Coagulação, receptores ativados por protease e doença renal diabética: lições de camundongos com deficiência de ENOS

Óxido nítrico sintase endotelial(eNOS) é conhecida por exacerbar a progressão e o prognóstico dadoença renal diabética(DKD). Um dos mecanismos através dos quais isto é conseguido é que os baixos níveis de eNOS estão associados à hipercoagulabilidade, o que promove lesão renal. Na cascata de coagulação extrínseca, o fator tecidual (fator III) e os fatores de coagulação a jusante, como o fator X ativo (FXa), exacerbam a inflamação através da ativação dos receptores ativados por protease (PARs). Recentemente, foi demonstrado que a falta ou redução da expressão de eNOS em camundongos diabéticos, como modelo de DKD avançada, aumenta os níveis de fator tecidual renal e a expressão de PAR1 e 2 em seus rins. Além disso, a inibição farmacêutica ou a deleção genética de fatores de coagulação ou PARsinflamação melhoradaem DKD em camundongos sem eNOS. Nesta revisão, resumimos a relação entre eNOS, coagulação e PARs e propomos uma nova opção terapêutica para o manejo de pacientes com DKD.

Palavras-chave:glomeruloesclerose diabética; fator Xa;inflamação; fator tecidual

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Introdução

O número de pacientes comdoença renal diabética(DKD) está aumentando em todo o mundo (de Boer et al. 2011; Kainz et al. 2015; Ogurtsova et al. 2017). DKD é uma das principais causas de mortalidade em pacientes com complicações diabéticas (Afkarian et al. 2013). Além disso, a DKD é progressiva e é a principal causa de doença renal terminal que requer terapia renal substitutiva (Gregg et al. 2014; Liyanage et al. 2015). No Japão, a nefropatia diabética é responsável por mais de 39% dos novos pacientes em diálise (Nitta et al. 2020). Portanto, o desenvolvimento deromance terapêuticoopções são necessárias para tratar pacientes com DKD.

sistema na patogênese DKD. A hipercoagulabilidade está associada à DKD (Goldberg 2009; Domingueti et al. 2016). Foi demonstrado que um nível elevado de fibrinogênio no sangue está associado a uma baixa taxa de filtração glomerular estimada, alta proteinúria e lesão histológica grave, e foi um preditor da progressão para doença renal em estágio terminal (Dalla Vestra et al. 2005; Pan et al. al. 2018; Zhang et al. 2018). Alguns estudos mostraram uma correlação entre o nível de dímero D, um produto de degradação da fibrina, e a disfunção renal na DKD (Domingueti et al. 2018; Pan et al. 2018). A hipercoagulabilidade na DKD é provavelmente determinada por múltiplos fatores. Por exemplo, o sistema renina-angiotensina-aldosterona ativa o fator tecidual (TF, fator III) e aumenta os eventos trombóticos (Dielis et al. 2005). Caso contrário, hiperglicemia, dislipidemia, inflamação ou disfunção endotelial estão envolvidas no estado pró-trombótico na patogênese da DKD (Goldberg 2009).

A disfunção endotelial está presente na DKD que progride para complicações microvasculares (Goldberg 2009; Nakagawa et al. 2011). A produção prejudicada da sintase de óxido nítrico endotelial (eNOS) ou a atividade reduzida da eNOS (por exemplo, fosforilação da eNOS prejudicada) é uma marca registrada da disfunção endotelial na DKD (Nakagawa et al. 2011; Cheng et al. 2012). Mostramos que a perda da expressão da eNOS estava associada à elevação do nível de TF e à atividade do sistema de coagulação extrínseca (Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), que está intimamente associada a eventos trombóticos em pacientes com doença renal crônica. doenças (Kolachalama et al. 2018).

Além do risco elevado de eventos trombóticos, as proteases da coagulação, como o fator ativo FVII (FVIIa), o fator ativo (FXa) e a trombina, que estão presentes na cascata de coagulação extrínseca, medeiam a lesão tecidual através de um receptor ativado por protease. Mecanismo dependente de PAR) (Madhusudhan et al. 2016; Posma et al. 2019). Nesta revisão, resumimos os achados obtidos em camundongos diabéticos sem eNOS e discutimos a relação entre a via de coagulação-PAR, os níveis de eNOS ePatogênese da DKD.

