Cistanche Tubulosa induz apoptose mediada por espécies reativas de oxigênio de células de câncer de cólon humanas primárias e metastáticas

ABSTRATO

O câncer de cólon é o terceiro câncer mais comum em todo o mundo. As terapias convencionais mostraram eficácia moderada com efeitos adversos graves, portanto, há uma necessidade urgente de alternativas mais seguras. Neste estudo, Cistanche tubulosa, nome local Thanoon, foi considerado como uma potencial estratégia fitoterápica devido ao seu conhecido alto potencial terapêutico na medicina tradicional e ampla abundância na região do Oriente Médio. Compostos bioativos foram extraídos de Cistanche tubulosa em pó e testados quanto às suas propriedades anticancerígenas contra quatro linhas celulares de câncer de cólon, incluindo duas derivadas do tumor primário (CaCo2 e HCT116) e duas derivadas do local metastático (LoVo e SW620).

O efeito de Cistanche tubulosa na indução de apoptose e homeostase redox celular também foi investigado. Cistanche tubulosa exibiu uma concentração e inibição dependente do tempo da proliferação de todas as linhagens celulares de câncer testadas em mais de 60 por cento após 72 horas de tratamento com 1 mg/mL de extrato bruto. A inibição da proliferação foi marcada pela indução de apoptose, produção intracelular de espécies reativas de oxigênio e superóxidos mitocondriais. Estes dados sugerem que Cistanche tubulosa é um candidato promissor para a terapia aditiva de câncer de cólon. Este é o primeiro estudo que mostra a bioatividade anticâncer de Cistanche tubulosa contra células de câncer de cólon.

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Abreviaturas:

7-AAD, 7-Amino-Actinomicina D; CTE, extrato de Cistanche tubulosa; EMEM, Meio Essencial Mínimo da Águia; FBS, soro bovino fetal; DCF, 2,7-diclorofluoresceína; DCFH-DA, 2,7- diacetato de diclorodihidrofluoresceína; DMEM, Meio Eagle Modificado por Dulbecco; DMSO, dimetilsulfóxido; MTT, 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio; PE, Ficoeritrina; RFU, unidades relativas de fluorescência; ROS, espécies reativas de oxigênio

INTRODUÇÃO

O câncer colorretal é um dos cânceres mais comuns em todo o mundo (Brenner et al., 2014), e sua incidência está aumentando constantemente com uma estimativa de 2,4 milhões de casos em 2035, devido à dieta e estilo de vida modernos, juntamente com a redução da atividade física. Os esforços atuais não são suficientes para combater a atual epidemia de câncer colorretal e, portanto, são necessárias novas abordagens para prevenção e tratamento eficazes, incluindo mudanças no estilo de vida em combinação com intervenções alternativas mais seguras, como fitoterápicos (Weidner et al., 2015). A fitoterapia, o uso de plantas medicinais para tratar doenças, tem sido uma parte inevitável da história humana antiga. As plantas medicinais têm sido utilizadas como fontes alternativas de tratamento para o câncer, representando mais de sessenta por cento dos agentes anticancerígenos usados ​​na medicina convencional (Balunas e Kinghorn, 2005; Saibu et al., 2015). Alguns dos exemplos mais conhecidos incluem extratos de Catharanthus roseus G. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) e Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg e Newman, 2005; da Rocha et al., 2001). Vários extratos de ervas e fitoquímicos demonstraram exercer efeitos antitumorais no câncer colorretal atribuídos à indução da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e apoptose associada de células cancerígenas, como no caso de extratos de Melissa officinalis (Weidner et al., 2015).

