro nefrotóxico de ovelha em camundongos pré-imunizados com IgG de ovelha.7 A administração das proteínas de fusão foi realizada 24 horas antes da indução de soro nefrotóxico de ovelha (Figura 4a).

C3, C5 e properdina livre O plasma C3 foi medido por ensaio imunoenzimático.14 Os níveis plasmáticos de properdina e C5 "livres" foram medidos usando imunoensaios de eletroquimioluminescência (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) com anti - properdina ou um C5 anti-murino personalizado revestido em placas MSD de alta ligação. A properdina "livre" ligada e C5 foram detectadas com anti-properdina (de W. Song) ou anti-C5 monoclonal biotinilado (Alexion) combinado com estreptavidina-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). O sinal quimioluminescente foi adquirido usando um imager SECTOR S 6000 (MSD, Meso Scale Diagnostics) e foi analisado com o software MSD Discovery Workbench (Meso Scale

Diagnóstico, versão 4.0.12.1). A properdina murina recombinante e C5 foram usados ​​como padrões.

Função renal e histologia

Hematúria e proteinúria foram avaliadas usando Hema-Combistix (Bayer, Reading, Reino Unido); a ureia plasmática foi medida e o tecido renal processado conforme descrito anteriormente.9 A creatinina urinária foi determinada em amostras de urina spot usando o ensaio Creatiine Companion Protocol (#1012; Excell, Philadelphia, PA) e urina spot/ a albumina plasmática foi medida por ensaio imunoenzimático (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Secções renais coradas com ácido periódico de Schiff foram avaliadas de forma cega e classificadas de acordo com a gravidade da lesão glomerular e tubulointersticial (0 [nenhuma], 1 [leve], 2 [moderada]). Dez glomérulos por seção foram avaliados para determinar o número médio de células glomerulares. A coloração por imunofluorescência foi realizada em criossecções de 5-mm montadas usando meio Vectashield com DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Os anticorpos usados ​​foram C3b/C3c/iC3b de cabra policlonal conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; IgG anti-camundongo policlonal de cabra conjugado com FITC específico para cadeia de figo (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); IgG monoclonal de camundongo anti-cabra/ovelha conjugada com FITC (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); ou anti-propedina humana de cabra conjugada com FITC (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immunologic Laboratories, Copenhagen, Dinamarca).9 Anti-camundongo C3d de cabra biotinilado (1:10; # BAF2655; R&D Systems , Minneapolis, MN) foi usado em seções bloqueadas por biotina (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA), com anticorpo secundário de estreptavidina AF488 (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). A FH foi visualizada em seções bloqueadas de CD16/CD{52}}anti-rato de rato purificadas (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) usando FH anti-humano de cabra (1:1000; #A312; Quidel, San Diego , CA) e anticorpo secundário monoclonal anti-cabra IgG-FITC (1:100; clone GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Macrófagos glomerulares foram identificados usando CD68 de rato anti-rato conjugado com FITC (FA-11 clone GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). A análise de imunofluorescência quantitativa foi realizada usando um microscópio óptico Leica DM4B acoplado à câmera digital Leica DFC700T (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) e software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, versão 7). Dez glomérulos foram examinados por seção, e a intensidade média foi expressa em unidades arbitrárias de fluoresciências.

Análise estatística

GraphPad Prism, versão 8.0 (GraphPad, San Diego, CA) foi usado para análise estatística. A análise de variância de medidas repetidas 2-way com o teste de comparações múltiplas de Bonferroni (os fatores foram tempo e tratamento) foi usada para a análise de curso de tempo. O teste de comparações múltiplas de Kruskal-Wallis com Dunn foi usado ao comparar vários grupos, e o teste de Mann-Whitney foi usado para 2 grupos.