Via de Fator Tecidual/Receptores Ativados por Protease

O fator tecidual (TF), conhecido como fator III, é uma proteína transmembrana de 47 kDa que interage com o fator VII (FVII) (Grover e Mackman 2018). O complexo TF/FVIIa é um ativador da cascata de coagulação extrínseca e catalisa a ativação de FX e FIX. O FXa e o cofator V ativado (FVa) formam um complexo pró-trombótico que gera trombina. Finalmente, a trombina converte o fibrinogênio em fibrina, resultando na formação de trombos (Grover e Mackman 2018). O TF é expresso tanto nas células musculares lisas vasculares quanto nos fibroblastos adventícios. Sob condições inflamatórias, sua expressão é induzida em células endoteliais ou células circulantes, como monócitos (Østerud e Bjørklid 2006).

Os receptores ativados por protease (PARs) são membros da superfamília de receptores acoplados à proteína G, compreendendo quatro proteínas PAR (PAR1-4). Os PARs sofrem clivagem por proteases na extremidade N-terminal e são ativados após ligação a um novo N-terminal contendo um ligante amarrado. Os quatro membros dos PARs (PAR1-4) são ativados por proteases de coagulação específicas: o complexo TF e FVIIa ativa PAR2, o fator Xa ativa PAR1 e PAR2 e a trombina ativa PAR1, PAR3 e PAR4 (Camerer et al. 2000; Coughlin 2005; Rothmeier e Ruf 2012; Zhao et al. 2014). A relação entre TF, proteases de coagulação e PARs é mostrada na Fig.

Sabe-se que os PARs são amplamente expressos nas células renais e estão envolvidos na fisiopatologia da lesão renal. Tanto o PAR1 quanto o PAR2 são expressos em células endoteliais glomerulares, células mesangiais e células tubulares renais derivadas de humanos ou camundongos; PAR2, PAR3 e PAR4 são expressos em podócitos humanos; PAR1, PAR3 e PAR4 são expressos em podócitos murinos (Tanaka et al. 2005; Vesey et al. 2005; Madhusudhan et al. 2012; Dong et al. 2015; Madhusudhan et al. 2016).

Embora os efeitos nocivos ou protetores dos PARs emlesão renalforam demonstrados, o acúmulo de dados sugere que os PARs exacerbam a inflamação ao estimular a produção de citocinas e quimiocinas (Rothmeier e Ruf 2012; Isermann 2017; Posma et al. 2019). Consistente com esse achado, os agonistas de PAR1 e PAR2 promovem a expressão de mediadores inflamatórios, como a proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP1) e o inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1), e moléculas pró-fibróticas no endotélio , células mesangiais e tubulares renais (Vesey et al. 2005; Vesey et al. 2013; Ellinghaus et al. 2016; Waasdorp et al. 2016; Oe et al. 2019). Em estudos in vivo, a falta de PAR1 ou a presença de inibidores de PAR1 reduziu a inflamação em modelos de glomerulonefrite crescente ou lesão renal obstrutiva (Cunningham et al. 2000; Waasdorp et al. 2019; Lok et al. 2020). Da mesma forma, os efeitos terapêuticos da inibição do PAR2 nas lesões renais foram acompanhados porinflamação reduzidanos rins (Hayashi et al. 2016; Du et al. 2017; Han et al. 2019; Watanabe et al. 2019).