Entre os candidatos fitoterápicos, Cistanche tubulosa, uma planta parasita Orobanchaceae do deserto (Jiang et al., 2009) amplamente distribuída em regiões áridas e semiáridas da África, Ásia e região do Mediterrâneo, demonstrou ter propriedades medicinais valiosas. Cistanche tubulosa tem sido amplamente utilizada na medicina tradicional e sugere-se que tenha efeitos curativos na deficiência renal, leucorréia mórbida, metrorragia, infertilidade feminina e constipação senil (Jiang et al., 2009). Além de seus usos medicinais tradicionais, importantes medicamentos As propriedades da Cistanche Tubulosa foram intensamente estudadas durante a última década, incluindo efeitos vasorelaxantes (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotetores (Morikawa et al, 2010), anti-hiperglicêmicos e hipolipidêmicos (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa também foi sugerido como um potente potencializador do sistema imunológico, um promotor da formação óssea e um agente antienvelhecimento e antifadiga (Xu et al., 2014). Além disso, o extrato de Cistanche tubulosa demonstrou bloquear a deposição de amiloide no modelo da doença de Alzheimer (Wu et al., 2015). Apesar de seus vários usos terapêuticos, o efeito da Cistanche Tubulosa como potencial agente anticancerígeno ainda não foi estudado.

No presente trabalho, investigamos o efeito anticâncer de Cistanche Tubulosa em duas linhas celulares de câncer de cólon primário e duas metastáticas e os mecanismos potenciais subjacentes a esse efeito.

MATERIAIS E MÉTODOS

Coleta e preparação do extrato da planta, as amostras de Cistanche tubulosa foram coletadas de uma área desértica no Catar em 2014 e a autenticidade da planta foi confirmada por um herbologista. As amostras de comprovantes são arquivadas no Departamento de Toxicologia e Multiuso da ADLQ. As amostras de plantas secas ao sol foram moídas com Retsch Knife Mill Grindomix GM300 em pó fino. Vinte gramas de pó foram extraídos com 200 mL de água ultrapura durante a noite a 37 graus em um agitador rotativo a 200 rpm. Os extratos brutos de Cistanche tubulosa (CTE) foram centrifugados por 30 min a 8000 rpm para peletizar os compostos não solúveis, o sobrenadante coletado e liofilizado usando o secador Labconco Freezone 6 plus Freeze. O extrato seco foi reconstituído em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, SIGMA, Alemanha) a uma concentração de 20 mg/mL e filtrado estéril através de um filtro de membrana de 0,2-mícron.

Linhas celulares e manutenção celular

As linhagens celulares de carcinoma de cólon humano CaCo2, SW620 e LoVo foram obtidas do Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Alemanha), enquanto a linha celular HCT 116 foi um presente gentil do Departamento de Ciências Biológicas e Ambientais da Qatar University. CaCo2 e HCT11 foram derivados do local primário do carcinoma de cólon, enquanto SW620 e LoVo foram derivados do local metastático. As células SW620, HCT116 e LoVo foram cultivadas e mantidas em meio DME enquanto as células CaCo2 foram mantidas em meio essencial mínimo de Eagle (EMEM, SIGMA, Alemanha). As células foram cultivadas em monocamada a 37 graus no respectivo meio suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal (FBS, SIGMA, Alemanha) e 1 por cento de penicilina/estreptomicina (SIGMA, Alemanha) em uma atmosfera umidificada contendo 5 por cento de dióxido de carbono.

Ensaio de viabilidade celular

O ensaio {{0}}[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi usado para avaliar a atividade citotóxica de CTE semelhante ao descrito anteriormente (Jaganjac et al., 2010). A densidade de semeadura de células CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo cultivadas em 96-placas de poços foi de 104 células por poço. As células foram semeadas no respectivo meio suplementado com 10% de FBS 24 horas antes do tratamento. Após 24 horas, o meio foi removido e as células foram tratadas com 0, 0,25, 0,5, 1 e 2 mg/mL de CTE por 24, 48 e 72 horas a 37 graus em uma atmosfera umidificada contendo 5 por cento de CO2. Após o tratamento CTE, o meio foi removido e 40 µL de solução de MTT (0,5 mg/mL) foram adicionados a cada poço.

Após 3 h de incubação, a solução de MTT foi removida, o produto formazano dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO, SIGMA, Alemanha) e a absorbância foi medida em 590 nm com um leitor de microplacas (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Suíça). .