DIVULGAÇÃO

A MCP recebeu honorários de consultoria da Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope e Achillion Pharmaceuticals. A HTC recebeu honorários de consultoria da Alexion, Novartis, Aurinia e Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ e SK-K são funcionários da Alexion Pharmaceuticals. SK é um ex-funcionário da Alexion Pharmaceuticals e atualmente é empregado da Gemini Pharmaceuticals. Todos os outros autores declararam não haver interesses conflitantes.

AGRADECIMENTOS

MCP é um membro sênior do Wellcome Trust em Ciências Clínicas (referência de concessão 212252/Z/18/Z), e ACG e DPL são apoiados por esta bolsa. YZ, SK, YW, KKJ e SK-K foram financiados pela Alexion Pharmaceuticals.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Arquivo Complementar (PDF)

Figura S1. As proteínas de fusão usadas neste estudo. IgG-FH1-5 contém os primeiros 5 domínios do fator H de camundongo (FH1-5) ligado a uma Ig de camundongo não direcionada. Anti-P-FH1-5 consiste em mFH1-5 ligado a um anticorpo neutralizante anti-ratinho properdina (anti-P; ver Miwa et al.30). As proteínas de controle incluíram uma Ig de camundongo sem direcionamento de isotipo (controle de IgG) e o anticorpo neutralizante de camundongo anti-propriedade de camundongo (Anti-P). Figura S2. Análise de mancha WES para detectar FH1-5 em amostras de plasma de camundongos deficientes em FH injetados com (A) IgG-FH1-5 ou (B) Anti-P-FH1-5. O 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5) é detectável até 11 dias após a injeção de IgG-FH1-5 e até 4 dias após a injeção da proteína anti-P-FH1-5 (caixas vermelhas ). Os controles incluíram plasma de camundongos do tipo selvagem onde a proteína do fator H de comprimento total é detectada (FH, caixas pretas, faixa C1) e camundongos deficientes em FH não injetados, onde não há FH evidente (caixas pretas, faixa C2). Como esperado, nem FHnorFH1-5 é detectável em amostras de plasma de camundongos injetados com Anti-P ou controle de IgG.

Figura S3. Imunocoloração do complemento glomerular 96 horas após injeção de IgG-controle ou anti-P-FH1-5 em camundongos de tipo selvagem. Imagens glomerulares representativas são mostradas (barra ¼ 100 mm).

Figura S4. O papel da properdina na deposição de anti-P-FH1-5 em glomérulos de camundongos deficientes em FH. Camundongos Cfh–/– foram injetados com controle de IgG ou anti-P (tratamento 1) seguido 24-horas mais tarde por controle de IgG ou anti-P-FH1-5 (tratamento 2). Os animais foram abatidos 120 horas após o tratamento um e foi avaliada a coloração glomerular para IgG, properdina e FH/FHR. Imagens representativas são mostradas. A injeção de anti-P reduziu marcadamente a coloração de properdina (linha 1, coluna 2), mas não a coloração de FH/FHR (permanece inalterada) ou IgG (permanece ausente). A administração de anti-P-FH1-5 24-horas após o controle de IgG resultou no aparecimento de coloração granular com anticorpos anti-IgG, anti-FH/FHR e anti-P, conforme observado após a injeção de anti-P-FH 1-5 sozinho (veja a Figura 3b). Essa coloração granular foi reduzida quando a injeção de anti-P-FH1-5 foi precedida pela injeção de anti-P, que esgota tanto o circulante (ver Figura 1h) quanto o glomerular (ver Figura 3b). A coloração glomerular com anti-IgG foi evidente apenas em camundongos injetados com anti-P-FH1-5 (linha 3, colunas 3 e 4) e foi significativamente menor em camundongos que receberam anti-P-FH1-5 precedido por anti-P. Concluímos que a deposição de anti-P-FH1-5 nos glomérulos de camundongos Cfh–/– foi parcialmente dependente da properdina. As barras horizontais denotam valores medianos e os bigodes denotam o intervalo interquartil. O valor P foi derivado do teste de Mann-Whitney. Barra ¼ 100 mm.

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