Polimorfismos da óxido nítrico sintase endotelial em DKD

Óxido nítrico sintase endotelial(eNOS) é uma das três isoformas de NOS e contribui para a produção de NO no endotélio vascular (Walford e Loscalzo 2003). O NO produzido pela eNOS no endotélio vascular desempenha um papel crucial na regulação do relaxamento vascular, anti-inflamação e prevenção da formação de trombos (Walford e Loscalzo 2003). A expressão prejudicada da eNOS está associada ao desenvolvimento de DKD. Metanálises recentemente conduzidas em humanos revelaram que G894T (rs1799983), C-786T (rs2070744) e íntron 4b/4a ​​(rs869109213) nos genes eNOS (NOS3) estão intimamente associados ao desenvolvimento de DKD (Dellamea et al. 2014; Zhang et al. 2015; Dong et al. 2018). Destas variantes, o papel do polimorfismo G894T (Glu298Asp) na função da eNOS foi bem caracterizado. A produção reduzida de NO ou acúmulo de nitrito foi indicada em células CHO transfectadas com 298Asp em comparação com aquelas com 298Glu (Noiri et al. 2002). Coletivamente, estes resultados indicam que a produção reduzida de NO pela disfunção da eNOS é importante para a progressão da DKD em humanos.

Ratos diabéticos sem eNOS como modelo de nefropatia diabética humana

O estabelecimento de modelos pré-clínicos confiáveis ​​que se assemelhem à DKD humana é essencial para o estudo de novas opções terapêuticas. Com base nas evidências que mostram uma associação entre o polimorfismo da eNOS e a DKD, vários estudos demonstraram que os modelos knock-out da eNOS do DM tipo I e tipo II são alguns dos modelos bem-sucedidos que imitam a DKD humana (Brosius et al. 2009; Azushima et al. 2009; Azushima et al. 2009; Azushima et al. al. 2018). Foi demonstrado que camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina sem eNOS desenvolvem albuminúria grave, expansão mesangial, espessamento da membrana basal glomerular e hialinose arteriolar, semelhante à DKD humana (Nakagawa et al. 2007). Da mesma forma, camundongos diabéticos tipo II (db/db) sem eNOS apresentaram glomerulosclerose e albuminúria graves (Zhao et al. 2006).

TF elevado em ratos diabéticos sem eNOS

O NO inibe a formação de trombos e a agregação plaquetária (Walford e Loscalzo 2003). Como a formação de trombos glomerulares foi observada em camundongos diabéticos sem eNOS (Nakagawa et al. 2007), a expressão prejudicada de eNOS está provavelmente associada ao aumento da coagulação dependente de TF. A associação entre eNOS e TF na DKD foi abordada em nossos relatórios anteriores (Li et al. 2010; Wang et al. 2011a; Oe et al. 2016) (Fig. 2).

A redução ou falta de expressão de eNOS aumenta a atividade renal de TF em camundongos Akita diabéticos Caracterizamos a expressão de TF em camundongos Akita diabéticos (Ins2Akita/+), um modelo de DM tipo I, com vários níveis de expressão de eNOS (eNOS+/+, eNOS+/- e eNOS-/-) (Wang et al. 2011a). Descobrimos que a gravidade da DKD estava associada à redução da expressão de eNOS. A excreção urinária de albumina, a glomeruloesclerose e a redução da taxa de filtração glomerular foram exacerbadas na seguinte ordem: eNOS+/+; Ins2Akita/+ < eNOS+/-; Ins2Akita/+ < eNOS-/-; Ins2Akita/+. Curiosamente, a expressão e atividade do TF renal foram aumentadas em eNOS+/-; Ins2Akita/+ e eNOS-/-; Camundongos Ins2Akita/+ comparados com aqueles em eNOS+/+; Ratos Ins2Akita/+. A deposição de fibrina glomerular também foi notável na eNOS+/-; Ins2 Akita/+ e eNOS-/-; Ins2 Akita/+ ratos. Além disso, a expressão renal de mRNA de Tf foi correlacionada com a gravidade da doença, excreção urinária de albumina einflamatório renalexpressão de citocinas.