Ensaio de apoptose

A apoptose em células CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo foi detectada usando o Kit I de Detecção de Apoptose de Anexina V PE com 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD) como um corante vital (Becton Dickinson International, Bélgica) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em 24-placas de poços a uma densidade de 5 × 104 células/poço em um respectivo meio suplementado com 10% de FBS por 24 h antes da adição de CTE (0, 0,5 , ou 1 mg/mL). Após a incubação de 24 CTE, as células foram colhidas, lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato fria e coradas com anexina V de ficoeritrina (PE) e 7-AAD por 15 min em temperatura ambiente no escuro. As células coradas foram analisadas em 1 hora por citometria de fluxo usando FACS. Citômetro de fluxo Aria III e software FACSDiva (Becton Dickinson) a uma taxa de fluxo baixa com um mínimo de 104 células. O tratamento das células durante 4 horas com camptotecina 6 µM (SIGMA) foi utilizado como controlo positivo para o ensaio.

Produção intracelular de ROS

A produção intracelular de ROS foi examinada usando 2,7- diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA, SIGMA, Alemanha). DCFH-DA é uma sonda não fluorescente, que é oxidada com ROS intracelular para o composto fluorescente 2,7- diclorofluoresceína (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). O ensaio DCFHDA foi realizado de forma semelhante à descrita anteriormente (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Resumidamente, a densidade de semeadura de células CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo cultivadas em 96-placas pretas de poço foi de 104 células por poço. As células foram semeadas no respectivo meio suplementado com 10% de FBS por 24 horas.

Antes do tratamento, as células foram incubadas com 10 µM de DCFH-DA a 37 graus por 30 min em 5 por cento de CO2/95 por cento de ar. As células foram então lavadas etratados com {{0}}, 0,5 e 1 mg/mL de CTE no meio sem vermelho de fenol. A formação intracelular de ROS foi monitorada continuamente ao longo de 25 horas a 37 graus e 5 por cento de CO2 usando um leitor de microplacas com fluorescência superior e módulo de controle de gás (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Suíça). A intensidade da fluorescência foi medida com um comprimento de onda de excitação de 500 nm e detecção de emissão em 529 nm. As unidades arbitrárias, unidades relativas de fluorescência (RFU), foram baseadas diretamente na intensidade de fluorescência

Geração de superóxido mitocondrial

A capacidade do CTE de induzir a geração de superóxido pelas mitocôndrias foi estimada usando uma sonda MitoSOX Red permeável às mitocôndrias (Life Technologies) e Hoechst 33342 para coloração nuclear (Life Technologies). Células CaCo2, HCT116, SW620 e LoVo foram semeadas em 96-placas de poços a uma densidade de 104 células por poço em um respectivo meio suplementado com 10% de FBS por 24 horas . As células foram então carregadas com 4 µM de MitoSOX e 2 µM de Hoechst 33342 por 20 min, excesso de corante lavado e poços tratados com 0, 0,5 e 1 mg/mL de CTE por 24 horas a 37 graus e 5 por cento de CO2. A intensidade da fluorescência foi medida com um comprimento de onda de excitação de 510 nm e detecção de emissão em 580 nm para MitoSOX e um comprimento de onda de excitação de 350 nm e detecção de emissão em 461 nm para Hoechst 33342 usando um leitor de microplacas com fluorescência superior (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Suíça)

Análise estatística

As estatísticas descritivas foram apresentadas como a média mais /- DP. A significância das diferenças entre os grupos foi avaliada por meio do teste t de Student e do qui-quadrado. Quando mais de dois grupos foram comparados, usamos ANOVA unilateral com teste post hoc apropriado. Foi utilizado o SPSS 11.01 para Mircosoft Windows. Diferenças com P menor que 0,05 foram consideradas estatisticamente significativas.

RESULTADOS

O efeito de CTE na proliferação de linhagens de células de câncer de cólon humano é mostrado na Figura 1. Todas as concentrações de CTE testadas mostraram um forte efeito inibitório na linhagem de células CaCo2 de uma maneira dependente da concentração e do tempo (Figura 1A). Setenta e duas horas de tratamento com CTE inibiram o crescimento de células CaCo2 em mais de 60 por cento em comparação com o controle (p < 0,05 para todas as concentrações). O impacto significativo do tratamento com CTE no crescimento de células HCT116 também foi detectado em todos os momentos nas duas concentrações mais altas (1 mg/mL e 2 mg/mL), atingindo redução superior a 70 por cento em uma última concentração (Figura 1B, p < 0,05).

Embora as duas concentrações mais baixas de CTE ({{0}}.25 e 0,5 mg/mL) tenham reduzido significativamente o crescimento de células HCT116 após 24 horas (p<0.05), 72="" they="" had="" no="" significant="" effect="" following="" hours="" of="" treatment="" compared="" to="" the="" control="" p="">{{0}}.{{10}}5). A inibição da proliferação dependente do tempo e da concentração com CTE foi ainda confirmada em células LoVo em mais de 60 por cento na concentração mais alta (p <0.05) (Figura 1C) , e todas as quatro concentrações de CTE testadas reduziram o crescimento de células SW620 após 48 horas (Figura 1D, p < 00,05 para todos). Após 72 horas de tratamento, o mesmo efeito foi observado apenas para as duas maiores concentrações (p < 0,05), enquanto as concentrações de 0,25 e 0,5 mg/mL não apresentaram efeito significativo em relação ao controle (p > 0,05). O impacto do tratamento de 0,5 e 1 mg/mL de CTE na indução de apoptose foi testado adicionalmente em todas as quatro linhagens de células (Figura 2). Um aumento no número de células em apoptose precoce foi detectado em HCT116 e LoVo após 24 horas de tratamento com 0,5 mg/mL (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D).

A capacidade do CTE de induzir a produção intracelular de ROS é demonstrada na Figura 3. Três horas após o tratamento com CTE, houve um forte aumento na produção intracelular de ROS em todas as linhagens celulares (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24 hours of treatment with 1 mg/mL of CTE.

Figura 1:

Efeito de Cistanche tubulosa na viabilidade de linhagens celulares de câncer de cólon. A viabilidade celular medida pelo ensaio MTT de células (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 é apresentada como uma porcentagem da linha celular de controle de câncer de cólon não tratada. Os valores médios (±DP) para 5 réplicas do experimento representativo são dados: (*) significância p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Figura 2:

Extrato de água Cistanche tubulosa induz apoptose em células de câncer de cólon humano. As análises de citometria de fluxo de anexina-V-FITC de células (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 são apresentadas como uma porcentagem da linha celular de controle de câncer de cólon não tratada. Os valores médios (±DP) para 3 réplicas do experimento representativo são dados: (*) significância p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Figura 3:

O extrato aquoso de Cistanche tubulosa induz a produção intracelular de ROS de forma dependente do tempo e da dose. A produção de ROS medida pelo ensaio DCFH-DA em células (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 é apresentada como valores médios de RFU (±SD) para as respectivas 5-réplicas de um experimento representativo. (*) Significado p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

Figura 4:

O extrato de água Cistanche tubulosa induz a produção de superóxido mitocondrial em células de câncer de cólon humano. A intensidade de fluorescência da sonda MitoSOX Red direcionada à mitocôndria em células A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo e (D) SW620 é apresentada como uma porcentagem da linha celular de controle de câncer de cólon não tratada. Os valores médios (±DP) para 5 réplicas do experimento representativo são dados: (*) significância p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISCUSSÃO

Embora estudos anteriores tenham relatado inúmeras propriedades medicinais da Cistanche tubulosa, este é o primeiro relato de seu efeito antiproliferativo em células malignas. Os compostos bioativos da Cistanche tubulosa extraídos com água, um solvente altamente polar, mostraram forte bioatividade anticancerígena. Anteriormente, comparamos a eficiência de Cistanche tubulosa solubilizada na água com outros solventes, como metanol e acetato de etila, mas os extratos aquosos exibiram as atividades anticancerígenas mais promissoras (dados não mostrados).