Dieta rica em gordura e falta de eNOS aumentam sinergicamente o TF em camundongos diabéticos

Muitos estudos demonstraram uma ligação entre obesidade e trombose (Samad e Ruf 2013). Por exemplo, a regulação positiva da via TLR4-NF-kB sob condições de doença metabólica aumenta os níveis de TF (Lv et al. 2009; Owens et al. 2012; Rogero e Calder 2018). Além disso, o palmitato de ácidos graxos saturados induz a liberação de histonas H3 através de mecanismos dependentes da via ROS e JNK e histonas extracelulares, que aumentam a expressão de TF em monócitos (Shrestha et al. 2013). Focando na relação entre coagulação, eNOS e dislipidemia, nosso estudo anterior demonstrou os efeitos combinados da deficiência de eNOS e de uma dieta rica em gordura na expressão de TF (Li et al. 2010). No estudo, camundongos sem eNOS foram tratados com doses baixas de STZ para desenvolver DM e foram alimentados com uma dieta rica em gordura. A falta de expressão da eNOS aumentou a excreção urinária de albumina e lesões histológicas, que foram ainda exacerbadas por uma dieta rica em gordura. A expressão e a atividade do TF foram aumentadas nos rins de camundongos devido à falta de expressão da eNOS e a uma dieta rica em gordura de maneira sinérgica. Curiosamente, um aumento no nível de TF imunorreativo foi demonstrado por experimentos de colocalização com um marcador glomerular de monócitos/macrófagos.

Anticorpos neutralizantes contra TF melhoram a inflamação em rins diabéticos em camundongos eNOS-Knockout

Um aumento na coagulação dependente de TF está associado ao aumento da inflamação (Witkowski et al. 2016). Inibição do sistema de coagulação dependente de TF melhoroudoenças inflamatórias, como sepse induzida por LPS (Pawlinski et al. 2010). Para elucidar a ligação causal entre inflamação e TF na DKD, examinamos o efeito de curto prazo de anticorpos neutralizantes contra TF na inflamação de rins diabéticos em camundongos deficientes em eNOS (Li et al. 2010). Os resultados mostraram que a administração de anticorpos anti-TF reduziu acentuadamente os níveis de expressão renal de genes relacionados à inflamação e fibrose, como o mRNA de Tnfa, Ccl2, Tgfb e Col4 em rins de camundongos quatro dias após a neutralização do TF.

Inibidor de coagulação FXa melhora lesão renal em ratos diabéticos sem eNOS

A coagulação do FXa, localizada a jusante do TF/VIIa, também contribui para a inflamação através da via dependente de PAR. Seu papel na DKD foi demonstrado em vários modelos animais. Sumi et al. (2011) demonstraram que o fondaparinux, um inibidor do FXa, reduziu os níveis de proteína urinária, a hipertrofia glomerular e a deposição de fibrina em camundongos db/db. O efeito terapêutico da inibição do FXa em camundongos DKD sem eNOS foi demonstrado pelo nosso grupo (Oe et al. 2016). Edoxabana (50 mg/kg/dia), um inibidor oral do FXa, foi administrada ao eNOS-/-; Camundongos Ins2Akita/+ por três meses, e os resultados mostraram melhora de lesões histológicas, como proliferação de matriz mesangial. Os níveis de expressão de genes inflamatórios nos rins foram reduzidos pela edoxabana (Tabela 1). FXa ativa PAR1 e PAR2. Para elucidar o mecanismo de lesão renal mediada por FXa, demonstramos que os efeitos antiinflamatórios dos inibidores de FXa são semelhantes aos encontrados em camundongos PAR2-/- e camundongos PAR2-/- com inibidores de FXa . Essas descobertas sugerem que o FXa provavelmente causou inflamação por meio de um mecanismo dependente de PAR na DKD. Em contraste, a edoxabana não melhorou a lesão glomerular no eNOS+/+; Camundongos Ins2Akita/+, sugerindo que o efeito terapêutico da inibição do FXa estava associado à hipercoagulabilidade dependente de eNOS em camundongos diabéticos tipo I.