Demonstramos a capacidade do CTE a 1 mg/mL e 2 mg/mL de inibir 60% do crescimento de linhas celulares de câncer de cólon primário e metastático, revelando um papel potencialmente importante de Cistanche tubulosa como tratamento de câncer de cólon. Em comparação com as células normais, as células cancerígenas são geralmente caracterizadas por um distúrbio na homeostase redox e uma estratégia comum das terapias anticancerígenas atuais é aumentar o estresse oxidativo celular (Yang et al, 2013). Embora níveis fisiologicamente baixos de ROS tenham um papel importante como moléculas de sinalização, a produção excessiva de ROS pode contribuir para a instabilidade e malignidade do câncer (Liou e Storz, 2010). Paradoxalmente, esse desequilíbrio na homeostase redox celular torna as células cancerígenas mais vulneráveis ​​à morte celular induzida por ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira e Hay, 2013). O efeito antiproliferativo do CTE relatado neste estudo pode ser mediado por vários mecanismos extra e intracelulares de compostos conhecidos e desconhecidos dentro do extrato, visando múltiplas vias que desempenham papéis essenciais na apoptose. Para diferenciar entre diferentes modos de morte celular, investigamos o mecanismo potencial responsável pela citotoxicidade induzida por CTE observada

Nossos dados indicam que o CTE aumenta a produção intracelular de ROS e, consequentemente, a morte celular induzida por ERO. O estado Redox da célula também desempenha um papel crucial na regulação da apoptose e a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial é um dos principais locais de geração de ROS celular (Trachootham et al., 2008). Além disso, as ROS intracelulares podem causar apoptose celular por vias dependentes e independentes de mitocôndrias (Sinha et al., 2013). De fato, nossos dados também indicam que a externalização de fosfatidilserina induzida por CTE é um efeito comum na apoptose, tanto em linhas celulares de câncer primário quanto metastático, sugerindo que o mecanismo de morte induzida por CTE é mediado por apoptose em vez de necrose. A ativação da apoptose nas células cancerígenas é uma estratégia corretiva e muitas drogas anticancerígenas podem exercer efeitos apoptóticos nas células cancerígenas.

Compostos ou extratos com atividades pró-apoptóticas em células cancerígenas são, portanto, potencialmente úteis na pesquisa de drogas anticancerígenas (Wong, 2011). Para determinar se o efeito pró-apoptótico induzido por CTE é mediado pelo mecanismo ROS induzido por mitocôndrias, medimos a produção de superóxido usando uma sonda fluorescente direcionada à mitocôndria em células tratadas com CTE. Nossos dados mostram claramente que o CTE estimula a produção de superóxido mitocondrial, sugerindo que a atividade anticancerígena de Cistanche tubulosa é, pelo menos em parte, mediada pelo mecanismo de ROS induzido por mitocôndrias.

CONCLUSÕES

Em conclusão, nossos dados sugerem que o extrato aquoso da planta do deserto Cistanche tubulosa pode representar um candidato promissor para uma abordagem anticancerígena em combinação com outras terapias convencionais para a prevenção e tratamento do câncer de cólon. Também demonstramos que a toxicidade do extrato da planta contra células cancerígenas é mediada pelo aumento da produção intracelular de ROS e, pelo menos em parte, pela apoptose dependente da mitocôndria. Mais estudos estão em andamento para isolar e caracterizar os constituintes biologicamente ativos individuais responsáveis ​​pela atividade anticancerígena.

Mais pesquisas são necessárias para avaliar o uso potencial deste extrato como um agente quimiopreventivo eficaz e para entender os mecanismos de ação em células de câncer de cólon em nível molecular. Mais estudos pré-clínicos e clínicos também são necessários para confirmar os efeitos benéficos à saúde observados de Cistanche tubulosa para a prevenção do câncer.

RECONHECIMENTOS

Apoio financeiro e patrocínio: Este estudo foi financiado pelo Anti-Doping Lab Qatar.

Conflito de interesses: Os autores declaram não haver conflito de interesses.

REFERÊNCIAS

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