Outros fatores de coagulação na DKD

Como a trombina tem como alvo o PAR1, que progride a inflamação vascular (Chen e Dorling 2009), a trombina provavelmente exacerba a DKD. No entanto, foram demonstrados os papéis protetores ou prejudiciais da trombina na patogênese da DKD; trombina em dose baixa (50 pM) preveniu, enquanto trombina em dose alta (20 nM) agravou a apoptose induzida por glicose em podócitos (Wang et al. 2011b). Os efeitos dos inibidores da trombina, como o dabigatrano, em ratos diabéticos sem eNOS, devem ser elucidados no futuro.

O fibrinogênio está envolvido em vários estados inflamatórios. Curiosamente, a redução parcial ou a ausência de fibrinogênio foi benéfica para modelos de isquemia-reperfusão renal ou fibrose renal obstrutiva (Sörensen et al. 2011; Craciun et al. 2014). Como a deposição de fibrina glomerular é aumentada em camundongos diabéticos sem eNOS (Nakagawa et al. 2007; Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), elucidar seu papel na patogênese da DKD merece mais pesquisas.

Expressão de PAR1 e PAR2 em camundongos diabéticos sem eNOS

O aumento da expressão de PARs está associado à lesão renal. Nós e outros demonstramos que os níveis de expressão de mRNA de Par1 e/ou Par2 estavam aumentados em modelos animais com nefropatia diabética, lesão renal induzida por ade nine, fibrose renal obstrutiva e lesão renal induzida por cisplatina (Chung et al. 2013; Hayashi e outros 2016; Oe e outros 2016; Watanabe e outros 2019). Além disso, os níveis de proteína PAR2 glomerular foram aumentados em camundongos db/db, um modelo de DM tipo II (Sumi et al. 2011). Demonstramos a associação entre expressão de PAR e deficiência de eNOS em camundongos diabéticos (Oe et al. 2016). O nível de expressão do mRNA de Par1 foi significativamente maior em eNOS −/−; Camundongos Ins2Akita/+ do que em eNOS −/−; Camundongos Ins2Akita/+ e não-DM. Da mesma forma, a expressão de Par2 foi significativamente maior na eNOS −/−; Camundongos Ins2Akita/+ do que em camundongos não-DM. Em contraste, os níveis de mRNA de Par4 não diferiram entre os genótipos. A falta de eNOS agrava a inflamação na DKD (Wang et al. 2011a). Como as citocinas pró-inflamatórias supostamente aumentam os PARs (Nystedt et al. 1996), a inflamação elevada causada pela falta de eNOS provavelmente induz a expressão renal de Pars na DKD. Coletivamente, os resultados de nossos estudos sugeriram que os níveis de expressão de PAR1 e PAR2, semelhantes ao caso do TF, estavam aumentados em rins diabéticos quando faltava eNOS (fig. 2).

Deleção de PAR2 melhorou lesão renal diabética em camundongos com eNOS reduzida

Nós e outros abordamos o papel do PAR2 na DKD em estudos anteriores. A deleção de Par2 não afetou a lesão glomerular em camundongos Akita diabéticos do tipo selvagem (Ins2Akita/+) com eNOS (Oe et al. 2016). Além disso, camundongos diabéticos induzidos por STZ sem PAR2 apresentaram albuminúria reduzida em comparação com camundongos diabéticos do tipo selvagem, mas aumentaram a expansão mesangial (Waasdorp et al. 2017). Coletivamente, esses resultados demonstram que não há efeitos terapêuticos leves ou inexistentes da inibição do PAR2 na lesão renal nos modelos iniciais e leves de DKD. Em contraste, demonstramos os efeitos da deficiência de PAR2 na DKD em camundongos Akita diabéticos com expressão reduzida de eNOS (eNOS+/-; Ins2Akita/+) (Oe et al. 2016). A falta de PAR2 reduziu significativamente os níveis de excreção urinária de albumina, expansão mesangial e espessura do GBM. Os níveis de expressão de genes pró-inflamatórios e relacionados à fibrose, incluindo Tnfa, Tgfb e Col4, também foram reduzidos em rins de camundongos. Esses achados sugerem que o PAR2 é patogênico não no início, mas na lesão glomerular diabética relativamente avançada causada pela deficiência de eNOS (Tabela 1).

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